Name: 肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶ 肥満関連炎症組織からマクロファージを単離・特性評価する方法。マウス肝臓を用いた灌流・消化プロトコルで、組織常在マクロファージの表現型解析に有用です。

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ペンシルベニア州立大学ミレニアム科学複雑な流れの Cytometry 中核施設に感謝したいと思います。

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
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<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
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</ol>

著者は明らかに利害の衝突があります。

病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的なサポートを提供するコラーゲンを混乱させます。組織の構造指示組織マトリックス剛性 (変形抵抗)、成功した ECM 混乱28を確保する上で最も効率的な粗コラゲナーゼ製品です。「ソフト ・ マトリックス」で構成されているワットはしばしば同時にセル表面のインスリン受容体29の整合性を維持しながら脂肪細胞と免疫細胞を解放するために II 型コラゲナーゼで消化されます。大動脈の線維成分のマイクロ アーキテクチャは、「硬いマトリックス」、その他酵素との組み合わせで使用する (最も高いコラゲナーゼ活性のある) XI 型...

マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病1の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動4大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症5の結果します。
古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存7。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症8の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復9,10に関連付けられています。
体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝4大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。
肝臓は、近くの調節不全ワット15発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18。
並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス19を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球20の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。
総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の1を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。
ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 - (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口22を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析23を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 インチ ニードル</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 インチ ニードル x 12 インチ チューブ 採血セット</td><td>BD</td><td>367297</td><td>肝臓灌流中の肝下 IVC のカニューレ挿入に使用</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 インチニードル</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ ゴムストップ付き</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスCD16/32 FC Block&nbsp;</td><td>バイオレジェンド</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 パシフィック ブルー</td><td>バイオレジェンド</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE ラット IgG2a</td><td>バイオレジェンド</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 アルメニアンハムスター IgG</td><td>バイオレジェンド</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 ラット IgG2b</td><td>バイオレジェンド</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>パシフィック ブルー ラット IgG2c</td><td>バイオレジェンド</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコS モディファイドイーグルミディアム (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;mセルストレーナー</td><td>コーニング社</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>デンビル</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド水溶液-16x</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>CAS#30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ、3.5インチ、ストレート、23 mm、シャープ&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>一般的な解剖目的に使用</td></tr><tr><td>マイクロ鉗子、4インチ、フルカーブ、0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>一般的な解剖目的に使用されます</td></tr><tr><td>春解剖ハサミ &ndash; 3mm 刃先&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-10</td><td>大動脈解剖に使用 ステップ1.3.3.17から1.3.3.28</td></tr><tr><td>湾曲 0.07 mm x 0.04&nbsp;mm先端鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11297-10</td>大<td>動脈解離ステップ1.3.3.17〜1.3.3.28</td></tr>止<tr><td>血鉗子(湾曲)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13021-12</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>パリンナトリウム塩フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィッシュ</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35mm細胞培養/ペトリ皿フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ッシュ<td>12-565-90</td><td></td></tr>ポリス<tr><td>チレンペトリディッシュ(10cm)蓋付き</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカル遠心チューブ (ポリプロピレン)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカル遠心チューブ&nbsp;(ポリプロピレン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5mL丸底ポリスチレンチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(ストックエチルアルコール変性、任意の水)</td><td>ミリポア</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン</td><td>ロックランド</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3375</td><td></td></tr>コ<tr><td>ラゲナーゼII型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ XI 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ I 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mLビーカー&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm 止血クランプ</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>歯付き鉗子</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu;m 使い捨てフィルター</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV型</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム カリウム (ACK)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>カミソリ(0.22 mm(0.009"))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッドライブ/デッドステインレッド生存</td><td>率ステイン</td><td></td><td></td>(<ストロング>図1A<ストロング>)</tr></tbody></table>

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。

アポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) C57BL/6 (BL6) マウス 18 週間、1 x 10 の4 - 2 × 104 CD45 (HCHFD または HCD) 高脂肪高コレステロール食で維持を使用する場合+F4/80+ 2 つのサンプルは、大動脈マクロファージが分離することができますプール。HFHCD 給電アポ KO マウスの胃から肝臓生産 (これは、使用可能な並べ替え時間異なります) 5 x 105並べ替えクッパー細胞より大きかった。うんざりした野生型 (WT) c57bl/6 マウスの高脂肪食 (HFD) を使用して、間質血管の分画 (SVF) 5 x 105 1 x 106居住者の脂肪組織マクロファージ (Atm) を並べ替えることができます。指定された組織から並べ替えることができますマクロファージの述べられた合計数は量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を用いた遺伝子発現解析を実行するた...

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

この手順の全般的な目的は、肝臓など、食事誘発性炎症の影響を受けやすい組織からマクロファージを効果的に単離し、特性解析することです。この手法は、組織 निवासीマクロファージの表現型が慢性炎症性疾患の進行にどのように影響するかという、免疫学および炎症分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。この手法の主な利点は、肥満による低グレードの慢性炎症の影響を受けた組織から単一細胞懸濁液を得るために必要な単離ステップが最適化されていることです。デモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるJoselyn Allenです。肝臓を摘出するには、まずエタノールで麻酔したマウスをポリスチレンフォームの解剖ボードの上に仰向けに置き、前肢と後肢を固定します。次に、中先ピンセットで尿道口付近の腹部皮膚をつまみ、鋭い解剖用ハサミを使用して、持ち上げた皮膚に小さな切開を加えます。ハサミの下刃を皮膚と腹膜の間の切開口に挿入し、鼠径部から顎にかけて側方に切開します。皮膚をそっと剥がして、損傷のない腹腔と胸壁を露出し、腹膜を側方に切開します。胸骨を持ち上げ、慎重に横隔膜を切開します。次に、胃腸管を脇に寄せ、肝下大静脈（IVC）を確認します。止血鉗子を用いて、局所的な灌流を維持するために肝上大静脈をクランプし、あらかじめ温めておいた灌流バッファーを満たしたシリンジを23ゲージの採血・注入セットに取り付けます。チューブと針に灌流バッファーが満たされるまでプランジャーをゆっくりと押し、肝下大静脈と平行に針を挿入します。下大静脈（IVC）を適切にカニュレーションすることで、解離バッファーが肝臓全体および末梢組織に局所的に分布し、組織消化が最適化されます。4 cmの止血鉗子を使用して針を固定し、プランジャーをゆっくりと押し下げて灌流を開始します。針が適切に配置されていれば、肝臓から急速に色が抜け、葉が膨張します。門脈を速やかに切断して灌流バッファーが肝臓内を自由に流れるようにし、血液の除去を促進するために、時々親指と人差し指で葉を軽くマッサージします。灌流バッファーが5 mLになった時点で、灌流バッファー用シリンジをあらかじめ加温した解離バッファーを満たしたシリンジに交換し、肝臓が完全に消化されるまで、葉の緩やかなマッサージと灌流を継続します。ピンセットの鈍い端を左外葉に軽く押し込み、消化が正常に完了したことを確認します。ピンセットを離すと、表面にゆっくりと埋まる陥没が現れるはずです。次に、針を取り除き、解剖用はさみの短い直線刃を用いて、結合組織を慎重に切断し、肝臓全体と胆嚢を摘出します。肝臓を10 mLの氷冷DMEMが入った10 cmディッシュに移し、有歯ピンセットで切断した肝上大静脈（IVC）を把持します。中サイズのピンセットを用いて、各葉に素早く擦るような動作を加え、グリソン鞘から細胞を遊離させます。その後、飽和したDMEMを70 µmのセルストレーナーに通し、氷上の50 mLコニカルチューブに回収します。生存細胞を高収量で得るためには、肝細胞をグリソン鞘から適切に解離させることが不可欠です。すべての細胞を回収した後、チューブを反転させて細胞懸濁液を穏やかに混合し、遠心分離により細胞をペレット化します。上清を新しい50 milliliterコニカルチューブに移し、低速遠心分離をさらに3回繰り返します。最後の遠心分離後、上清を別の新しい50 milliliterチューブに移し、細胞をもう一度高速で遠心分離します。その後、非実質細胞ペレットをFACSバッファーに再懸濁して細胞数をカウントし、ラベルを貼った5 milliliterポリスチレン製ラウンドボトムチューブを用いて、後続のアプリケーションに応じた適切な濃度に肝細胞を希釈します。高脂肪食または高脂肪高コレステロール食を摂取したマウスでは、大動脈などの患部組織において、古典的に活性化されたM1マクロファージの浸潤が増加します。抗炎症表現型を示すRON受容体発現大動脈CD45陽性F4/80陽性マクロファージは、高脂肪高コレステロール食摂取マウスで減少する一方、炎症性CD45陽性F4/80陽性CD11c陽性マクロファージは、これらの動物から単離した大動脈において増加して認められます。さらに、消化した大動脈からソートしたRON受容体発現マクロファージでは、確立されたM2マクロファージマーカーであるArginase 1遺伝子の発現上昇が示されます。実際に、肝臓に局在するマクロファージの特性解析により、RON受容体を発現するサブポピュレーションが主流であること、およびCD11c陽性の前炎症性マクロファージ集団において、抗炎症性のM2表現型に強く関連する遺伝子の発現が低下していることが明らかになりました。同様の傾向は、消化した白色脂肪組織から単離したマクロファージ集団でも観察され、前炎症性表現型を持つマクロファージ集団ではRON受容体の表面発現が低下していました。この手法を習得し、適切に実施すれば、1匹あたり20分から30分で完了させることができます。この手順に続いて、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、および/または定量的PCRなどの他の手法を用いて、単離した肝由来組織常在性マクロファージの表現型をさらに詳細に解析することができます。このビデオを視聴することで、疾患肝から組織常在性マクロファージを適切に単離する方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

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フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

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低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

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RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

成熟した脂肪細胞のサイズと脆弱性は、その研究と分離に利用できる技術とツールを制限しています。ここでは、成熟したマウス脂肪細胞の単離のためのプロトコルが記載されており、これは異なる脂肪貯蔵庫およびマウスの食事療法に容易に適応することができる。...

赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

学ぶ 肥満関連炎症組織からマクロファージを単離・特性評価する方法。マウス肝臓を用いた灌流・消化プロトコルで、組織常在マクロファージの表現型解析に有用です。

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

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