蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量
2017年5月22日
膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。
このイメージング解析の全体的な目標は、ニューロンの小胞の運動性を観察し、それを容易に定量化することです。このアプローチにより、ニューロンの膜輸送を簡単かつ時間効率の良い方法で分析できます。この手順を開始するには、子宮を70%エタノールを含む新しいシャーレに移します。
次に、子宮をHBSSで別のペトリ皿に移します。次に、滅菌された解剖鉗子と外科用ハサミを使用して子宮から胎児を取り出します。その後、HBSSを入れた新しいシャーレに入れます。
実体顕微鏡で皮膚と頭蓋骨を切除し、滅菌した解剖鉗子を使用して脳を取り出します。次に、HBSSを使用して別のシャーレに移します。滅菌された解剖鉗子を使用して髄膜を取り除きます。
次に、余分な領域を切り取ります。次に、HBSSを使用して皮質を新しいシャーレに移します。使い捨てのスポイトまたは25ミリリットルのピペットを使用してすべての皮質を採取し、15ミリリットルのチューブに入れます。
その後、ピペッティングでHBSSを取り出します。次に、皮質を含むチューブに3ミリリットルの大脳皮質酵素溶液を追加します。チューブを水浴に入れ、摂氏37度で5分間インキュベートします。
その後、皮質を含むチューブにさらに3ミリリットルの大脳皮質酵素溶液を加え、摂氏37度で水浴中でさらに5分間インキュベートします。5分後、大脳皮質酵素溶液を取り出し、10%ウシ胎児血清を含むDMEMを5ミリリットル加えます。滅菌済みのP1000チップを備えた5ミリリットルのピペットを使用して、穏やかにピペッティングして皮質を解離します。
次に、P200チップ付きの5ミリリットルピペットを使用して、皮質を再度ピペットで固定します。40ミリリットルのチューブに50マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを置き、懸濁液をろ過して破片を取り除きます。その後、懸濁液を室温で420倍gで5分間遠心分離し、DMEM培地を除去します。
その後、5ミリリットルの大脳皮質培養培地を加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、脳皮質培養培地を使用して細胞濃度を調整します。次に、コード化された35ミリリットルのガラス底皿ごとに2ミリリットルの細胞懸濁液中に6つの皮質ニューロンに10回3回
プレートする。この手順では、4マイクログラムのプラスミドを200マイクロリットルの無血清培地と混合します。別のチューブで、トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを200マイクロリットルの無血清培地で希釈します。次に、溶液を室温で5分間インキュベートします。
5分後、プラスミド溶液とトランスフェクション試薬溶液を混合し、室温で20分間インキュベートします。その後、コード化されたガラス底皿に混合物を追加します。ニューロンを摂氏37度で30分間インキュベートします。
その後、培地を2ミリリットルの大脳皮質培養培地と交換し、ニューロンを摂氏37度で1〜2日間インキュベートします。イメージングには、40倍の対物レンズを備えたCCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用します。インキュベーションシステムを使用して温度を摂氏37度に保ちます。
画像取得ソフトウェアによって制御される100秒間、5秒ごとに1フレームのニューロン画像を取得します。画像を分析するには、ImageJソフトウェアのManual Trackingですべての連続画像を開きます。シーケンシャルイメージを組み合わせるには、「イメージ」、「スタック」、「スタックするイメージ」の順に選択し、「OK」をクリックします。その後、[Plugins] (プラグイン) を選択し、[Manual Tracking] (手動追跡) を選択します。
追跡ウィンドウがポップアップ表示されます。Show Parameters のチェックボックスをクリックし、Parameters セクションでトラッキングパラメータを定義します。次に、[トラックの追加] をクリックして新しいトラックを開始します。
対象の小胞を決定したら、シーケンシャル画像内の信号の中心をクリックして、xy座標を記録します。この手順を繰り返して、すべての連続した画像から小胞のxy座標を収集し、参照点が選択された後、各画像は自動的に連続する画像に進みます。この画像は、4 DIV で開始した 2 日間のトランスフェクション後の、マウス皮質ニューロンの樹状突起に小胞を含む LAMP-EGFP の運動性を示しています。
挿入図は、LAMP-EGFP陽性小胞のタイムラプス画像を示しています。赤い矢印は動いている小胞を示し、青い矢印の先端は休息している小胞を示しています。オレンジ色の矢印は、蛍光シグナルが高いことを示しています。
これは、LAMP-EGFP正小胞の時間依存のX軸位置です。赤い円の中の小胞(bとラベル付け)は動いており、青い円の中の小胞(aとラベル付けされている)は静止しています。この棒グラフは、LAMP-EGFPの移動距離の合計を示しています。
そして、この棒グラフは、小胞を含むLAMP-EGFPの平均運動距離を示しています。
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概要
本研究では、ニューロンにおける小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これはニューロンの機能を理解する上で不可欠であり、本手法を用いることで、神経系における膜トラフィッキングの簡便な解析が可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 膜交通
背景
- 膜輸送はニューロンの機能にとって極めて重要です。
- 小胞の運動はこのプロセスにおいて重要な役割を果たしています。
- これらのメカニズムを理解することで、ニューロンの健康状態に関する知見を得ることができます。
- 小胞の運動を定量化する現在の手法は、複雑な場合が多くあります。
研究目的
- 小胞輸送の定量化のための簡便な手法を開発すること。
- ニューロンにおける膜輸送の解析を容易にすること。
- 手法の改善を通じて、ニューロン機能への理解を深めること。
使用方法
- 小胞の運動性を観察するためのイメージング解析。
- 解析用に生物学的サンプルを適切な培地へ移送すること。
- サンプル操作における滅菌器具の使用。
- 定量化のための時間効率の良い手順。
主な結果
- この手法により、小胞の運動性を容易に定量化できます。
- 膜輸送を分析するための簡便なアプローチを提供します。
- 得られた結果は、神経細胞の機能のより深い理解に寄与します。
- さまざまな神経科学の研究領域への応用の可能性があります。
結論
- この手法により、ニューロンにおける小胞輸送の研究が簡便になります。
- 神経科学におけるさまざまな応用に適応させることが可能です。
- 今後の研究において、このアプローチを基盤としてニューロンの健康状態を探索することができます。
よくある質問
産業界における重要性
小胞の運動性を定量化することは、ニューロンの健康や疾患の表現型に影響を与える膜輸送メカニズムを理解する上で極めて重要な知見をもたらします。本手法は、神経変性モデルにおける細胞内ダイナミクスと機能的アウトカムを関連付けることで、初期段階のターゲットバリデーションを可能にします。このアプローチは、疾患に関連するニューロンシステムにおける小胞輸送の定量的かつ再現性のあるリードアウトを提供し、前臨床スクリーニングにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：エンドソームおよびリソソームの運動性を神経細胞の健全性の機能的リードアウトとして測定することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：疾患に関連する細胞モデルにおける小胞移動の標準化された定量化を通じて、生物学的リスクの低減を支援する。
- 予測的価値：運動性の欠損を神経疾患のメカニズム経路と相関させることで、ポートフォリオの優先順位付けを容易にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 神経突起および細胞体における化合物スクリーニングのため、運動距離と速度の定量的測定を実現します。
- 運用の価値： 定義されたパラメータによるImageJベースのトラッキングとタイムラプスイメージングにより、アッセイの再現性を確保します。
- 拡張性： 線維芽細胞や内皮細胞を含む複数の細胞型に対応しており、クロスプラットフォームでの再利用が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：小胞のダイナミクスをニューロンの生存およびシナプス機能に結びつけることで、トランスレーショナルなバイオマーカー戦略と整合させます。
- 運用の価値：モデル間で一貫した運動性の読み出しを行うことで、発見から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- リスク軽減：輸送欠損を回復させる化合物を特定することで、リスク調整後の進展決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、定量的な運動性データを提供することで、神経系におけるターゲット結合および経路調節に関する知見を導き出し、初期の創薬探索ワークフローへと統合されます。
- 探索生物学：膜輸送の完全性を機能的な読み取り値として小胞の移動を定量化することにより、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：時間依存的な小胞解析のための標準化されたイメージングおよびトラッキングプロトコルにより、アッセイの準備を可能にします。
- 分析：移動距離および平均移動指標を生成し、実験条件間での比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：小胞輸送の欠陥を神経変性疾患のメカニズムに関連付けることで、前臨床への継続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：多様な神経細胞および非神経細胞株に適用可能な、再利用可能なイメージングプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：輸送欠損とニューロン表現型の間のメカニズム的な関連性における曖昧さを軽減することで、予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：プラグインベースの解析と定義されたトラッキングパラメータにより、標準化と再現性を高める。
- 戦略的価値：小胞輸送経路におけるターゲット結合に関する客観的かつ定量的なデータを提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：疾患モデルにおいてエンドソーム・リソソームダイナミクスを調節する化合物を特定することで、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 正確な小胞のラベル付けおよびイメージングには、ニューロン培養、トランスフェクション、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- ImageJプラットフォームのManual Trackingプラグインおよびシーケンシャル画像処理機能に依存します。
- 実験全体を通じて、トランスフェクション効率、イメージングの間隔、およびトラッキングパラメータの標準化が必要です。
- 異なる細胞株に適応させる場合、マーカーの発現および運動性のベースライン測定の最適化が必要になる場合があります。
- 実際的な制限として、トランスフェクション効率への依存や、長時間のタイムラプスイメージング中の光毒性の可能性があります。
