Name: ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学ぶ ミオシン重鎖免疫組織化学とImageJ自動解析を用いたラット骨格筋断面の筋線維タイプ迅速定量法。高スループットで再現性の高い筋線維組成解析が可能です。

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この研究は、クリスチャン・ドップラー研究財団によってサポートされていました。私たちは、プロジェクト全体のサポートのためにオーストリアのウィーン医科大学のコア施設イメージングからサビーン・ラウシャー感謝したいと思います。一次抗体は、NIHのNICHDによって作成され、アイオワ、生物学科、アイオワ州アイオワシティの大学で維持、発達研究ハイブリドーマバンクから入手した、Schiaffino、S.によって開発されました。

FELASA 26で推奨されているように、動物の被験者を含むすべての手順は、実験動物のケアの原則を遵守して行われました。 BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3B /：ウントForschung、参照番号Wissenschaft Bundesministeriumのfuer：承認前の研究と科学のためのウィーン医科大学の施設内倫理委員会とオーストリア省の調査（BMWFに得られました2014）。 1.筋肉の収穫注：孟らによる以前の刊行。 27は非常に詳細に筋肉標本の正しい凍結を記述可能です。 <ol><li> すぐに動物の安楽死した後、全体の断面を取得するために全体の筋肉や十分な組織を入手します。 <ol><li>麻酔をかけたか、安楽死させたラットからの全体の筋肉を削除します。ピンセットやハサミで筋肉を取り巻くすべての結合組織や腱を削除します。以下のためにnesthesiaや安楽死、FELASA 28の国際的なガイドラインに従ってください。 </li></ol></li><li>校正精度のスケールを使用して筋肉を秤量します。このクイックステップは、特に介入手順の後、筋肉のサンプル間の比較分析を可能にします。 </li><li>すべての側面に1mm程度の安全マージンで筋肉の大きさに応じて、OCT化合物を用いて完全に充填された容器の中に筋肉を置く（ 例えば 、アルミニウム箔からなります）。 </li><li>約2分間で凍結液体窒素を使用してイソペンタンを予冷。イソペンタンは容器の底に白い結晶を示し始める必要があります。 注：この手順は、筋肉の正しいアーキテクチャを維持するために不可欠であるし、それによって正しい染色と繊維が27を分析することができます。 </li><li>ストアサンプルを-80℃で少なくとも24時間OCTで保存します。サンプルは、しかし、corre場合、数ヶ月または数年もの間-80°Cで保存することができます<html> CTLY冷却しました。 </li><li>クライオトームを用いて-20℃で筋の中央部から10μmの横断切片を切断します。 10ミクロンに切断することは不可能である場合、20μmの最大値までが2μmのステップの厚さを増します。十分に鋭利な切断刃は、この工程のために不可欠です。 </li><li>断面にスライドを近似することにより、接着剤のスライドにセクションを適用します。断面は、自動的に接着剤をスライドに固執します。一晩染色の前に-20℃でスライドを保管してください。 </li></ol> 2.染色注：ミオシン重鎖タンパク質に対する抗体の大多数が利用可能です。しかし、高品質な抗体は自動取得と分析のために不可欠です。希釈液及び抗体への参照は、 表1を参照されたいです。 スプレッドシートファイルが正しい希釈を計算し、必要な溶液量の数を確認するために、参照source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx&quot;&gt;Supplementalファイル1。 <ol><li>解凍し、染色手順の前に10分間の凍結筋肉切片を空気乾燥させます。 </li><li>洗浄は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）+ 0.05％トリトンX 10分間、次いで5分間で慎重にスライドします。トリトンは大幅染色の質を改善することが示されています。詳細については説明を参照してください。 </li><li> 2分間の切片の空気乾燥させると、（抗体の必要量を最小限にするために）と15分間追加の乾燥を可能にする疎水性のペンを使用して、各スライド上の個々の断面の輪郭を描きます。 </li><li>室温で1時間、10％ヤギ血清を含むPBS + 0.05％トリトンX（PBST）を有するすべてのスライドを阻止します。 </li><li> 10％ヤギ血清を含むPBS + 0.05％トリトンX（PBST）のカクテルのすべての一次抗体（ 表1）を希釈します。適用の前に十分に混ぜます。トリトンX全体断面の等しい染色のために必須です。計算します断面あたりの一次抗体カクテルの約30μL。 </li><li>手順2.7から2.13のために光から十分な保護を確保します。薄暗い部屋の照明やカバー染色トレイには、十分な保護を提供します。また、染色中に湿った環境を提供し、乾燥を防ぐために、下部に流体で染色トレイを埋めます。 </li><li>室温で湿った染色トレイに1時間にわたりスライドを一次抗体（ 表1）カクテルを適用します。 </li><li> 5分間新しいPBSTで、10分間、PBS + 0.05％トリトンXでスライドを洗浄し。 </li><li> PBS + 0.05％トリトンX（PBST）+ 10％ヤギ血清のカクテルで二次抗体を希釈します。断面あたりの一次抗体カクテルの30μLを計算します。 </li><li> 1時間スライドを二次抗体カクテルを適用します。 </li><li>洗浄を10分間、さらに5分間新しいPBSTとPBS + 0.05％トリトンX（PBST）で摺動します。 </li><li> DAPI核染色キット（好ましくは、読み取りに使用できる溶液）FOを適用しますR 15分間または細胞核を染色するために製造業者の指示に従って。 </li><li>洗浄は1分間、PBS + 0.05％トリトンX（PBST）を用いて簡単にスライドします。その後、スライドを空気乾燥簡単にしましょう。 </li><li>蛍光封入剤とカバースリップを適用します。 4°Cで保存し、光から保護し、24〜48時間以内、最適に撮像を行います。 </li></ol> 3.顕微鏡<ol><li>負荷はスライドスキャナにスライド。 12枚のスライドの最大値は、スライドスキャナに応じて可能です。 </li><li>新しいプロジェクトを開始します。プレビュー用DAPIチャネル及び2.5倍のレンズをセット。詳細な分析のためにDAPI、GFP、FITC及びCy5チャネルと20Xの目的を使用しています。オートフォーカスは、DAPIチャネルにおけるプロジェクト全体が取得されます。 </li><li> DAPIの-Blue、FITC：グリーン、テキサスレッド：赤、Cy5の：黄色チャネルごとに以下の色を使用します。 </li><li> DAPIチャネルを使用して、各スライドのプレビューを作成します。このためには、最初の試料にマニュアルフォーカスを適用すると、プレビュー全体でそれを使用します分析は、各試料のプレビュー画像を取得します。 </li><li>詳細な取得プロセスに含まれるべき各断面の輪郭を描きます。関心の領域全体のキャプションを確保するために、試料のエッジに近い輪郭を描画しないでください。 </li><li>各チャネルごとに露光時間を設定します。ほとんどの場合、異なるチャネルの露光パラメータは、すべての断面で同一です。 </li><li>自動画像取得を実行します。初期の自動プロセスで不正取得を防ぐために、ビューの最初のフィールドの正しい取得を確認してください。 </li><li>必要な場合は、デスクトップのミラーリングソフトウェアを使用してリモートコントロールを確立します。これは、任意のネットワークまたはインターネット接続を介して別のコンピュータにスライドスキャナのコンピュータの画面をミラーリングすることにより、画像取得処理の遠隔監視を可能にします。変更が使用されたスライドに関する物理的なセットアップを行うことはできません、が、画像取得ソフトウェアの仮想環境を監視できます<html>画像の正確なピントや露出時間。また、完了までの推定時間は、定期的にチェックすることができます。 </li><li>画像取得が完了した後、繊維構造、個々の繊維及び様々な繊維タイプが識別可能である場合は、手動で制御することにより、全ての画像の正確なオートフォーカスを制御します。 </li><li>再取得誤っビューまたは関心の全体領域の単一フィールドの画像領域に焦点を当てました。単一領域の再取得のために、プロジェクト全体を通して、地域や画像をマークし、マニュアルフォーカスでの領域を再取得。ほとんどの場合、異なる焦点レベルでの追加イメージの詳細が間違って集中した画像につながります</li><li>最終的な分析に含まれるべきすべての断面については、個別にJPEGファイルとして（DAPIを除く）各チャンネルをエクスポートします。テキサスレッド、FITC及びCy5という名前のフォルダにさらさチャンネルに応じてファイルに名前を付けて並べ替えます。 </li></ol> 4.自動ファイバー分析10トン &quot;&gt;注：マクロは、以下のWebページから入手できます。https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/ <ol><li>プレビュー各画像は、分析の前に、従来の画像編集ソフトを使用して染色された繊維と背景との間の十分なコントラストをチェックします。必要に応じて、明るさとコントラスト調整コマンドを使用して、差を大きくするために、コントラストと明るさを調整します。 </li><li> ImageJのか、フィジーを開きます。コマンドを使用してマクロを開く「 - マクロ - プラグイン。編集」これは、マクロのソースコードを示しており、パラメータの迅速な適応を可能にします。必要に応じて、マクロのソースコード内のチャネルごとにフォルダのディレクトリを変更します。 注：筋線維の分析のための値は、ラットの上腕二頭筋と虫様筋、他の種または異なる値を必要とするかもしれない筋肉に基づいています。 </li><li>マクロを開始するには、「実行」コマンドを使用します。フォルダのすべての画像は現在のマクロにロードされ、連続した順序で定量化されています。結果がshoあります新しいウィンドウでWN。このステップでは、分析されているデータの量に応じて、数時間秒からかかる場合があります。 </li><li>スプレッドシートファイルとして結果ウィンドウをエクスポートします。正（迅速）繊維のC​​y5（遅い）、FITC（中間体）及びテキサスレッドを計数し、総繊維数の合計の値を識別する。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

<html>ここでは、勉強と自動的に時間効率的な方法で免疫組織化学を経由して、ラットの断面の筋線維集団を定量化するために広くアクセス方法論を示しています。再現性のために、我々は、ステップの説明及び本研究に記載されていない他の種における用途のための潜在的な変更による詳細なステップを示します。さらに、我々は、最適な機能とその限界のための前提条件を手順の利点を議論します。 現在、染色方法の数は、筋線維集団を同定するために存在し、多くの方法が筋繊維17の手動または半自動定量のために記載されています。しかし、プロトコルはそれが自由に利用できる使用して、両方を組み合わせて、確実に筋肉繊維集団を染色し、自動的に取得して筋線維を定量化するために標準的手法を説明存在しないソフトウェアを解析します。以前の出版物に基づいて、「&gt; 24、29、我々はこれにより、我々は最近、全断面の自動解析は、手動の分析に比べて、信頼性が実現可能であることを示した。マウスの筋肉断面における繊維集団の自...

骨格筋組成物は、加齢1、2、運動3、4、5、6、7、またはそのような疾患8、9、10または外傷11などの病態生理学的プロセスのような生理学的プロセス中深い変化を受けます。したがって、研究のいくつかのフィールドは、機能的な変化を理解するために、これらのプロセスの構造的な影響に集中します。筋肉の機能を決定する重要な側面の一つは、筋線維の組成物です。筋線維は、異なるミオシン重鎖（MHC）タンパク質を発現し、それにより、 図13に示すように 、低速、中間、又は高速繊維7、12に分類され</sup<html> &gt;、14、15、16、17。生理学的に、筋肉は体にその機能に応じて、異なる筋線維組成を有します。筋線維タイプを使用して、繊維集団は、生理的または病態生理学的過程7,17に適応を同定するために定量化することができます。歴史的に、時間のかかる方法の数は、筋線維の種類を区別するために適用されています。この目的のために、筋線維は、種々のpHレベルまたは筋肉酵素活性におけるミオシンATPアーゼの反応のいずれかにより分類しました。異なる繊維品質が単一のセクションで評価することができなかったように、複数の断面は、全ての筋線維を識別し、手動定量14、16、17を可能にするために必要でした= &quot;XREF&quot;&gt; 18、19、20、21、22。対照的に、最近の刊行物は、急速に、単一の断面における複数の繊維タイプを染色するためにミオシン重鎖タンパク質に対する免疫組織化学（IHC）を用いました。この手順の利点に基づいて、それは今筋線維人口分析19、23、24におけるゴールドスタンダードと考えられています。改善IHC染色プロトコルを使用して、我々は最近、全体の筋肉の断面の完全自動取得とその後の自動筋繊維の定量化は、オープンソースプラットフォームのImageJを使用して実現可能であることを示すことができました。手動定量に比べ、我々の手順を4〜25％、±正確ながらスライドごとに必要な時間の有意な減少（手動分析の約10％）を得ました</s&gt;アップ。 この方法の全体的な目標は、オープンソースのプラットフォームを使用して、全ラットの筋肉中に自動筋繊維定量化への迅速な、信頼性の高い、ユーザーから独立したガイドを記述することです。また、我々は、マウスまたはヒトの筋肉などの他の検体のためのその使用を可能にする可能性のある変更について説明します。

<table><tbody><tr><td>O.C.Tコンパウンド</td><td>Tissue-Tek、佐倉、オランダ</td><td></td><td>筋肉組織の適切な凍結のための筋肉組織の埋め込み用</td></tr> イ<tr><td>ソペンタン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストウルトラプラススライド</td><td>サーモサイエンティフィック、ドイツ</td><td>1014356190</td><td>接着剤スライドリン</td></tr><tr><td>酸塩緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>85112</td><td>Detergent Soluation</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>50197Z</td><td>Goat Serum</td></tr><tr><td>DAKO Fluorescent Mounting Medium</td><td>Dako Denmark</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako Denmark</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Vienna,Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>上清</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>上清</td></tr><tr><td>MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>上清</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp;フルーラ&nbsp;633&nbsp;ヤギ抗マウスIgG2b&nbsp;</td><td>Thermo Scientific、ドイツ</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG1&nbsp;(&ガンマ;1)</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (& micro; chain)</td><td>Thermo Scientific, ドイツ</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

筋線維集団の定量化は、疾患、外傷、および骨格筋組成上の様々な他の影響の影響をより深く洞察を提供します。様々な時間のかかる方法は、伝統的な研究の多くの分野で、繊維集団を研究するために使用されています。しかし、最近、単一のセクションに複数の繊維の種類を識別するために迅速な代替手段を提供ミオシン重鎖タンパク質の発現に基づいて免疫組織化学的方法を開発しました。ここでは、全体の断面の自動取得とImageJの有する繊維集団の自動定量化を可能にする、改良された染色質のため、迅速な信頼性及び再現性のプロトコルを提示します。この目的のために、埋め込まれた骨格筋は、細胞核染色のための二次蛍光抗体およびDAPIでミオシン重鎖抗体を用いて染色し、断面にカットされています。全体の断面は、高解像度の複合体を得るためにスライドスキャナを使用して自動的に走査されます試料全体の絵。ファイバー人口分析は、その後、ImageJのための自動化されたマクロを使用して、遅い中間と高速繊維を定量化するために実施されています。我々は以前、この方法は、±4％の程度まで確実繊維集団を識別することができることを示しています。加えて、この方法は、ユーザ間のばらつきを低減し、大幅にオープンソースプラットフォームのImageJを用いて分析時間当り。

全体のラットの筋肉断面がMHC I、IIAおよびIIBの筋線維を識別するために、免疫組織化学を使用して、急速に染色しました。蛍光顕微鏡スライドスキャナを使用して、全体の断面を自動的に自動化された筋線維のために取得したがImageJを用いて解析します。手続きの概念は、筋線維の定量化のために、簡単で信頼性が高く、時間効率的なワークフローを提供することに基づいています。 以前蒙らによる以前のチュートリアルで説明された手順のワークフロー（ 図1）は 、筋肉サンプルの正しい除去および凍結始まります。 27。これは、適切な染色品質のために不可欠です。次のステップでは、筋肉サンプルはミオシン重鎖タンパク質クラスI、IIAおよびIIBと適切な二次蛍光抗体に対する一次抗体を用いて切断し、染色します。最適なST用品質aining、二次抗体の製造者の推奨濃度...

ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

本手法の総合的な目的は、オープンソースプラットフォームを用いて、ラットの全筋における筋線維の定量化を、自動的かつユーザーに依存しない方法で迅速かつ確実に導くことです。この手法は、骨格筋における老化、疾患、または外傷による欠損に関する神経筋肉分野の重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、筋線維集団を確実に分析し、筋横断面の高画質画像を生成できることです。十分に解凍した後、Triton Xを添加したPBS（PBST）で、10分間の洗浄を1回、5分間の洗浄を1回、慎重に行います。2回目の洗浄後、切片を2分間自然乾燥させます。次に、疎水性ペンを使用して、個々の横断面を囲みます。さらに15分間風乾させた後、 goat serum を添加した PBST を用いて、室温で1時間非特異的結合をブロックします。次に、スライドを洗浄し、各サンプルに適切な一次抗体カクテルを加え、遮光した室温で1時間染色します。インキュベーション終了後、PBST で10分間の洗浄を1回、5分間の洗浄を1回行い、スライドをすすぎます。次に、筋肉切片を適切な二次抗体カクテルで、遮光した状態で1時間ラベルします。実演通りにスライドをPBSTで2回洗浄した後、スライドを乾燥させ、メーカーの指示に従ってDAPI核染色キットを用いて核を染色します。余分なDAPIをPBSTで1分間洗浄して除去し、その後短時間、風乾させます。次に、試料に蛍光封入剤を滴下してカバーガラスを掛け、スライドを4°Cで遮光保存します。染色の後24〜48時間以内に、スライドをスライドスキャナーにセットし、プログラムソフトウェアで新規プロジェクトを作成します。スライドのプレビューでは、DAPIチャンネルと2.5xレンズを選択し、最初の検体を手動でフォーカスさせます。詳細な画像取得プロセスに含めるべき各断面の概略を描き、各チャンネルの露光時間を設定します。次に、自動画像取得を実行し、自動プロセスの初期段階での誤った取得を防ぐため、最初の視野が正しく取得されているかを確認します。画像取得が完了したら、各断面のオートフォーカスが正確であること、および個々の繊維が明確に識別できることを手動で確認してください。すべての画像について、必要に応じてオートフォーカスを確認し、手動で修正することが極めて重要です。自動筋線維定量化プロセスで最適な結果を得るには、高品質な画像が必要となります。次に、最終解析に含めるすべての横断切片について、DAPI以外の各チャネルを個別のJPEGファイルとしてエクスポートし、露光チャネルに応じて適切に名前を付けたフォルダにファイルを分類して保存します。筋線維の定量化プロセスを開始する前に、適切な画像編集ソフトウェアで各画像を確認し、染色された線維と背景との間に十分なコントラストがあることを確認します。次に、ImageJで「Plugins &gt; Macros &gt; Edit」コマンドを使用してマクロのソースコードを表示し、ソースコード内で各チャンネルのフォルダディレクトリを変更します。その後、「Run」コマンドを使用してマクロを実行します。フォルダ内のすべての画像がマクロに読み込まれ、連続的に定量されます。定量の終了後、結果を適切なスプレッドシートソフトにエクスポートし、陽性と判定されたslow、intermediate、およびfast fiberの値を特定します。これにより、総線維数を算出することができます。筋線維の免疫蛍光染色は迅速で、交差反応もわずかであり、得られた画像では染色された線維と周囲の組織との高いコントラストに加え、異なる線維タイプ間の明確な区別が認められます。自動解析により、手動解析と比較して±4%の精度で相対的な筋線維集団の検出が可能であり、全体の絶対数は手動解析よりも多くなります。ただし、相対数については±4%の範囲内で同様の結果となります。このビデオを視聴することで、この方法を用いて筋線維の定量化を自動化する方法について十分に理解できるはずです。DAPIの使用には危険が伴うことを忘れないでください。したがって、染色の際は適切な保護具を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。...

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。...

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

ここでは、ミトコンドリアネットワークスキャン用の共焦点顕微鏡を使用した生きた骨格筋イメージングにより、ミトコンドリア密度と縦方向分布の変化を解析するプロトコルを紹介します。...

共焦点顕微鏡によるラット生体骨格筋線維のミトコンドリア密度と縦方向分布の解析

我々は、成体マウスの6つの筋肉から異なる長さとタイプの酵素的に解離した線維を得るためのプロトコルを記述する:そのうちの3つ(屈筋指筋ブレビス、長指伸筋、ヒラメ筋)と3つは初めて正常に解離した(長反母腓骨伸筋、長腓骨筋、指腓骨筋)。...

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。...

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

学ぶ ミオシン重鎖免疫組織化学とImageJ自動解析を用いたラット骨格筋断面の筋線維タイプ迅速定量法。高スループットで再現性の高い筋線維組成解析が可能です。

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

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