Name: 時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ時間分解エレクトロスプレーイオン化水素-重水素交換質量分析法で、タンパク質の急速な構造変化をミリ秒スケールで解析します。構造生物学における秩序タンパク質と無秩序タンパク質のダイナミクス解明に役立ちます。

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私たちは、彼のNMR研究から予測された「ネイティブ」タウアンサンブルのpdb座標ファイルを提供してくださったMarkus Zweckstetter博士に感謝します。また、Adnan Sljoka博士が提供する分析ツールも提供してくれました。この研究の資金は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)のENGAGE助成金プログラムによって提供されました。

注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。ポリ（メチルメタクリレート）のレーザーアブレーション（PMMA）によって生成ヒュームは、毒性であることができます。レーザー彫刻機が作動し、換気システムに接続されていることを確認してください。エンジニアリング・コントロールの使用（ヒュームフード、シャープコンテナ）と個人用保護具（安全メガネ、フェイスマスク、手袋、白衣、完全長ズボン、クローズドつま先の靴）を含むマイクロ流体デバイスを構築する際にすべての適切な安全対策を使用してください。これは、可能な限り、分析中の干渉の汚染物質を減少させるために、ACS等級以上のすべてのビーイングで、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードの試薬を使用することが最も重要です。 マイクロ流体デバイスの作製<ol><li> PMMAマイクロ流体プラットフォームの構築<ol><li>標準PMMAブロック（8.9 X 3.8×0.6センチメートル）を取得し、試薬を導入するための入力チャンネル、プロテオをレーザーアブレーション溶解チャンバー、及びレーザー彫刻17、18を用いて出力チャネル。 注：細長い楕円形（30×5×0.05ミリメートル）でタンパク質分解チャンバをエッチングします。入力および出力チャネルがPMMAブロックの端まで延び、30 GA毛細管を収容するために、両方の幅と深さにはより大きい75μmであってはなりません。 </li><li> 1/64&quot; の厚さのカットオフディスクと回転工具を用いて約10cmずつの2つの片に30 GAステンレス鋼金属キャピラリーを切断する。キャピラリの端部を滑らかにするためにサンドペーパーを使用して（これは下で見ることによって容易にすることができます光学顕微鏡）。 </li><li>はんだごてを用いてエッチングされ、ポリ（メチルメタクリレート）ブロックに毛細管を溶融します。入力チャンネルは、自動化されたシリンジポンプに接続され、出力チャネルは、MSに結合するために使用されるであろう。 </li></ol></li><li>連続フロー時間分解キネティックミキサーの構築<ol><li>融合を入手シリカガラスキャピラリー（ID：75ミクロン、外径：150ミクロン）は、約40cmの、および約15センチ28 GAステンレス鋼金属キャピラリーに挿入。必要な反応時間に応じて、より長い外側金属キャピラリーまたはより大きいIDを持つものを使用します。 注：金属細管の「真」の内径を決定することは、正確な反応時間を得るために重要です。これは、キャピラリものの、溶剤流れ、および背圧を記録し、HPLCに金属キャピラリーを装着することにより行うことができます。内径計算に背圧を行うことができ、金属キャピラリーの真の内径を決定しました。これは、（Windowsのバージョン6.49のための）分子量計算ソフトを用いて計算することができます。 </li><li>内側ガラスキャピラリーの一端に低出力レーザー彫刻の設定を使用して、2mmのノッチを生成し、内側ガラスキャピラリー（ 図2）のこの端部をシールします。あるいは、セラミックガラスcapillarを使用してノッチを作りますYカッターツールまたは微細切削ブレードとロータリーグラインダー。 </li><li>ラインアップ金属キャピラリーの端部と内側ガラスキャピラリー（これは、光学顕微鏡下で観察することによって容易にすることができます）。 </li><li>混合ティー（ 図2）の一端に、この運動ミキサーを取り付けます。 </li><li>混合ティー上の運動ミキサーの反対側の端部に約40cmの溶融シリカガラスキャピラリー（150ミクロン：75ミクロン、OD ID）を取り付けます。これは、反応をクエンチする酸（5％酢酸、pHは2.4）を送達するために使用されます。 注：反応物は、自動化された輸液ポンプを使用して、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブを通してガスタイトシリンジで装置に供給されています。 </li></ol></li><li>ペプシンの活性化<ol><li>ブタ胃粘膜からペプシン20mgを秤量し、カップリング緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MのNaCl、pH6.0）で1 mLにそれを停止します。 </li><li> 、N個のヒドロキシスクシンイミド（NHS）活性化アガロースビーズ50mgを秤量再Sに追加しますプロテアーゼをuspendedし、4℃で一晩ゆっくりと回転させます。 </li><li>樹脂を収集するために室温で2分間1000×gでスピンダウン。 </li><li>未結合のプロテアーゼを吸引します。 </li><li>ブロッキング緩衝液1mLにアガロースをインキュベート（1 Mトリス-HCl、pH6.0）で、1時間室温で穏やかに回転します。 </li><li>樹脂を収集するために室温で2分間1000×gでスピンダウン。 </li><li>ブロッキングバッファーを吸引除去します。 </li><li> 1mLの5％酢酸、5分間、pHを2.4とペプシン - アガロースをインキュベートします。 </li><li>樹脂を収集するために2分間1000×gでスピンダウン。 </li><li>上清を吸引除去します。 </li><li>合計3回の洗浄のための1.3.10 - を繰り返して、1.3.8を繰り返します。 </li><li>長期使用のために4℃で1 mLの酢酸中のビーズを格納します。 </li></ol></li><li>デバイスアセンブリ<ol><li>滅菌スパチュラを用いて5％酢酸で活性化されたペプシン - アガロースビーズのスラリーを用いてタンパク質分解チャンバを満たします。 </li><li> PMMAマイクロ流体platforを置きますデバイスをシールするカバーのような2つのブランクPMMAブロック間でmは、液密シールを作成するために、シリコーンゴムで裏打ち。 </li><li>圧力シールにデバイスを金属製のクランププレートを使用します。 注：クランプがカスタムマイクロ流体プラットフォームを合わせるために作られたと10.1センチメートルX 7.4センチメートルX 1.2センチメートルを測定する二つのプレートで構成されています。 </li><li> 10μL/分の速度で5％酢酸、pHが2.4を流れます。 1μL/分の速度でタンパク質線も50mMの酢酸アンモニウム緩衝液（pH 6.9）を流れます。 注：これは、酢酸を連続実験の全体にわたって装置を通して流れていることが非常に重要です。そこには漏れがないと、その流体はESI源となる出力チャネルからのみ出ていることを確認します。 </li><li>最適なエレクトロスプレー条件を達成するために調節可能な絶縁ステージを使用して変更四重極飛行時間型（Q-TOF）質量分析計の前端部に結合装置。 注：バイパススイッチ商用ESI源の存在をシミュレートするために導入されます。 17 </li></ol></li></ol> 2.時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換<ol><li>ペプシンおよびタンパク質のみスペクトルの取得 注：ESI-MSの取得は60-Vデクラスタリング電位、5000に4500の電圧を正イオンモードで行われ、250-Vは電位を中心に説明します。スペクトルは、1秒の走査速度で350-1,500のm / zの範囲にわたって取得され-1。 <ol><li>ペプシンのみのスペクトルを取得します。タンパク質が添加されると、このスペクトルに現れる任意のピークが減算されます。 </li><li>タウ/リン酸化タウタンパク質を50mM酢酸アンモニウム緩衝液が以前に流れていた1μL/分の速度で（先に13、19に記載の精製および調製）50-100μMを導入します。 </li><li>タンパク質のみのスペクトルを取得。 </li></ol></li><li>買収OFの時点<ol><li> 100μMタウ/ホスホ-タウ蛋白質は1μL/分で流れている間、T字コネクタを介して3μL/分の速度でD 2 Oを導入し、運動混合機中で反応させます。スペクトルの取得前に少なくとも10分間平衡化システムを可能にします。 注：交換の後、標識化反応は、標識タンパク質のμL/ minで消化は、タンパク質分解チャンバ内に発生10における酢酸のpH 2.4の流れによってクエンチします。 </li><li> 8秒に42ミリ秒の混合時間を達成するために、内側ガラスキャピラリーの位置を手動で引き戻し、標識時間を増加させるために。各プルバックの間に、少なくとも10分間平衡化システムを可能にします。 </li></ol></li></ol> 3.データと統計解析<ol><li>ペプチドを同定し、重水素交換のパーセンテージを計算します<ol><li> MSスペクトルはmMassソフトウェアを使用して分析を行う、バージョン5.5.0 20 </suP&gt;。 </li><li> ExPASyプロテオミクスFindPeptサーバを使用してペプチドを同定および21を必要に応じて衝突誘起解離（CID）によって確認されます。 注：ここでは、重水素の取り込み取り込みは同位体分布解析22、23のための社内開発されたFORTRANのソフトウェアを使用して測定しました。 </li><li> SPHERE Webツール22、24を使用して一次配列に基づく理論本来の速度を計算します。 </li><li>単一指数非線形回帰を使用してデータをフィットし、グラフや統計ソフトウェア（ 例えば 、SigmaPlotの）を使用して正規化します。 注：の比K INT / K OBS保護ファクター（PF）、特定の領域が立体配座のアンサンブル内に構成されている程度の半定量的尺度を与えます。 </li></ol></li></ol>

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開示するものは何もありません。

彼らは、タンパク質の非常に詳細な構造を提供するので、このようなX線結晶学およびNMRなどの構造生物学の方法が有利であるが、これらの写真は、多くの場合、静的です。これらの従来の方法により研究する際の過渡種弱構造ドメインの特徴付けは、とらえどころのないことを継続します。したがって、これらのタイプのシステム上の動的な洞察を得るためには、迅速な時間スケールで仕事をすることが重要です。我々は成功したローカライズされたペプチドのレベルでよく研究IDP内で発生する立体構造変化に関する詳細な洞察を得ることがTRESI-HDX-MSを適用しています。この技術の鍵制限の1つは、ペプシンは非特異的プロテアーゼであり、それだけで、めったにフルシーケンスカバレッジを生成しないということです。シーケンスのカバレッジと特異性を改善する一つの方法は、消化槽26にアスペルギルス・サイトイからプロテアーゼタイプXIIIを組み合わせることです。 それはすることが重要です消化チャンバを効果的に交換反応をクエンチし、バック交換<sup class="xref...

過去数十年にわたり、重要な進歩は、タンパク質の構造とダイナミクス1、2、3、4を測定するために設計された分析技術の開発に行われています。 X線結晶学は、タンパク質の構造を決定するための原則ツールまま、タンパク質の高い濃度が必要とされ、大規模な最適化は、回折品質結晶を生成するために必要とされます。このような膜結合と本質的に無秩序なタンパク質として結晶化することが困難であるタンパク質は、古典的水素-重水素交換（HDX）NMR 5によって研究されています。しかし、最近数十年で、HDXにエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）のカップリングは、急速に人気6、7を得ました。 質量分析は、ソリューションを提供していますX線結晶学およびNMRによってもたらされる制限の多くに。具体的には、MSは、高感度の（必要μM濃度までnm）であり、タンパク質の大きさに制限は事実上存在しません。加えて、MS分析の高デューティサイクルは、それらは、酵素代謝回転、ミスフォールディング、錯体および他の生物学的に関連したプロセスを経るようなタンパク質を研究する可能性を可能にします。これらのプロセスは、多くの場合、第二時間スケールにミリ秒で発生し、分析前に試薬の迅速な混合を必要とします。 2003年にウィルソンとKonermannによって時間分解エレクトロスプレーイオン化（TRESI）の開発は、反応はESI-MSにより擬似リアルタイムで監視することを可能にしました。それらの設定は、連続的に調整可能な反応チャンバ容積8と毛細管ミキサーを組み込みました。デバイスは、狭間capillar内の混合を可能にするために密封され、内側毛細管とその側に切断ノッチを有する2本の同心の毛管から成り内側毛細管（典型的には2 mm）の終了までのノッチからY空間。 HDX実験に適用した場合、内側毛細管は、目的のタンパク質を運び、外側毛管は、次いでESIに先立って直接転写にHDX標識を可能にする調節可能な反応室に入る前にタンパク質と混合受け標識D 2 O溶液を、運びますソース。 簡単に言えば、HDXは、ソリューション9、10で重水素原子との交換を受けた骨格アミド水素に依存しています。交換が塩基触媒生理学的pHで、酸触媒は、約2.6以下のpHで優勢になりつつとなります。 pH、温度、溶媒アクセシビリティおよび分子内水素結合：為替レートは、4つの主な要因に基づいています。前者の二つの要因は実験を通して一定に保たれるように、特にペプチド骨格のアミド位置の交換の速度は、主にdependenありますタンパク質構造11上のトン。 αヘリックスおよびβシートで広範囲、安定した水素結合ネットワークと緊密に折り畳まれた領域は、ループおよび無秩序化領域に比べて実質的に遅い速度で重水素を取り込む（時には全くない）であろう12。これは、構造における摂動（ 例えば 、凝集または基質結合時）は、異なる重水素取り込み（ 図1）に導くグローバルタンパク質分析を可能にします。 運動キャピラリーミキサーは、重水素の取り込みの局在化のためにタンパク質分解チャンバーを含むマイクロ流体プラットフォームに組み込むことができます。このタンパク質分解チャンバを効果的交換反応をクエンチするために、低pHで保持され、ローカライズされたペプチド（ 図2）にタンパク質を消化するために、固定化された酸性プロテアーゼを必要とします。第二の時間スケールにミリ秒で、バックボーン交換を監視するために特に重要ですループ領域を特徴付けることが困難内のコンホメーション変化、溶融小球、及び本質的に無秩序なタンパク質（のIDP）13、14の特徴付け。あるいは、TRESI-HDXは、現在COREXアルゴリズム（DX-COREX）アプローチ15、16に結合された重水素交換を使用して、X線結晶学およびNMRの方法によって解決原子構造を有していないタンパク質を特徴付けるために使用することができます。この詳細なプロトコルは、両方とも、それは天然の形態だだけでなく、それが病原性の過リン酸化状態だで、IDP、タウを研究するためにTRESI-HDXを適用します。ネイティブタウが最もよく研究の国内避難民の一つですが、少しはそのアミロイド形成性対応13について知られています。

<table><tbody><tr><td>ポリ(メタクリル酸メチル)またはPMMA</td><td>専門プラスチック</td><td>SACR.250CCP</td><td>8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td></tr><tr><td>溶融シリカガラスキャピ</td><td>ラリーPolymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID:75 & マイクロ;メートル、外径:150 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>金属キャピラリー</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>フッ素化エチレンプロピレン (FEP) チューブ</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID:0.020インチ、OD:1/16インチ</td></tr><tr><td>標準ポリマーチューブ</td><td>カッターIDEX</td><td>A-327</td>、<td>1/16インチおよび1/8インチODチューブ</td></tr><tr><td>マイクロスタティックミキシングティーIDEX</td><td></td><td>M-540</td><td>1/16 "ODチューブ</td></tr><tr><td>または</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ティー、0.25&nbsp;mm Bore</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>1/16インチ用ODチューブ</td></tr><tr><td>PEEKティー1/16インチODチューブIDEX</td><td></td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32メス-メスルアーIDEX</td><td></td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEKダブルウィングナット</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>フェルール1/16インチ用外径チューブ</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>100 シリーズ回転工具</td><td>ドレメル</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>カットオフ ディスク</td><td>ジョブメイト</td><td></td><td>1/64" 厚さ</td></tr><tr><td>ステレオマスター デジタル ズーム顕微鏡</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>マスタークラフト</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>ユニバーサル レーザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81220</td><td>500&nbsp;&マイクロ;L容量</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS活性化アガロー</td>ス<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>豚胃粘膜からのペプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード ウォーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア/オンラインツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分子量計算機</td><td></td><td>バージョン 6.49</td><td>オープンソース MS ツール</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>バージョン 5.5.0</td><td>オープンソース MS ツール</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>スイスバイオインフォマティクス</td><td></td><td></td>研究所</tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat ソフトウェア</td><td>バージョン 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml;dinger</td><td>Version 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF 質量分析計</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

本質的に無秩序なタンパク質（国内避難民）は、長い安定な二次構造要素の欠如のために、構造生物学者への課題となっています。迅速な時間スケールで測定し、水素 - 重水素交換（HDX）を一意に簡単にネイティブアンサンブルにおける一過性配座異性体の特徴付けを可能にする、移入された構造と水素結合ネットワークを検出するために適しています。質量分析にHDXの結合は、高感度、低サンプル消費及びタンパク質サイズには制限を含むいくつかの重要な利点を提供します。この手法は、ミリ秒の時間スケールでHDXラベリング時間を監視する機能など、過去数十年で大幅に進歩しています。また、酸性プロテアーゼマイクロリアクタを収容するマイクロ流体プラットフォームにHDXワークフローを組み込むことによって、我々は、ペプチドレベルでの動的特性を局在化することができます。本研究では、時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析（TRESI-MS）は、HDX WAに結合されSは、タウタンパク質、ならびに過剰リン酸化の際に誘導されるコンフォメーションシフトの残留構造の詳細な画像を提供するために使用されます。

ネイティブおよびホスホ - タウの消化プロファイルは、それぞれ77.1及び71.7パーセントの配列範囲を得、同様でした。各ペプチドの重水素取り込み値は、社内で開発FORTRANソフトウェアを使用して生成された理論的な分布で観察された同位体分布を当てはめることによって決定しました。最良フィッティング分布は関連重水素取り込み値とともに（ 図3a）に示されています。取り込み動態プロファイルが生成され、よく単一指数表現で記述されました。 3以上の標識時間で観察された全てのペプチドについての運動プロファイルは（n = 3）を分析しました。観察された取り込み値にこれらの単一指数関数フィットは、各ペプチドの為替レート定数k OBSをもたらします。これは、一次配列に依存する「ランダムコイル」固有速度定数k INTと比較されます。算出されたPF（K INT / K &lt;/ EM&gt; OBS）、1.52<...

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

タンパク質の機能において、構造の柔軟性は極めて重要な役割を果たしています。時間分解エレクトロスプレーイオン化水素・重水素交換質量分析法の全体的な目的は、秩序だったタンパク質および無秩序なタンパク質において機能を駆動する急速な構造変化を調査することです。この手法は、電子結晶構造解析やNMRのような従来の古典的な高分解能技術では捉えきれない、一過性のタンパク質構造の特性評価など、構造生物学分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、ミリ秒の時間スケールで反応をモニタリングできることであり、これはループ領域やモルティン球状構造、および固有無秩序タンパク質の特性解析において重要です。この手法の意義は、神経変性疾患の治療へと展開されます。これらの疾患では、本質的に無秩序なタンパク質領域のミスフォールディングや凝集がしばしば関与しているためです。本手法は、構造的に不安定なタンパク質に関する知見を提供できるだけでなく、触媒回転を行う酵素や、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-リガンド相互作用のキャラクタリゼーションなど、他の系にも適用可能です。この手順を開始するために、レーザー彫刻機を用いて、標準的なPMM8ブロックに試薬導入用の入力チャネル、プロダイアリシスチャンバー、および出力チャネルをレーザー加工します。次に、ロータリーツールと1/64インチ厚のカットオフディスクを使用して、30ゲージのステンレス製金属キャピラリーを10 cmの2本に切断します。キャピラリーの端をサンドペーパーで平滑にしますが、この作業は光学顕微鏡下で観察しながら行うと効率的です。次に、半田ごてを使用して、そのキャピラリーをエッチング済みのPMM8ブロックに溶かし込みます。連続フロー時間分解速度論ミキサーを構築するには、40 cmの溶融石英ガラスキャピラリーを、約15 cmの28ゲージ鋼製金属キャピラリーに挿入します。次に、低出力のレーザー彫刻機の設定を用いて、内側のガラスキャピラリーの一端に2 mmのノッチを作成し、内側のガラスキャピラリーのこの端を密封します。これは、タンパク質を直交的かつ効率的に混合させるための重要なステップであり、タンパク質は共通のdeteriorにあるノッチを通って流出します。ノッチからキャピラリー末端までの2 mmのキャピラリー間隙が混合ボリュームとなります。適切なサイズのフィッティングとチューブスリーブを取り付け、deteriumを導入するために使用するTコネクターを組み込みます。次に、光学顕微鏡で観察しながら、内側のガラスキャピラリーを金属キャピラリーの端と合わせます。ここを0 mmの位置としてマークしてください。このキネティックミキサーをミキシングTの一端に取り付けます。続いて、ミキシングT上のキネティックミキサーの反対端に、40 cmの溶融石英ガラスキャピラリーを取り付けます。ペプシンの活性化には、Porsena社の胃粘膜由来ペプシン 20 mgを1 mLのカップリング緩衝液に懸濁させます。NHS活性化アグロビーズ50 milligramsを再懸濁したタンパク質に加え、4 °Cで一晩穏やかに回転混和させます。翌日、室温で1,000 ×gで2分間遠心分離し、レジンを回収します。その後、未結合のタンパク質を吸引除去します。続いて、アガロースを1 mLのブロッキングバッファー中で、室温で1時間緩やかに回転させながらインキュベートします。レジンを回収し、ブロッキングバッファーを吸引後、ペプシン処理したアガロースを5%酢酸1 mLとともに5分間インキュベートします。室温で1,000 ×gで2分間遠心分離してレジンを回収し、上清を吸引します。前述の手順を繰り返し、計3回の洗浄を行った後、長期保存用にビーズを1 mLの酢酸中で4 °Cで保存します。デバイスを組み立てるには、滅菌スパチュラを用いて、5%酢酸中の活性化ペプシンアガロースビーズのスラリーをプロテオリシスチャンバーに充填します。デバイスを密封するためのカバーとして、PMMAマイクロ流路プラットフォームを2つの空白のPMMAブロックの間に配置し、シリコンゴムを敷いて液漏れのないシールを作成します。金属製クランププレートを使用してデバイスを圧力シールします。次に、適切なフィッティングを用いてミキシングTをデバイスの入口に取り付けます。これで、酸ラインに5%酢酸を10 µL/minの速度で流します。次に、50 mMのアンモニア酸緩衝液を、1 µL/minの流速でタンパク質ラインに流します。調整可能な絶縁ステージを用いて、デバイスを改良型四重極飛行時間型（Qtof）質量分析計のフロントエンドに接続し、最適なエレクトロスプレー条件を実現します。ESI-MSの条件設定後、ペプシンのみのスペクトルを取得します。次に、50 mM 酢酸アンモニウム緩衝液が流れていた箇所に、50～100 µM の tau またはリン酸化 tau タンパク質を 1 µL/min の速度で導入します。データの収集前に、システムを少なくとも 10 分間平衡化させ、タンパク質のみのスペクトルを測定します。tau またはリン酸化 tau タンパク質の注入中に、T コネクタを介して D₂O を 3 µL/min の速度で導入し、キネティックミキサー内で反応させます。ラベル化時間を延ばすために、内部ガラスキャピラリーの位置を手動で引き戻し、混合時間を42 millisecondsから8 secondsに調整します。この際、引き戻しの間には少なくとも10 secondsの間隔を空けて、システムを平衡状態にしてください。このアニメーションは、典型的な実験のワークフローを示しています。タンパク質がノッチから流出し、対向して流れてくるduteriumと混合します。割り当てられた反応時間中に主鎖M8水素の交換が行われます。この時間は、タンパク質キャピラリーを後退させることで調整可能です。その後、反応を停止させ、出口にESIニードルを備えたマイクロ流体プラットフォーム上で消化を行います。得られたスペクトルには、消化されたタンパク質が含まれています。重水素取り込み率は個々のペプチドについて算出され、その後、タンパク質の3D構造上にマッピングされます。ネイティブtauおよびリン酸化tauの消化プロファイルは同様であり、配列カバー率はそれぞれ77.1%および71.7%でした。ここでは、4つの単純なペプチドについて、最も適合する同位体分布とそれに関連する重水素取り込み値を示します。各ペプチドにおける重水素取り込み率の時間に対する観測速度論プロットを用いて、観測された実験速度を抽出します。計算されたランダムクオラ・プロファイルが比較のために示されており、これを用いて理論的な固有グレードを抽出します。予想通り、通常二次構造要素に関連付けられる範囲にプロテクションファクターは観察されず、天然のtauが弱い内部水素結合を示すことが確認されました。N末端およびC末端、中央ドメイン、および凝集しやすい領域において、有意なプロテクションが観察されます。過剰リン酸化に関連するtauにおいて、タンパク質全体で重水素取り込みの全般的な増加が観察されました。N末端、C末端、およびヘキサペプチド2領域において顕著な増加が見られます。保護因子の程度は、ここに示すようにレインボーカラーで色分けされています。この手法を習得すれば、適切に実施することで数時間で完了させることができます。本手順を行う際は、分析の妨げとなるコンタミネーションを最小限に抑えるため、HPCグレード以上の精製度を持つ領域を使用することが重要です。本手順の後、3次元タンパク質構造を照合したり、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-リガンド相互作用の領域を確認したりするために、共有結合ラベル化、化学的架橋、コンピューターモデリング、ドッキングスタディなどの他の手法を実施することが可能です。この技術の開発により、構造生物学分野の研究者が、神経変性疾患に多く見られる天然変性タンパク質およびドメインを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、タンパク質の構造とダイナミクスの研究において、時間分解エレクトロスプレーイオン化、水素・重水素交換、質量分析法をどのように使用するかについて、十分な理解を得ることができます。

time-resolved-electrospray-ionization-hydrogen-deuterium-exchange

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 - リガンドとタンパク質 - タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。...

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

ここでは、固体粉末中のタンパク質に対する固体アミド水素/重水素交換質量分析(ssHDX-MS)および固体光分解標識質量分析(ssPL-MS)の詳細なプロトコルを紹介します。この手法は、アモルファス固体におけるタンパク質の立体構造と相互作用に関する高分解能情報を提供し、製剤設計に役立つ可能性があります。...

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々...

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・...

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。...

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。...

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。...

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

単量体α-シヌクレインの構造アンサンブルは、その生理学的機能および物理化学的特性に影響を及ぼす。本プロトコルは、ミリ秒の水素/重水素交換質量分析およびその後のデータ分析を実行して、生理学的条件下でこの本質的に無秩序なタンパク質のモノマー上の立体構造情報を決定する方法を記載する。...

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

学ぶ時間分解エレクトロスプレーイオン化水素-重水素交換質量分析法で、タンパク質の急速な構造変化をミリ秒スケールで解析します。構造生物学における秩序タンパク質と無秩序タンパク質のダイナミクス解明に役立ちます。

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

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