3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出
2017年7月2日
このプロトコルは、生体材料を使用せずに心臓組織の3Dバイオプリントを記述する。 3Dバイオプリントされた心臓パッチは、構成要素スフェロイドの機械的統合を示し、心臓組織の再生および心臓病の3Dモデルとして非常に有望である。
このビデオの目的は、生体材料を使用せずに、細胞のみを使用して心臓組織の3Dバイオプリンティングをデモンストレーションすることです。まず、心筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞を単離し、カウントし、所望の細胞比率で混合します。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェルプレートで個々のウェルに分配されます。
96ウェルプレートの細胞を3日間インキュベートし、3日後には自発的に拍動するスフェロイドを形成します。共焦点顕微鏡法では、43の結合の発現が明らかになり、トロポニンT陽性心筋細胞では緑色に蛍光標識され、回転楕円体内では蛍光標識が緑色に標識されています。次に、スフェロイドを含む96ウェルプレートを3Dバイオプリンターにロードします。
3Dバイオプリンターは、移動プラットフォームを使用して96ウェルプレートをニードルアレイのすぐ横の場所に移すことから始まります。次に、3Dバイオプリンターは、96ウェルプレート内のすべてのスフェロイドを検査して、直径や形状など、各スフェロイドに関する関連データを取得します。これは、3Dバイオプリンティングのプロセスをクローズアップしたものです。
スフェロイドは、真空吸引を使用して左側の96ウェルプレートからノズルでピックアップされ、右側のニードルアレイ内の特定の位置に配置されます。このプロセスは、3Dバイオプリンティングプロセスが完了するまで繰り返されます。すべてのスフェロイドと96ウェルプレートがバイオプリントされるまで、3Dバイオプリンターは既存の96ウェルプレートを保存し、移動プラットフォームを使用して新しいプレートをロードします。
これは、9×9のパッチを100倍の速度で3Dバイオプリンティングし、針配列内の針をグループ状に配置し、スフェロイドを上から各針にロードする様子を上空から撮影したタイムラプス動画です。無菌条件下で3日後、3Dバイオプリンターの心臓パッチは、パッチの下の針アレイ内の硬質プラスチック片を上向きにゆっくりとスライドさせることにより、針アレイから非常に慎重に除去されます。リン酸塩緩衝生理食塩水またはPBSによる潤滑は、必要に応じてこのステップ中に針に適用され、よりスムーズで簡単に除去できます。
3Dバイオプリントされた心臓パッチは、針配列から取り外した直後は非常に壊れやすいため、損傷を与えないように十分な注意を払う必要があります。次に、3Dバイオプリントされた心臓パッチを、適切な細胞培地を含む35mm組織培養皿に移します。ニードルアレイから取り外した直後に、パッチはすでに鼓動しており、針穴のサイズは拍動ごとに変化します。
3Dバイオプリントされた心臓パッチは成熟させられ、その間、針の配列によって引き起こされた組織の空隙は周囲の組織によって埋められます。3Dバイオプリンティング心臓パッチは、自発的に鼓動し続けます。結論として、生体材料を使用せずに心臓組織を3Dバイオプリントすることは可能です。
3Dバイオプリントされた心臓パッチは、心臓組織の成分spheroids. 3Dバイオプリンティングの機械的統合を示し、有望な臨床応用と心臓組織再生を持ち、心臓組織の3Dモデル、予測薬理学および毒物学での複製、および細胞およびゲノム指向療法の開発を備えています。
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概要
本プロトコルでは、バイオマテリアルを使用せず、細胞のみを用いて心臓組織を3Dバイオプリンティングする方法について解説します。こうして作製された心臓パッチは機械的な統合を示し、心臓組織の再生や心疾患モデルとしての活用が期待されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 3Dバイオプリンティング
- 心臓組織工学
- 再生医療
背景
- 心臓組織の再生は、心疾患の治療において極めて重要です。
- 従来の手法は多くの場合バイオマテリアルに依存しており、それが統合を制限することがあります。
- 細胞のみを使用することで、バイオプリントされた組織の機能性を向上させられる可能性があります。
- 細胞間の相互作用を理解することが、組織工学を成功させる鍵となります。
研究目的
- バイオマテリアルを使用せずに心臓組織を3Dバイオプリントする手法を開発すること。
- バイオプリントされた心臓パッチの機械的統合性を評価すること。
- 心疾患研究のためのモデルを構築すること。
使用した手法
- 心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の単離と計数。
- 細胞を所望の比率で混合し、超低接着96ウェルプレートに分注する。
- 細胞をインキュベートし、自発的に拍動するスフェロイドを形成させる。
- 共焦点顕微鏡を用いて、細胞の発現および統合を評価する。
主な結果
- 混合細胞から形成されたスフェロイドに自発的な拍動が認められた。
- 共焦点顕微鏡により、心筋細胞における主要タンパク質の発現が確認された。
- 3Dバイオプリンターを用いて、スフェロイドを心筋パッチに統合することに成功した。
- パッチの機械的な統合が実証された。
結論
- バイオマテリアルを用いない3Dバイオプリンティングは、実現可能であり有効である。
- このアプローチは、心臓組織の再生における可能性を示している。
- 本手法は、心疾患研究における価値あるモデルとして活用できる。
よくある質問
産業における実用的重要性
この手法により、バイオマテリアルを用いない機能的な心臓組織の3Dバイオプリンティングが可能となり、前臨床の疾患モデリングや再生医療に向けた、機械的に統合された組織パッチを生成するスケーラブルなアプローチを提供します。細胞のみを使用することで、外因性スキャフォールドによるばらつきを抑え、薬物応答および毒性試験における生理学的妥当性を高めることができます。これにより得られた自発的に拍動するパッチは、心血管系の創薬パイプラインにおける初期段階のターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：心臓組織の形成および機能における多細胞相互作用の解析を可能にする。
- 運用的価値：心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の統合ネットワークに対する化合物の影響を評価するための再現可能なプラットフォームを提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 拍動する心臓スフェロイドを生成し、それらを機械的に統合されたパッチへと融合させることで、収縮能の機能的な読み取りを可能にします。
- 運用の価値： バイオプリンティングによる精密なスフェロイド配置を通じて組織構造の標準化をサポートし、アッセイの整合性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：病態生理および治療反応を研究するための、疾患に関連した心臓組織の3Dモデルを構築できる。
- 運用的価値：バイオプリントされたパッチを培養中で成熟させることが可能であり、組織の統合性と安定性の経時的な評価をサポートする。
パイプラインおよびワークフローへの統合
このワークフローでは、スフェロイドの作製とバイオプリンティングを、初期段階の発見と前臨床検証を繋ぐ架け橋として位置づけており、これにより、後続の機能評価に向けた複雑な心臓組織の構築が可能になります。
- 探索生物学：定義された多細胞系における細胞間相互作用および組織レベルの機械的統合に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：化合物スクリーニングのために、定量可能な収縮活性を持つ標準化された拍動心臓パッチを提供します。
- 分析：イメージングおよび機能的リードアウトを通じて、自発的な拍動と構造的統合の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：スフェロイド形成から成熟した組織パッチまでの連続的なプロセスを提供し、発生および疾患に関連する組織リモデリングをモデル化します。
- 企業の再利用：複数のターゲットおよび適応症にわたる心臓組織モデルを生成するための、再利用可能なバイオプリンティングプロセスを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：生体に近い心臓組織の力学および細胞統合をモデル化することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用の価値：バイオマテリアルに起因する変動を排除し、実験間および施設間での再現性を向上させます。
- 戦略的価値：ヒトに関連性の高いシステムにおいて、心毒性や治療効果の早期検出を可能にし、後期の開発失敗リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：モデルの忠実度とデータの翻訳性を高めることで、心血管プログラムにおけるリスク調整後の意思決定に寄与します。
実施上の検討事項
- 初代細胞の分離、スフェロイド培養、および3Dバイオプリンターの操作に関する専門知識が必要です。
- 真空吸引機能と互換性のあるニードルアレイを備えたバイオプリンターへのアクセスに依存します。
- 一貫したスフェロイド形成のためには、標準化された細胞混合比と超低接着プレートが必要です。
- 機能的な組織を構築させるため、成熟時間と培地条件の最適化を伴います。
- バイオプリントされたパッチの現在のスケールによる制限があるほか、プリント後の組織は脆弱であるため、慎重な取り扱いが必要です。
