肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

この手順の全般的な目的は、肝臓など、食事誘発性炎症の影響を受けやすい組織からマクロファージを効果的に単離し、特性解析することです。この手法は、組織 निवासीマクロファージの表現型が慢性炎症性疾患の進行にどのように影響するかという、免疫学および炎症分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。この手法の主な利点は、肥満による低グレードの慢性炎症の影響を受けた組織から単一細胞懸濁液を得るために必要な単離ステップが最適化されていることです。

デモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるJoselyn Allenです。肝臓を摘出するには、まずエタノールで麻酔したマウスをポリスチレンフォームの解剖ボードの上に仰向けに置き、前肢と後肢を固定します。次に、中先ピンセットで尿道口付近の腹部皮膚をつまみ、鋭い解剖用ハサミを使用して、持ち上げた皮膚に小さな切開を加えます。

ハサミの下刃を皮膚と腹膜の間の切開口に挿入し、鼠径部から顎にかけて側方に切開します。皮膚をそっと剥がして、損傷のない腹腔と胸壁を露出し、腹膜を側方に切開します。胸骨を持ち上げ、慎重に横隔膜を切開します。

次に、胃腸管を脇に寄せ、肝下大静脈（IVC）を確認します。止血鉗子を用いて、局所的な灌流を維持するために肝上大静脈をクランプし、あらかじめ温めておいた灌流バッファーを満たしたシリンジを23ゲージの採血・注入セットに取り付けます。チューブと針に灌流バッファーが満たされるまでプランジャーをゆっくりと押し、肝下大静脈と平行に針を挿入します。

下大静脈（IVC）を適切にカニュレーションすることで、解離バッファーが肝臓全体および末梢組織に局所的に分布し、組織消化が最適化されます。4 cmの止血鉗子を使用して針を固定し、プランジャーをゆっくりと押し下げて灌流を開始します。針が適切に配置されていれば、肝臓から急速に色が抜け、葉が膨張します。

門脈を速やかに切断して灌流バッファーが肝臓内を自由に流れるようにし、血液の除去を促進するために、時々親指と人差し指で葉を軽くマッサージします。灌流バッファーが5 mLになった時点で、灌流バッファー用シリンジをあらかじめ加温した解離バッファーを満たしたシリンジに交換し、肝臓が完全に消化されるまで、葉の緩やかなマッサージと灌流を継続します。ピンセットの鈍い端を左外葉に軽く押し込み、消化が正常に完了したことを確認します。

ピンセットを離すと、表面にゆっくりと埋まる陥没が現れるはずです。次に、針を取り除き、解剖用はさみの短い直線刃を用いて、結合組織を慎重に切断し、肝臓全体と胆嚢を摘出します。肝臓を10 mLの氷冷DMEMが入った10 cmディッシュに移し、有歯ピンセットで切断した肝上大静脈（IVC）を把持します。

中サイズのピンセットを用いて、各葉に素早く擦るような動作を加え、グリソン鞘から細胞を遊離させます。その後、飽和したDMEMを70 µmのセルストレーナーに通し、氷上の50 mLコニカルチューブに回収します。生存細胞を高収量で得るためには、肝細胞をグリソン鞘から適切に解離させることが不可欠です。すべての細胞を回収した後、チューブを反転させて細胞懸濁液を穏やかに混合し、遠心分離により細胞をペレット化します。

上清を新しい50 milliliterコニカルチューブに移し、低速遠心分離をさらに3回繰り返します。最後の遠心分離後、上清を別の新しい50 milliliterチューブに移し、細胞をもう一度高速で遠心分離します。その後、非実質細胞ペレットをFACSバッファーに再懸濁して細胞数をカウントし、ラベルを貼った5 milliliterポリスチレン製ラウンドボトムチューブを用いて、後続のアプリケーションに応じた適切な濃度に肝細胞を希釈します。

高脂肪食または高脂肪高コレステロール食を摂取したマウスでは、大動脈などの患部組織において、古典的に活性化されたM1マクロファージの浸潤が増加します。抗炎症表現型を示すRON受容体発現大動脈CD45陽性F4/80陽性マクロファージは、高脂肪高コレステロール食摂取マウスで減少する一方、炎症性CD45陽性F4/80陽性CD11c陽性マクロファージは、これらの動物から単離した大動脈において増加して認められます。さらに、消化した大動脈からソートしたRON受容体発現マクロファージでは、確立されたM2マクロファージマーカーであるArginase 1遺伝子の発現上昇が示されます。

実際に、肝臓に局在するマクロファージの特性解析により、RON受容体を発現するサブポピュレーションが主流であること、およびCD11c陽性の前炎症性マクロファージ集団において、抗炎症性のM2表現型に強く関連する遺伝子の発現が低下していることが明らかになりました。同様の傾向は、消化した白色脂肪組織から単離したマクロファージ集団でも観察され、前炎症性表現型を持つマクロファージ集団ではRON受容体の表面発現が低下していました。この手法を習得し、適切に実施すれば、1匹あたり20分から30分で完了させることができます。

この手順に続いて、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、および/または定量的PCRなどの他の手法を用いて、単離した肝由来組織常在性マクロファージの表現型をさらに詳細に解析することができます。このビデオを視聴することで、疾患肝から組織常在性マクロファージを適切に単離する方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。