ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

本手法の総合的な目的は、オープンソースプラットフォームを用いて、ラットの全筋における筋線維の定量化を、自動的かつユーザーに依存しない方法で迅速かつ確実に導くことです。この手法は、骨格筋における老化、疾患、または外傷による欠損に関する神経筋肉分野の重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、筋線維集団を確実に分析し、筋横断面の高画質画像を生成できることです。

十分に解凍した後、Triton Xを添加したPBS（PBST）で、10分間の洗浄を1回、5分間の洗浄を1回、慎重に行います。2回目の洗浄後、切片を2分間自然乾燥させます。次に、疎水性ペンを使用して、個々の横断面を囲みます。

さらに15分間風乾させた後、 goat serum を添加した PBST を用いて、室温で1時間非特異的結合をブロックします。次に、スライドを洗浄し、各サンプルに適切な一次抗体カクテルを加え、遮光した室温で1時間染色します。インキュベーション終了後、PBST で10分間の洗浄を1回、5分間の洗浄を1回行い、スライドをすすぎます。

次に、筋肉切片を適切な二次抗体カクテルで、遮光した状態で1時間ラベルします。実演通りにスライドをPBSTで2回洗浄した後、スライドを乾燥させ、メーカーの指示に従ってDAPI核染色キットを用いて核を染色します。余分なDAPIをPBSTで1分間洗浄して除去し、その後短時間、風乾させます。

次に、試料に蛍光封入剤を滴下してカバーガラスを掛け、スライドを4°Cで遮光保存します。染色の後24〜48時間以内に、スライドをスライドスキャナーにセットし、プログラムソフトウェアで新規プロジェクトを作成します。スライドのプレビューでは、DAPIチャンネルと2.5xレンズを選択し、最初の検体を手動でフォーカスさせます。

詳細な画像取得プロセスに含めるべき各断面の概略を描き、各チャンネルの露光時間を設定します。次に、自動画像取得を実行し、自動プロセスの初期段階での誤った取得を防ぐため、最初の視野が正しく取得されているかを確認します。画像取得が完了したら、各断面のオートフォーカスが正確であること、および個々の繊維が明確に識別できることを手動で確認してください。

すべての画像について、必要に応じてオートフォーカスを確認し、手動で修正することが極めて重要です。自動筋線維定量化プロセスで最適な結果を得るには、高品質な画像が必要となります。次に、最終解析に含めるすべての横断切片について、DAPI以外の各チャネルを個別のJPEGファイルとしてエクスポートし、露光チャネルに応じて適切に名前を付けたフォルダにファイルを分類して保存します。

筋線維の定量化プロセスを開始する前に、適切な画像編集ソフトウェアで各画像を確認し、染色された線維と背景との間に十分なコントラストがあることを確認します。次に、ImageJで「Plugins > Macros > Edit」コマンドを使用してマクロのソースコードを表示し、ソースコード内で各チャンネルのフォルダディレクトリを変更します。その後、「Run」コマンドを使用してマクロを実行します。

フォルダ内のすべての画像がマクロに読み込まれ、連続的に定量されます。定量の終了後、結果を適切なスプレッドシートソフトにエクスポートし、陽性と判定されたslow、intermediate、およびfast fiberの値を特定します。これにより、総線維数を算出することができます。

筋線維の免疫蛍光染色は迅速で、交差反応もわずかであり、得られた画像では染色された線維と周囲の組織との高いコントラストに加え、異なる線維タイプ間の明確な区別が認められます。自動解析により、手動解析と比較して±4%の精度で相対的な筋線維集団の検出が可能であり、全体の絶対数は手動解析よりも多くなります。ただし、相対数については±4%の範囲内で同様の結果となります。

このビデオを視聴することで、この方法を用いて筋線維の定量化を自動化する方法について十分に理解できるはずです。DAPIの使用には危険が伴うことを忘れないでください。したがって、染色の際は適切な保護具を着用してください。