時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

コンフォメーションの柔軟性はタンパク質の機能に重要な役割を果たしており、時間分解ElectroSprayイオン化水素-重水素交換質量分析の全体的な目標は、秩序化および無秩序なタンパク質の機能を推進する急速な構造変化を調査することです。この方法は、一過性タンパク質確認のクレーター化など、エレクトロシストグラフィーやNMRなどの従来の高分解能技術までは最小限ではない、構造生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ループリッジ、モルチングロビヤール、および天然変性タンパク質の特性評価に重要なミリ秒の時間スケールで反応をモニターできることです。

この技術の意味は、神経変性疾患の治療にまで及びます。それらはしばしばミスフォールディング、または天然変性タンパク質領域の凝集を伴うためです。この方法は、毎週の構造タンパク質に関する洞察を得ることができますが、触媒代謝回転を受ける酵素や、タンパク質、タンパク質、およびタンパク質、ライガン、相互作用の特性評価など、他のシステムにも適用できます。

この手順を開始するには、レーザー彫刻機を使用して、試薬を導入するための入力チャネル、プロ透析チャンバー、および出力チャネルを介してプレートをレーザー化します。これに続いて、30ゲージのステンレス鋼製キャピラリーを回転工具を使用して10センチメートルの2つのピースに切断します 164インチの厚さのカットオフディスク。サンドペーパーを使用して毛細血管の端を滑らかにしますが、これは光学顕微鏡で観察することで容易になります。

次に、そのキャピラリーをエッチングされたPMM8ブロックに溶かします。連続フローの時間分解キネティックミキサーを構築するには、40センチメートルの溶融シリカガラスキャピラリーを約15センチメートルの28ゲージのスチール製金属キャピラリーに挿入します。次に、内側のガラスキャピラリーの一端に低出力のレーザー彫刻機の設定を使用して2ミリメートルのノッチを作成し、内側のガラスキャピラリーのこの端をシールします。

これは、タンパク質の直交的かつ効率的な混合を確保する重要なステップであり、タンパク質はノッチを介して排出されます。ノッチとキャピラリーの端部との間の2ミリメートルのキャピラリー間スペースは、混合物と体積です。適切なサイズのフィッティングとチューブスリーブを取り付け、劣化をもたらすために使用されるTコネクタを組み込みます。

次に、内側のガラスキャピラリーを金属キャピラリーの端に並べると、光学顕微鏡で観察することで容易になります。これを 0 ミリメートルの位置としてマークします。このキネティックミキサーをミキシングT.Thenのキネティックミキサーの反対側の端に40センチメートルの溶融シリカガラスキャピラリーを取り付けますミキシングT.For pepsin活性化のために、カップリングバッファーの1ミリリットルにPorsenaガス性粘膜から20ミリグラムのペプシンを懸濁します。

NHSが活性化した50ミリグラムのアグロスピードを再懸濁したプロチエンに加え、一晩中摂氏4度で穏やかに回転させます。翌日、Gの1000倍で室温で2分間スピンダウンし、樹脂を回収します。次に、バインドされていないprotiyesを吸引します。

その後、アグロスを1ミリリットルのブロッキングバッファーでインキュベートし、室温で1時間穏やかに回転させます。樹脂を回収し、ブロッキングバッファーを吸引した後、ペプシンアグロスを1ミリリットルの5%酢酸と5分間インキュベートします。混合物をGの1, 000倍で、室温で2分間スピンダウンして樹脂を収集し、次にスーパーナテントを吸引します。

上記の手順を繰り返した後、合計3回の洗浄を行い、ビーズを1ミリリットルのアセデン酸に摂氏4度で保存して長期間使用してください。デバイスを組み立てるには、滅菌スパチュラを使用して、5%酢酸中の活性化ペプシンアグロスビーズのスラリーをプロティアリシスチャンバーに充填します。PMMAマイクロファリティックプラットフォームは、デバイスをシールするためのカバーとして2つのブランクPMMAブロックの間に置き、シリコーンゴムで裏打ちされて液密シールを作成します。

金属製のクランププレートを使用して、デバイスを圧力シールします。次に、適切なフィッティングを使用して、ミキシングTをデバイスの入口に取り付けます。今流れ5パーセントの酢酸は、毎分10マイクロリットルの速度で酸ラインを考えました。

次に、50ミリメートルのアモニア酸緩衝液を1分あたり1マイクロリットルの速度でタンパク質ラインに流します。デバイスを改造された四重極飛行時間、またはQtof質量分析計のフロントエンドに結合し、調整可能な絶縁ステージを使用して最適なエレクトロスプレー条件を実現します。ESI-MS条件を設定した後、ペプシンのみのスペクトルを取得します。

次に、50〜100マイクロモルのタウ、またはホスホタウタンパク質を、50ミリメートルの酢酸アモニウム緩衝液が以前に流れていたところに、1分間に1マイクロリットルの速度で導入する。システムを少なくとも 10 分間平衡化した後、取得前に、タンパク質のみのスペクトルを取得します。タオ、またはリン酸化タオタンパク質が流れている間に、Tコネクタを介して毎分3マイクロリットルの速度でデュテリウムオキシドを導入し、キネティックミキサーで反応させます。

ラベリング時間を長くするには、内側のガラスキャピラリーの位置を手動で引き戻して、42ミリ秒から8秒の混合時間を達成し、各プルバックの間にシステムが少なくとも10秒間平衡化できるようにします。このアニメーションは、一般的な実験のワークフローを示しています。タンパク質はノッチから出て、迫り来るデュテリウムと混合します。

バックボーンM8水素は、割り当てられた反応時間内に交換され、タンパク質の毛細血管を引き戻すことで変化させることができます。その後、反応液を急冷し、出口ESI針を含むマイクロ流体プラットフォーム上で消化します。得られたスペクトルには、消化されたタンパク質が含まれています。

重水素の取り込みの割合は、個々のペプチドについて計算され、3Dタンパク質構造にマッピングされます。ネイティブとリン酸化タウの消化プロファイルは類似しており、それぞれ77.1%と71.7%の配列カバー率が得られ、4つの単純なペプチドの最適な同位体分布と関連する重水素取り込み値をここに示しています。各ペプチドの重水素取り込み率と時間比の観測速度論プロットを使用して、観察された実験速度を抽出します。

計算されたランダムクエールプロファイルは比較のために示され、理論的な固有グレードを抽出するために使用されます。予想通り、この範囲では保護因子は観察されず、通常は二次構造要素に関連するため、天然のタウは内部の水素結合が弱いことが確認されました。N末端とC末端、中央ドメイン、および凝集プロニング領域で有意な保護が観察されます。

高リン酸化関連タウでは、タンパク質全体の重水素取り込みに一般的な増加が観察されました。N末端とC末端、およびヘキサペプチドの2つの領域で有意な増加が見られます。保護係数の程度は、次に示すように虹色の配色として色付けされています。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、数時間で実行できます。この手順を試行する際は、分析に干渉する可能性のある汚染物質を最小限に抑えるために、HPCグレード以上の領域を使用することが重要です。この手順に続いて、共有結合標識、化学的架橋、計算モデリング、ドキュスタディなどの他の方法を実行して、3次元タンパク質構造を一致させたり、タンパク質タンパク質とタンパク質レギンの相互作用の領域を確認したりすることができます。

その開発後、この技術は、構造生物学の分野の研究者が、神経変性疾患で最も一般的な天然変性タンパク質とドメインを探索する道を開きました。このビデオを見れば、タンパク質の構造とダイナミクスの研究に、時間分解エレクトロスプレーイオン化、水素重水素交換、質量分析をどのように使用するかを十分に理解できるはずです。