Name: 3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: 学ぶ 3Dバイオプリンティングを用いた心臓組織の創出法。細胞のみを使用しバイオマテリアルなしでスフェロイドを機械的に統合し、心臓組織再生と疾患モデルへの応用可能性を示します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、心臓血管研究のための基金基金とメリーランド幹細胞研究基金（2016-MSCRFI-2735）という資金源を認めています。

1.心筋細胞の調製<ol><li>記載されているように、基底膜マトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上で、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）を生成および培養する。10 。 </li><li>以前に記載された方法11,12を用いてhiPSCをhiPSC由来心筋細胞（hiPSC-CM）に分化させる。 </li><li>分化後19日目に、室温で5分間、各ウェルで2mLのトリプシン/ EDTA 0.05％を用いて心筋細胞を単離する。 </li><li>心筋細胞を光学顕微鏡下でモニターし、細胞の解離を観察する。 </li><li> 2mLのトリプシンインヒビター0.0125％を用いてトリプシンを中和する。 </li><li>単離された心筋細胞をプールし、モーター付きピペットフィラーを使用して1つの50mLコニカルチューブに移す。 </li><li>室温で250xgで5分間細胞懸濁液を遠心分離してペレットを得る。 </li><li>ペレットをロズウェルパーク5mLに再懸濁するB-27（RPMI / B-27細胞培地）を補充したMemorial Institute（RPMI）細胞培地。 </li><li>細胞培地に20μLの細胞をピペットで入れ、同量の0.4％Trypan Blue溶液で染色します。 </li><li>自動細胞計数器または手動血球計算器を使用して、細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得る。 </li></ol>繊維芽細胞の調製<ol><li>ヒト心臓線維芽細胞（HCF）（成人心室型）細胞系を開始する。 </li><li>継代し、HCF培養プロトコールに従ってそれらを単離する。 </li><li>細胞培地中の20μLの細胞をピペットで等量のTrypan Blue溶液0.4％で染色する。 </li><li>新しい細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得るために、自動細胞カウンターまたは手動血球計算機を使用する。 </li></ol> 3.内皮細胞の調製<ol><li>人間のumbを開始する記載されているように、静脈内皮細胞（HUVEC）系統14 。 HUVEC培養プロトコールに従い、それらを単離する（ 14） 。 </li><li>細胞培地に20μLの細胞をピペットで入れ、同量の0.4％Trypan Blue溶液で染色します。 </li><li>自動細胞計数器または手動血球計算器を使用して、細胞懸濁液の濃度および細胞生存率を数え、得る。 </li></ol> 4.共培養： <ol><li> RPMI / B-27細胞培地中で3種類の細胞型（hiPSC-CM、HCF、およびHUVEC）を混合して、hiPSC-CM：HCF：HUVEC細胞比50mLコニカルチューブに混合細胞溶液のストックを生成する。 70:15:15およびmL当たり165,000細胞の濃度。 </li><li>混合細胞溶液を、マルチチャネルピペットを使用してウェル当たり200μLまたは1ウェルあたり33,000細胞の超低付着96ウェルU底プレートに分配する。 </li><li> 96ウェルプレートを3日間インキュベートする（37℃、5％の炭素二酸化炭素湿度95％）。 </li><li>光学顕微鏡下で個々のウェルの中央と底に混合細胞多細胞スフェロイドの存在を検査する。 注：2次元の顕微鏡投影では、これらの回転楕円体は円形に見えます （ 図1 ）。スフェロイドは、細胞播種後、24時間以内に極低温付着96ウェルプレートに形成されるべきである。スフェロイドは96ウェルプレートに細胞を播種した後、48時間以内に鼓動を開始するはずです。鼓動していないスフェロイドは、最終的な3Dバイオプリントされた心臓パッチが機能することを保証するために3Dバイオプリントに使用すべきではありません。コネキシン43（Cx43）およびトロポニンのスフェロイド免疫蛍光法を用いて、球状細胞の組成と品質を評価することができます15 。 </li></ol> 5.足場のない心臓組織の3Dバイオプリント<ol><li>スフェロイドを含むプレートを、足場のない回転楕円体ベースの3Dバイオプリンタのマガジンにロードします。 </li><li> 3Dバイオプリンタの電源を入れ、3Dバイオプリントソフトウェアを実行します。 <ol><li> 「補助」、「操作準備」、「検査モード」、「原点復帰」の順にクリックします。 </li><li> 「スタート」の下にある緑色のアイコンをクリックして回転楕円体検査を開始します。 </li><li>画面上の &quot;（2）Dia（μm）&quot;欄の下に回転楕円体の直径が表示されていることを確認します。 </li></ol></li><li>平均回転楕円体の直径を100μmに近づけるには、「初期設定」をクリックし、平均回転楕円体直径をStack Zピッチ（μm）に入力します。 </li><li> 「合計」をクリックすると、「レイヤー」の下の数字が自動的に再調整されます。 [適用]をクリックして設定を確定します。 </li><li> 「ニードルアレイマップ」をクリックし、「レイヤー番号」に移動して、3Dバイオプリント用に必要なレイヤーを選択し、個々の回転楕円体の位置を選択して、画面の左側のマップに目的の3Dバイオプリントデザインを描画します。 Click「適用」をクリックして3Dバイオプリントデザインを確認します。 </li><li> 「ニードルアレイチェック」をクリックしてニードルアレイ検査を開始します。ニードルアレイにピントが合っていない場合は、0〜500μmの範囲の値を &quot;OffsetZ（μm）&quot;に入力して、500μmから100μmまで減少するようにカメラのフォーカスを調整します。 </li><li> 「検査パラメータ」、「タイプ1」をクリックし、「直径（μm）」を希望の直径範囲に設定します。 「真円度（％）」と「平滑度（％）」を希望のパーセンテージに設定します。 [適用]をクリックして設定を確定します。 注：ここで回転楕円体の直径は450μm〜550μmに設定されています。 「真円度（％）」および「滑らかさ（％）」は、個々の回転楕円体のコンピュータ計算による評価です。ここでは、「真円度（％）」は60％、「平滑度（％）」は70％です。 </li><li> 「存在」をクリックし、「直径（μm）」を同じ設定に更新します前の手順では、 [適用]をクリックして設定を確定します。 </li><li> 「Stack Mode」をクリックし、「Start」の下にある緑色のアイコンをクリックして、3Dバイオプリンタのノズルを真空吸引し、針アレイの特定の位置にスフェロイドを配置して、回転楕円体のピックアップを開始します。 注：81個の回転楕円体（9個の回転楕円体と9個の回転楕円体）からなる心臓パッチの場合、3Dバイオプリントには約20〜30分かかります。 </li><li>バイオプリント後、滅菌ピンセットを使用して、3Dバイオプリントパッチを含む針アレイをピックアップし、150mLのRPMI / B-27細胞培地を含む250mL滅菌ビーカーに移す。 </li><li> 3日間（37℃、5％二酸化炭素、95％湿度）、3Dバイオプリントパッチを針アレイとインキュベートする。 </li></ol> 6.ニードルアレイからの3D Bioprintedパッチの除去とパッチ成熟<ol><li> 3日間のインキュベーションの後、一方の手は針アレイの基部に、他方のものはプラスチックカバー上のt貼付し、プラスチック製のカバーを静かにスライドさせて、3Dバイオプリントパッチをニードルアレイから外す。 注意：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）による潤滑は、必要に応じて、このステップの直前のニードルに適用して、スムーズで簡単に取り外すことができます。 </li><li>一対の無菌鉗子を使用して、その上に3Dバイオプリントパッチを入れたプラスチックカバーをピックアップし、パッチとプラスチックカバーをRPMI / B-27細胞培地を含む35mmディッシュに移す。 </li><li>ピンセットをプラスチックカバーに固定した状態で、RPMI / B-27細胞培地のパッチでプラスチックカバーを静かに振って、パッチを培地に放出させます。 </li><li> 3Dバイオプリントされたパッチが光学的に検査され、3Dバイオプリントされたパッチが機能しているかどうかを確認しているかどうかを視覚化する。 </li><li> 3日以上（37℃、5％二酸化炭素、95％湿度）、35mmディッシュ内の3Dバイオプリントパッチをインキュベートする。 注：3日後、回転楕円体が融合し、針があったパッチはもはや見えなくなるはずです。 </li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+biofabrication+strategies+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).</li>
<li>Patra, S., Young, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+3D+Printing+Techniques+and+the+Future+in+Biofabrication+of+Bioprinted+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophy%22%5BJournal%5D)">A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue.</a> Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2017).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment%2C+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomater. 31, 461-466 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomater. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-Free+Tubular+Tissues+Created+by+a+Bio-3D+Printer+Undergo+Remodeling+and+Endothelialization+when+Implanted+in+Rat+Aortae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae.</a> PloS One. 10, e0136681(2015).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+excitation-contraction+coupling+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+ventricular+cardiomyocytes+revealed+by+Ca2%2B+spark+characteristics%3A+direct+evidence+of+functional+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release.</a> Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Surface+N-Glycoproteome+Resource+Reveals+Markers%2C+Extracellular+Epitopes%2C+and+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets.</a> Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).</li>
<li>ScienCell Research Laboratories. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Cardiac+Fibroblasts+%28adult+ventricular%29+Product+Sheet%22">Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf ">https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf </a> (2017).</li>
<li>Lonza Walkersville, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Endothelial+Cell+Systems+-+Technical+Information+%26+Instructions.%2C%22">Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf ">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf </a> (2015).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunofluorescence+Method+for+IHC+Detection%22">Immunofluorescence Method for IHC Detection</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html ">https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html </a> (2017).</li>
<li>Murata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+of+osteochondral+regeneration+using+a+scaffold-free+three-dimensional+construct+of+porcine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Surg Res. 10, (2015).</li>
<li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomed Mater. 10, 034002(2015).</li>
<li>Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+Bioprinting+Three-Dimensional+Biohybrid+Systems+for+Future+Regenerative+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+Part+B%2C+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies.</a> J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).</li>
<li>Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+in+cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+J+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review.</a> International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

3Dバイオプリンティングには、鼓動する機能性スフェロイドを使用することが重要です。スフェロイドが鼓動しない場合、スフェロイドを使用し続けると、常に機能しない 3D バイオプリント パッチになります。
このアプローチの利点の1つは、細胞の総数と、スフェロイド内の心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の割合を変化させることにより、パッチの細胞含有量を操作できることです。これにより、さまざまな組織学的および機械的特性を持つさまざまなタイプの心臓パッチを印刷できます。
このアプローチにより、さまざまな種類のスフェロイドを使用してパッチを作成したり、複雑な 3D デザインの心臓パッチの 3D バイオプリンティングも可能になります。最終的な3Dコンストラクトのこの複雑さは、正確なスフェロイド位置決めによる3Dバイオプリンティングによって達成可能であるが、浮遊スフェロイド7 の穏やかな回転、またはスフェロイドを円筒形の3Dコンストラクト16に単純に...

3Dバイオプリント1,2,3の方法にはさまざまなものがあります。 3Dバイオプリントは、インクジェットバイオプリンティング、マイクロ押出バイオプリント、レーザーアシストバイオプリント、方法の組み合わせ、またはより新しいアプローチなどの例を用いて、印刷技術1によって分類されることが多い。 3Dバイオプリントは、スキャフォールドフリーまたはスキャフォールド依存法に分類することもできます4 。 3Dバイオプリントのほとんどの方法は、生体材料、 例えばバイオインキ5または足場6が必要な足場依存性である。しかしながら、足場依存性3Dバイオプリンティングは、足場材料の免疫原性、独自のバイオインキのコスト、分解産物の遅い速度および毒性など、多くの問題および限界に直面している4,7。 Scafスフェロイドを用いた無折返し心臓組織工学が試​​みられており、足場依存性組織工学のこれらの欠点を克服する可能性がある。しかし、この論文の著者が認めたように、生物工学の過程で、固定された場所でスフェロイドをしっかりと取り扱い、配置することは困難でした。 3Dバイオプリントと回転楕円体ベースの組織工学の併用は、これらの困難を克服する可能性を秘めています。このプロトコールでは、スフェロイドの形態の細胞のみを用いて、他の生体材料を用いずに心臓組織の3Dバイオプリントを説明する。 足場のない回転楕円体ベースの3Dバイオプリンタ9は、真空吸引を使用して個々の回転楕円体をピックアップし、それらを針アレイ上に配置する能力を有する。 3次元バイオプリンティングにおける針アレイ上のスフェロイドの位置づけの概念は、古代ジャパ（ Japa ）においてニードルアレイ（「 ケンザン （ kenzan ）」として知られている）花の配置、 生け花の nese芸術。このシステムは、スフェロイドを任意の構成に正確に配置することを可能にし、個々のスフェロイドを短時間で融合させて、3Dバイオプリント組織を作製する。したがって、この方法は、スフェロイドを容易に操作することを可能にし、足場を用いない器官のバイオファブリケーションの将来への潜在的な影響をもたらす。

<table><tbody><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>A1413202</tr><tr><td>トリプシン/EDTA 0.05%</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>特定トリプシン阻害剤 0.0125%サー</td><td>モフィッシャー</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 細胞培地</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>RPMI に B27 を添加すると HIPSC-CM 培地に構成</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td>RPMI に B27 を添加すると HIPSC-CM に構成培養培地</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>ヒト心臓線維芽細胞(成人心室型)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSurface 超低アタッチメント 96ウェルU底プレート&nbsp;</td><td>秋田住友ベークライト(株)</td><td>MS-9096UZ</td><td></td></tr><tr><td>Regenova Bio 3Dプリンター</td><td>Cyfuse Biomedical(株)</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>www.cyfusebio.com/en/ トリパン ブルー 溶液、0.4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Troponin T 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>701620</td><td></td></tr><tr><td>Connexin 43 (Cx43) Chemicon</td><td></td><td>MAB3068</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr></tbody></table>

3d bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

このプロトコルは、細胞のみを使用して、生体材料を使用せずに心臓組織の3Dバイオプリントを記述する。心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞を最初に単離し、計数し、所望の細胞比で混合する。それらは、超低付着96ウェルプレート中の個々のウェルで共培養される。 3日以内にスフェロイドが鼓動する。これらの回転楕円体は、真空吸引を使用してノズルによってピックアップされ、3Dバイオプリンタを使用してニードルアレイ上に組み立てられる。スフェロイドは、次に、針アレイ上で融合することが可能となる。 3次元バイオプリンティングの3日後、スフェロイドは、すでに自発的に鼓動している無傷のパッチとして除去される。 3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素スフェロイドの機械的統合を示し、心臓組織の再生および心臓病の3Dモデルとして非常に有望である。

ステップ4.4（共培養）の終わりに、各ウェルの細胞は、超低付着96ウェルU底プレートの底に凝集して、重力によってスフェロイドを形成するはずである。これらのスフェロイドにはhiPSC-CM、HCFs、HUVECが含まれており、光学顕微鏡下で視覚的に検査することができ、2次元投影で円形に見えるはずです（ 図1 ）。ステップ6.3の終わりに、3Dバイオプリントされた心臓パッチは、ニードルアレイによって形成されたニードルホールのために、組織ボイドを含むべきである（ 図2 、左）。この時点で、スフェロイド間の境界は不明瞭になり、パッチは自発的に拍動し始め、スフェロイドの機械的統合を示していたはずです。ステップ6.5の終わりに、組織の空隙は周囲の組織によって埋められるべきであり（ 図2 、右）、3Dバイオプリントされた心臓パッチは継続しなければならない自発的に<p class="jove_conte...

このプロトコルは、生体材料を使用せずに心臓組織の3Dバイオプリントを記述する。 3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素スフェロイドの機械的統合を示し、心臓組織の再生および心臓病の3Dモデルとして非常に有望である。

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

このビデオの目的は、バイオマテリアルを使用せず、細胞のみを用いて心臓組織の3Dバイオプリントを行う方法を実演することです。まず、心筋細胞、血管内皮細胞、および線維芽細胞を単離し、計数した後、目的の細胞比率で混合します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、超低接着96ウェルプレートの各ウェルに分注します。96ウェルプレート内の細胞を3日間インキュベートすると、自発的に拍動するスフェロイドが形成されます。共焦点顕微鏡観察により、スフェロイド内で遠赤色に蛍光ラベルされたTroponin T陽性心筋細胞において、緑色に蛍光ラベルされたconnectin 43の発現が確認されます。その後、スフェロイドを含む96ウェルプレートを3Dバイオプリンターにロードします。3Dバイオプリンターは、まず移動プラットフォームを用いて96ウェルプレートをニードルアレイのすぐ隣の位置に転送します。次に、3Dバイオプリンターは96ウェルプレート内のすべてのスフェロイドを検査し、各スフェロイドの直径や形状などの関連データを取得します。これは3Dバイオプリンティングプロセスの拡大図です。左側の96ウェルプレートから、ノズルが真空吸引を用いてスフェロイドをピックアップし、右側のニードルアレイの特定の位置に配置します。この工程を、3Dバイオプリンティングプロセスが完了するまで繰り返します。すべてのスフェロイドと96ウェルプレートのバイオプリンティングが完了すると、3Dバイオプリンターは可動プラットフォームを使用して、現在の96ウェルプレートを保管し、新しいプレートをロードします。これは、9×9のパッチの3Dバイオプリンティングを俯瞰で捉えた100倍速のタイムラプス動画です。ニードルアレイのニードルはグループ状に配置されており、各ニードルに上からスフェロイドがロードされます。無菌条件下で3日間経過した後、ニードルアレイの下にある硬質プラスチック片をパッチの下でゆっくりと上にスライドさせ、3Dバイオプリンターで作成した心筋パッチを非常に慎重にニードルアレイから取り出します。この工程において、よりスムーズかつ容易に取り出すために、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）による潤滑をニードルに適用することがあります。3Dバイオプリントされた心筋パッチは、ニードルアレイから取り出した直後は非常に脆弱であるため、損傷させないよう細心の注意を払う必要があります。その後、3Dバイオプリントされた心筋パッチを、適切な細胞培地を含む35 mmの組織培養ディッシュに移します。ニードルアレイから取り出した直後、パッチはすでに拍動しており、拍動ごとにニードルの穴の大きさが変化していることが確認できます。3Dバイオプリントされた心筋パッチを成熟させ、その間にニードルアレイによって生じた組織の空隙を周囲の組織で充填させます。3Dバイオプリントされた心筋パッチは、そのまま自発的に拍動し続けます。結論として、バイオマテリアルを使用せずに心筋組織を3Dバイオプリントすることは可能であることが示されました。3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素であるスフェロイドの機械的な統合を示します。心臓組織の3Dバイオプリンティングは、心臓組織の再生などの有望な臨床応用、心臓組織の3Dモデルの構築、予測薬理学および毒性学における再現、ならびに細胞およびゲノム指向療法の開発に寄与します。

creation-cardiac-tissue-exhibiting-mechanical-integration-spheroids

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

我々 は、二次電池の種類がさらに血管柄付き組織とオルガノイドを生成するには、このを用いた構造の間質性スペースに播種できるを用いた血管床をエンジニア...

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。...

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

このプロトコルは、心不全をモデル化する梗塞マウスの心外膜に3Dバイオプリントパッチを移植することを目的としている。麻酔、手術胸部開口部、左前下降(LAD)冠動脈の永久結紮、心臓の梗塞領域へのバイオプリントパッチの適用に関する詳細が含まれています。...

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

このプロトコルは、吊り下げ低下中の細胞を共培養することによって3D心臓スフェロイド(CD)を製造することを目的としています。コラーゲン埋め込みCDは、心不全をモデル化するために生理学的濃度でドキソルビシン(DOX、心毒性剤)で治療される。DOX治療のCDを用いたインビトロ検査は、心不全患者に対する新規治療法を同定するために用いることができる。...

ヒト心臓病態生理学を研究するインビトロバイオエンジニアリング心臓組織としての心臓スフェロイド

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。...

3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro...

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぶ 3Dバイオプリンティングを用いた心臓組織の創出法。細胞のみを使用しバイオマテリアルなしでスフェロイドを機械的に統合し、心臓組織再生と疾患モデルへの応用可能性を示します。

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

さらに動画を探す