Name: 蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶ 蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量法。この簡便なイメージング解析により、膜輸送を時短で解析し、神経機能の理解を深めます。

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この分析の開発を手伝ってくださったRicardo Dolmetsch博士（スタンフォード大学医学部、現在のNovartis Institute for Biomedical Research）、Matthew Wood博士、Aihara Takuma、およびDongsook Kimの原稿の批判的読解に感謝します。

すべての動物の手技は、つくば動物管理委員会（IACUC）の承認を得て行われた。 1.解剖<ol><li>胎生13-14日のICRまたはC57BL / 6胎仔を準備するために、妊娠したマウスを頸椎脱臼により安楽死させる。子宮を取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を入れたペトリ皿に入れます。血液をすすぎ洗いしてください。 </li><li>鉗子を使用して、70％エタノールで新しいペトリ皿に子宮を移して滅菌します。 </li><li>子宮をHBSSで新しいペトリ皿に移す。消毒された解剖鉗子と手術はさみを使用して子宮から胎児を除去する。 </li><li>外科用ハサミを使って胎児を断つ。 HBSSで新しいペトリ皿に入れてください。 </li><li>皮膚と頭蓋骨を取り外し、滅菌された解剖鉗子を使用して脳を取り出します。 HBSSでペトリ皿に入れてください。 注：この手順を実行すると、手順はクリーンな状態で実行することをお勧めしますベンチ。 </li><li>ステレオ顕微鏡下で滅菌された解剖鉗子を使用して髄膜を除去する。鉗子を用いて基底核、海馬、および小脳を切断する。曲がった先端の鉗子を使用して、HBSSで新しいペトリ皿に皮質を移す。 </li><li>使い捨てのドロッパーまたは25mLのピペットを使用してすべての皮質を収集する。 15 mLのチューブに入れ、ピペットでHBSSを除去する。 </li><li>皮質を含むチューブに3mLの大脳皮質酵素溶液を加える。このチューブを水浴に入れ、37℃で5分間インキュベートする。 注：0.25％トリプシンおよび1mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）からなる大脳皮質培養酵素を調製する。 0.22μmフィルターで滅菌する。 </li><li>脳皮質酵素溶液3mLを皮質を含むチューブに加え、水浴中37℃でさらに5分間インキュベートする。 </li><li> 5mLのピペットを用いて大脳皮質の酵素溶液を除去し、5mLのDulbe10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するccoの修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。 </li><li>滅菌P1000チップを備えた5mLピペットを使用して上下に穏やかにピペットで皮質を解離させる。 P200先端を有する5mLピペットを用いて再度ピペットをかける。 </li><li> 40μmナイロンセルストレーナーを50mLチューブに入れ、懸濁液を濾過して残渣を除去する。 </li><li>室温で5分間420xgで遠心分離し、次いでDMEM培地を除去する。 </li><li>大脳皮質培養培地5mLを添加し、穏やかに細胞ペレットを再懸濁する。 注：1×B - 27サプリメント、2mM L - グルタミン、100U / mLペニシリンストレプトマイシンを補充したニューロン基底培地からなる大脳皮質培養培地を調製する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を計数し、大脳皮質培養培地を用いて細胞濃度を（必要に応じて）調整する。 </li><li>プレート3.0×10 6皮質ニューロンをコーティングされた35mmのガラス底のディッシュあたり2.0mLに入れた。 注：めっきする前に、0.1mg / mLのポリ-D-リシン臭化水素酸塩（PDL）または0.01％ポリ-L-オルニチン（PLO）を含む35mmのガラス底の皿。 37℃で3時間インキュベートし、少なくとも3回PBSで洗浄する。 </li></ol>イメージングベシクルの運動性<ol><li>それぞれのタイプの小胞を標識するプラスミドを準備する。例えば、早期エンドソームにはEGFP-Rab5、後期エンドソームにはEGFP-Rab7、リソソームにはLAMP-EGFP、オートファゴソームにはEGFP-LC3を使用します8,13。 注：これらのプラスミドは、tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jpから要求に応じて入手できます。典型的には、トランスフェクション試薬を用いて3〜5日間のインビトロ （DIV）ニューロンをこれらのプラスミドでトランスフェクトすることができる。 </li><li> 4.0μgのプラスミドを200μLの無血清培地とピペットで混合する。別のチューブで、200μLの無血清培地に8μLのトランスフェクション試薬（ 表の表を参照 ）を希釈する。 RTで5分間インキュベートする。 </li><li>ステップ2.2のプラスミド溶液とトランスフェクション試薬溶液をピペットで混合する。 RTで20分間インキュベートする。 </li><li>ステップ2.3からの無血清培地および400μLのプラスミド溶液を各コートガラス底ディッシュに添加する。ニューロンを37℃、5％CO 2インキュベーターで30分間インキュベートする。 2mLの大脳皮質培養培地で培地を交換する。 1~2日間5％CO 2インキュベーターで37℃でニューロンをインキュベートする。 </li><li>トランスフェクションの1〜2日後、画像取得のためにトランスフェクションされた細胞を選択する。 注：7 DIV未満の時期尚早なニューロンは、動的小胞運動性を示す傾向がある。高度に発現するニューロンが選択された場合、鮮明な画像が得られないため、蛍光プローブを適度に発現するニューロンを選択する。また、軸索および樹状突起の同定を容易にするために、長い軸索および複雑な樹状突起を有するピラミッドニューロンなどの典型的なニューロン形状を選択する（ 図1A）。 </li><li>タイムラプス画像システムを用いた画像取得： イメージングには、40X Plan Apo 0.95NAまたは100X Plan Apo VC NA1.4対物レンズを備えた電荷結合素子（CCD）カメラを備えた蛍光顕微鏡を使用します。インキュベーションシステムを使用して37℃で温度を制御する。画像取得ソフトウェアによって制御される100秒の期間にわたって、1フレーム/ 5秒でニューロン画像を取得する。あるいは、300秒間に1秒間に1フレームなど、より短い間隔で、より長い時間間隔で画像を取得することもできます。 注記：シーケンシャル画像の撮影にはさまざまなアプリケーションがあり、その多くはこの方法に適しています。したがって、特定のアプリケーションは推奨されません。むしろ、各研究者は利用可能なアプリケーションを使用する必要があります。 </li></ol> 3.画像解析<ol><li> Manual Tracking 14を使用してImageJソフトウェアですべての連続画像を開きます。 注：これまでのところ、手動​​トラッキングはwi追跡実験15,16,17,18,19に使用されている。マニュアルトラッキングは、Dr. FabriceCordelièresによって開発されました。詳細な説明書はオンラインで入手できます20 。分析のために、十分な数の画像を用いて画像データの品質が改善される。 20枚以上の画像を使用することをお勧めします。 </li><li>連続イメージを結合するには、&lt;イメージ&gt;→&lt;スタック&gt;→&lt;イメージをスタック&gt;を選択します。 &lt;OK&gt;をクリックします。 </li><li> &lt;プラグイン&gt;→&lt;手動トラッキング&gt;を選択します。トラッキングウィンドウがポップアップ表示されます。 </li><li> &lt;Show Parameters？&gt;のチェックボックスをクリックし、パラメータセクションでトラッキングパラメータを定義します。 注：時間間隔、x / y校正、z校正、中心のスクエアサイズの検索を含むいくつかのパラメータを設定することができますドットサイズ、線幅、およびフォントサイズを指定します。この単純化されたアッセイでは、時間間隔およびx / y較正の両方が定義された。他の実験環境下では、他のパラメータも定義する必要があるかもしれない。ここで使用されるパラメータは以下のとおりです：40X Plan Apo 0.95NA対物レンズでは&lt;Time interval&gt;が5秒、&lt;x / y calibration&gt;は0.26642μm、100X Plan Apo VC NA1.4では0.10657μmです対物レンズ。 </li><li>パラメータが定義されたら、&lt;add track&gt;をクリックして新しいトラックを開始します。 </li><li>関心のある小胞（ 例えば、 図1A （右パネル）の青と赤の矢印で示される小胞）を決定した後、連続画像のシグナルの中心をクリックしてxy座標を記録する。記録されたxy座標、距離、速度の結果が新しいウィンドウに表示されます。 注：リソソームの場合、大きな明るい蛍光シグナル（ 例えば、 Fig。ure 1A（右のパネル）、オレンジの矢頭）がしばしばニューロンで観察される。これらの信号は時折、蓄積された小胞または病的な静脈瘤のいずれかを示すので、これらの信号は運動性を定量化するために避けるべきである。 </li><li>ステップ3.6を繰り返して、すべての連続画像からベシクルのxy座標を収集する。各画像は、基準点が選択された後、自動的に連続画像に進む。 </li><li>これらのデータを新しい表（スプレッドシートなど）にエクスポートします。適切なソフトウェアを使用して適切なグラフを作成します（材料表を参照 ）。 注：データを分析するには、&lt;距離&gt;列を選択し、この列のすべての値を合計し、 図1Bに示すように運動性距離を棒グラフとして表示します。さらに、このステップを繰り返し、全運動距離の平均を計算し、 図1Cのように棒グラフとして表示します。バーグラフと波形データを作成するソフトウェアは、材料のテーブル。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、小胞の運動性を定量化するための手順を導入する。初代ニューロンにおいて、エンドソームおよびリソソームは、より若いニューロン（4-6DIV）において高い運動性を示す傾向がある。ニューロンが神経プロセスを伸長させるためにいくつかの成分を先端縁に送達しなければならないことを考えると、この段階で膜輸送が動的に起こるはずである。したがって、ニューロン樹状突起における動的運動性を観察するためには、より若いニューロンを用いることが重要である。さらに、より大きい小胞は、より若いニューロンにおいてさえ、高い運動性を示す傾向がない。ベシクルサイズの調節は、融合 - 核分裂段階の頻度に関与している可能性が高い。動的に移動しない特定の小胞は、他の小胞を容易に受け入れやすく、それらの動きを終わらせる可能性があります。従って、小胞の選択は、この分析のための重要なプロセスである。 オブジェクト21を追跡するためにいくつかのフリープラグインソフトウェアパッケージが利用可能である。たとえば、トラックメイトパッケージはオブジェクト<sup class="...

エンドソーム - リソソームの輸送の正確な制御は、神経機能を調節するために不可欠です。特に、これらの小胞の動的な動きは、ニューロンの形態、発達および生存の調節の根底にある重要な因子である。このシステムの欠陥は、重度のニューロン障害を引き起こす1,2 。小胞輸送をニューロン疾患に結びつける分子メカニズムは複雑であると考えられ、いくつかのグループがこの関連性を調べようとしている。例えば、摂動した後期エンドソーム運動が、リソソーム欠損に起因する遺伝的神経変性疾患であるNiemann-Pick C疾患3と有意に関連することが報告されている。もう1つの例は、リソソームCa 2+チャネルの突然変異であり、これはリソソーム運動性を損ない、リソソーム蓄積疾患4,5 、 </6 。我々のグループは、PtdIns（3,5）P 2代謝回転の調節不全が、ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの運動性を抑制し、ストレス反応に対する脆弱性を増加させることを報告している7,8 。主に後期エンドソームおよびリソソームに局在するPtdIns（3,5）P 2の代謝調節は、小胞輸送および融合核分裂プロセスを含む広範囲の細胞機能において重要な役割を果たす9,10 。損傷したPtdIns（3,5）P 2代謝回転は重度の神経変性を引き起こすので、エンドソーム - リソソームの運動性の異常調節は、神経変性の病因を理解するための重要な要因となり得る。小胞の運動性の基礎をなす分子メカニズムの研究は、このようにして、我々のundeを深めることができる有望な手掛かりを提供するかもしれないいくつかのニューロン障害を呈する。 本稿では、手動トラッキングと呼ばれるフリーソフトウェアパッケージを使用して、ニューロンの小胞の運動性を定量化する貴重な方法を紹介します。目的は、小胞の運動性を分析するための高速定量法を開発することでした。この定量化は、タイムラプス映画の各フレームの基準点をクリックするという標準的なアプローチによって行われます。 Manual Trackingソフトウェアを使用することで、このアプローチは他のアプリケーションとは異なり、非常に簡単で幅広いユーティリティになります。さらに、このアプローチは、グリア細胞のような他の細胞にも適用可能である。この方法は原始的であるが、細胞運動性および形態学的変化を含む様々な分析に適用することができる。例えば、一連の画像にわたって基準点を定義した後、データ解析および画像処理ソフトを使用して、連続画像から基準点の位置および各位置における時間に関する情報を抽出することができる陶器。まとめると、この方法は単純で強力であり、エンドソーム - リソソーム機能を調べるような膜輸送に基づく研究における効率の改善の開発に寄与する。

<table><tbody><tr><td>神経基礎培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)</td><td>和光</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985070</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2.5%トリプシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩(PDL)</td><td>シグマ</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン(PLO)</td><td>シグマ</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンセルストレーナー</td><td>コーニング</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11668027</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン "Max" (PEI)</td><td>polysciences</td><td>24765</td><td>トランスフェクション試薬.Lipofectamine2000の代替として、滅菌水に溶解した0.1mg/mLのポリエチレンイミンが利用可能です。しかし、それは低効率で毒性が高いです。</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>キーエンス</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションシステム INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel version 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

脳において、膜輸送システムは、ニューロンの形態、シナプス可塑性、生存およびグリアの通信などのニューロン機能の調節において重要な役割を果たす。今日まで、これらの系の欠陥が様々なニューロン疾患を引き起こすとの多数の研究が報告されている。したがって、ベシクル動態の根底にあるメカニズムを理解することは、いくつかのニューロン障害の治療を助けることができる影響力のある手掛かりを提供し得る。ここでは、ImageJプラットフォームのソフトウェアプラグインを使用して、運動距離や移動速度などの小胞の運動量を定量化する方法について説明します。定量化のための画像を得るために、EGFP標識小胞マーカータンパク質を用いてニューロンエンドソーム - リソソーム構造を標識し、経時顕微鏡法を用いて小胞の動きを観察した。この方法は非常に有用であり、軸索および樹状突起のような神経突起ならびにニューロンおよびグリア細胞の細胞の小胞における小胞の運動性の測定を単純化する。さらにこの方法は、線維芽細胞および内皮細胞のような他の細胞株にも適用することができる。このアプローチは、膜輸送の理解の価値ある進歩を提供することができます。

このアッセイは、インビトロ培養における小胞の動態を測定するために設計された。このアッセイを利用して、ニューロンの形態および生存に関連する小胞の運動性を決定した。 図1AおよびBは、ニューロンにおけるリソソームの運動性を示す代表的なデータを示す。皮質ニューロンにリソソームマーカーLAMP-EGFPをトランスフェクションし、標準蛍光顕微鏡を用いて観察した。特定のエンドソーム - リソソーム小胞は、休止ニューロンにおいてさえ、高度に可動性であることが以前に報告されている8 。実際に、これらの結果は、同じデンドライト（ 図1AおよびB ）中の休止小胞および移動小胞の両方を示す 。通常、静止小胞は、ニューロンの樹状突起におけるブラウン...

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

このイメージング解析の全体的な目標は、ニューロンの小胞の運動性を観察し、それを容易に定量化することです。このアプローチにより、ニューロンの膜輸送を簡単かつ時間効率の良い方法で分析できます。この手順を開始するには、子宮を70%エタノールを含む新しいシャーレに移します。次に、子宮をHBSSで別のペトリ皿に移します。次に、滅菌された解剖鉗子と外科用ハサミを使用して子宮から胎児を取り出します。その後、HBSSを入れた新しいシャーレに入れます。実体顕微鏡で皮膚と頭蓋骨を切除し、滅菌した解剖鉗子を使用して脳を取り出します。次に、HBSSを使用して別のシャーレに移します。滅菌された解剖鉗子を使用して髄膜を取り除きます。次に、余分な領域を切り取ります。次に、HBSSを使用して皮質を新しいシャーレに移します。使い捨てのスポイトまたは25ミリリットルのピペットを使用してすべての皮質を採取し、15ミリリットルのチューブに入れます。その後、ピペッティングでHBSSを取り出します。次に、皮質を含むチューブに3ミリリットルの大脳皮質酵素溶液を追加します。チューブを水浴に入れ、摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、皮質を含むチューブにさらに3ミリリットルの大脳皮質酵素溶液を加え、摂氏37度で水浴中でさらに5分間インキュベートします。5分後、大脳皮質酵素溶液を取り出し、10%ウシ胎児血清を含むDMEMを5ミリリットル加えます。滅菌済みのP1000チップを備えた5ミリリットルのピペットを使用して、穏やかにピペッティングして皮質を解離します。次に、P200チップ付きの5ミリリットルピペットを使用して、皮質を再度ピペットで固定します。40ミリリットルのチューブに50マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを置き、懸濁液をろ過して破片を取り除きます。その後、懸濁液を室温で420倍gで5分間遠心分離し、DMEM培地を除去します。その後、5ミリリットルの大脳皮質培養培地を加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、脳皮質培養培地を使用して細胞濃度を調整します。次に、コード化された35ミリリットルのガラス底皿ごとに2ミリリットルの細胞懸濁液中に6つの皮質ニューロンに10回3回プレートする。この手順では、4マイクログラムのプラスミドを200マイクロリットルの無血清培地と混合します。別のチューブで、トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを200マイクロリットルの無血清培地で希釈します。次に、溶液を室温で5分間インキュベートします。5分後、プラスミド溶液とトランスフェクション試薬溶液を混合し、室温で20分間インキュベートします。その後、コード化されたガラス底皿に混合物を追加します。ニューロンを摂氏37度で30分間インキュベートします。その後、培地を2

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。...

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。...

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する...

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

このビデオでは、ニューロン小胞が特定の蛍光タンパク質で標識され、その動きを視覚化する方法を示しています。まず、蛍光タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクション剤とインキュベートし、次にニューロンの培養物に導入します。その後、ニューロンの画像を取得して分析し、小胞の動きを追跡します。...

蛍光イメージングによるニューロンの小胞運動の可視化

小胞や細胞小器官などの貨物の細胞内輸送は、分極した微小管を追跡する分子モータータンパク質によって行われます。このプロトコルは、ニューロン内を移動する個々の貨物粒子の輸送の方向性と、関連するモータータンパク質の相対的な量とタイプとの相関関係を説明しています。...

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。...

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

この論文では、生きた線虫の内因性標識カーゴの軸索輸送を単一ニューロン分解能で視覚化するための蛍光顕微鏡取得パラメータの最適化について説明しています。...

Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

学ぶ 蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量法。この簡便なイメージング解析により、膜輸送を時短で解析し、神経機能の理解を深めます。

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

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