Name: ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶブルーネイティブPAGEと質量分析を用いたタンパク質複合体のアフィニティー精製法。FLAGタグ付きタンパク質を200〜500百万個の細胞から精製し、相互作用ネットワークを高解像度で解析する効率的なプロトコルを解説します。

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この作業は、ウェルカムトラスト（WT098051）によって資金提供されました。

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、タンパク質複合体を解決するために、定量的質量分析と組み合わせたブルーネイティブゲル電気泳動、続いてアフィニティー精製の使用を記載しています。このアプローチは、機能性タンパク質アセンブリに1次元のタンパク質相互作用のリストを解明するための方法を提供しています。 私たちは、エピトープタグ融合タンパク質の使用に基づく方法を示しています。しかし、タグ付けされたタンパク質を発現する細胞株が利用できない場合、代替は、目的のタンパク質に対する抗体を使用するのが良いかもしれない、ネイティブの競合溶出を達成することが可能なペプチドが提供されます。出発材料とビーズの量の量は、標的タンパク質の発現レベルに応じて変更する必要があるかもしれません。我々は、典型的には、出発材料2-5×10 8細胞を用いて、このプロトコルを実行し、これも低い発現レベルを有するタンパク質に十分です。溶解緩衝液の組成は、達成するために経験的に選択されるべきです近くに餌の可溶化を完了します。これは、特定のクロマチン結合または膜タンパク質で、タンパク質のいくつかのタイプのために挑戦される可能性があります。代替オプションは、研究下のタンパク質複合体は、高塩、またはクロマチン結合タンパク質20、29のための超音波処理および/またはヌクレアーゼ処理を使用して安定しているという条件で、塩の量を増加させることを含みます。膜タンパク質の場合には、DDMまたはジギトニンに洗剤を切り替えは30が望ましいことがあります。 DNA結合タンパク質の場合、精製工程20中にこのようなベンゾナーゼヌクレアーゼを含むことが有用です。核酸の完全な除去は、検出された相互作用は、タンパク質間で発生し、DNAによって媒介されないことを保証します。 このアプローチを使用する際に考慮すべき重要な要素は、調査中の複合体の安定性です。手順が長く、preservinを含むことができますGタンパク質複合体で一晩。我々は2つのクロマチンリモデリング複合体（D.ボーデとM.パルド、データは示していない）との良好な成功を収めているが、これは評価されるべきです。必要に応じてアフィニティー精製工程を短縮することができます。 サイズ排除クロマトグラフィーなどのネイティブの分別を許可別の技術は、広くタンパク質複合体を特徴づけるために50年以上にわたって使用されています。我々および他のものはブルーネイティブPAGEの解像度は、サイズ排除クロマトグラフィー20、31、32、33を用いて達成されるものよりも優れていることを示しています。ブルーネイティブPAGEのもう一つの利点は、それが高価なクロマトグラフィーシステムを、必要としないことであるが、むしろ研究室で広く普及しているタンパク質の電気泳動装置を使用しています。ハンズオン時間の面では、この方法では、伝統的なGELC-MS / MS Aより多くの作業を必要としませんpproachまたはオフラインのクロマトグラフィー分画。ほとんどの分別技術がそうであるようにしかし、それは彼らの解像度に制限があります。質量および形状が非常に均一または近接している複合体は、青色ネイティブPAGEによって提供される解像度を超えていてもよく、従ってここで報告されているように、プロトコルは、共有サブユニットと別個の複合体を解決するために普遍的に成功しないかもしれません。心強いことに、我々は3つのサブユニット（M.パルド、投稿準備中）を共有する2つの非常に類似した四量体複合体を分離することに成功しています。 質量分析はますます敏感になってきているので、非特異的相互作用と汚染物も微量ではAP-MSサンプルにおいて検出することができます。ここで紹介する方法は、より高い分子量の餌移行ピークと一致する移行ピークを有するタンパク質に着目してアフィニティ精製におけるバックグラウンド汚染から実際の相互作用の識別に役立つ可能性があります単量体タンパク質。 いくつかのグループは、前の分離10、11、12、34を必要とせずに細胞スケールでのタンパク質複合体を描写するタンパク質相関プロファイリング続く分別技術を使用しています。しかしながら、これは、準化学量論的相互作用を検出するための故障をもたらすことができます。アフィニティ精製によって濃縮ステップの取り込みは、これを克服するのを助けることができます。ここで説明するアプローチは、タンパク質複合体のトポロジーを探索し、所定のタンパク質が同じ細胞コンテキスト内に参加する複数の複合体を解明するための一般的に有用であるべきです。戦略は、タンパク質複合体を解決するために、高価なクロマトグラフィー分画の機器を持っていない可能性が研究室にシンプルかつ従順です。

細胞では、ほとんどのタンパク質は、一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用を介して、または安定なタンパク質の集合体を形成することにより、その機能を実行します。タンパク質相互作用を特徴づけることは十分に理解細胞プロセスのために重要です。質量分析法（AP-MS）と組み合わせたアフィニティー精製は、ネイティブのタンパク質相互作用を同定するための最も一般的に適用される戦略の一つです。過去十年間で達成機器の機能の大幅な改善は、このアプローチは非常に強力作られてきました。 AP-MS実験によって識別される相互作用が餌と獲物の間の直接および間接的な団体の混合物が含まれることに注意することが重要です。加えて、多くの場合、タンパク質は異なる生物学的役割を有するかもしれない同じ細胞コンテキスト内でいくつかの異なる複合体に関与し、したがってAP-MSによって同定された相互作用は、異なるタンパク質集合体または機能エンティティの組み合わせを表すかもしれません。導出することはできませんそのような位相情報単純なAP-MS実験によって生成されたタンパク質の一次元リストから演繹 。しかし、この技術は、これらのアセンブリを解決するために、1つまたは複数の方法と組み合わせることにより、タンパク質複合体の構造を定義するためにさらに利用することができます。 AP-MSによって同定されたタンパク質間相互作用のトポロジーを解決するために、いくつかの戦略が適用されています。一つのアプローチは、餌1と実験の前のラウンドで同定された獲物を用いて反復AP-MS実験を実行することです。非常に有益が、これは両方の実験的および解析的に非常に労働集約的な作業です。質量分析と組み合わせたタンパク質架橋は、ますますタンパク質複合体2、3、4、5で位相情報を導出するために使用されています。しかし、computatio架橋されたペプチドの最終分析は、依然として困難な作業のままであり、したがって、ワークフローのボトルネックです。 MS-開裂可能な架橋試薬の出現は、タンパク質6、7相互作用に近接しているアミノ酸残基のマッピングを容易にするはずです。別の代替は、従来の直交分離技術8,9との親和性精製を組み合わせることです。ゲル濾過またはイオン交換によるクロマトグラフィー分画、またはスクロース勾配分画はまた、最近、通過複合分離工程10、11、12、13、システム全体のレベルでの多タンパク質複合体を記述するために、定量的質量分析と組み合わせて使用されてきました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）が広くに適用されています天然のタンパク質の相互作用、ミトコンドリア膜タンパク質複合体14を含む一般的に、これらを調査します。この分離技術はまた、最近、ミトコンドリア複合体15、16、17上だけでなく、全体のセル18、19からの他のタンパク質複合体を解明するためだけでなく、ラベルフリータンパク質定量と相関プロファイリングと組み合わせて使用しました。我々は、その後のネイティブ分画手法および定量的MSとの親和性精製の組み合わせは、特定の蛋白質を含む複数タンパク質アセンブリを解決するための有用な戦略を提供するはずであるという仮説を立てました。 ここでは、定量的質量、SP、続いて単離された複合体のブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、一般的なエピトープベースのアフィニティー精製を組み合わせた方法を記載しectrometryとタンパク質相関プロファイリングは、タンパク質が関与する可能性がある複数のアセンブリを解決することができます。私たちは、エピトープタグに融合した目的のタンパク質が生理的豊かさに近い達成し、効率的なネイティブを確保するために、内因性遺伝子座から発現されたマウス胚性幹細胞を使用します複雑な分離。このアプローチは、複数の相互作用タンパク質は、従来GELC-MS 20よりも多くの作業を必要としない一方で、それらの相関プロファイルに基づいて異なるアセンブリにそれらを解決する、に係合を解きます。

<table><tbody><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG抗体 M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20、タンパク質グレード、10%溶液</td><td>ミリポア</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルピメリミデート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M トリエタノールアミン緩衝液、pH 8.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAGペプチド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathode Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4xNativePAGEサンプルローディングバッファ</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズLC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250サンプル添加物&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 円錐底 96 ウェルプレート、ポリプロピレン</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>マルチスクリーン HTS 96 ウェルろ過システム</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 ウェルキャップ ナチュラル</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、HPLC グレード</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、シーケンシンググレード</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (ソフトウェア)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>ペルセウス (ソフトウェア)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

ブルーネイティブpageおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ほとんどのタンパク質は他のタンパク質と関連して行動します。したがって、生物学的プロセスを完全に理解するためには、これらの機能単位を特徴付けることが重要です。質量分析と組み合わせたアフィニティー精製(AP-MS)は、タンパク質間相互作用を同定するための最適な方法となっています。しかし、従来のAP-MS研究では、タンパク質の相互作用に関する情報は得られますが、組織的な情報は失われていました。この問題に対処するために、私たちは、アフィニティー精製されたタンパク質複合体を質量分析による特性評価の前に分離することにより、タンパク質が関与する可能性のある異なる機能集合体を解明する戦略を開発しました。エピトープタグを用いたベイトタンパク質のアフィニティー精製と競合的溶出によって単離されたタンパク質複合体は、青色のネイティブ電気泳動によって分離されます。定量的質量分析を用いた相関プロファイリングによるタンパク質移動プロファイルの比較により、相互作用するタンパク質を異なる分子エンティティに割り当てることができます。この分析法は、ゲルろ過などの従来のクロマトグラフィー技術では解決できなかった分子量の近いタンパク質複合体を分離することができます。従来の AP-GELC-MS/MS よりも少ない作業で、この戦略は、多くの場合、タンパク質相互作用の同定と同時にタンパク質複合体のトポロジカル情報を取得するのに適切であることを示しています。

質量分析によるアフィニティー精製ブルー天然タンパク質相関プロファイリングのワークフローは、（ABC-MS）戦略が、図7に示されています。関心対象のタンパク質の周り天然タンパク質複合体（この場合、フラグに）エピトープタグに対する抗体を用いたアフィニティー精製および競合的溶出によって単離されます。複合体は、BN-PAGEによって分離され、そして全体のゲルレーンを48個のセクションに切り出し、ショットガンLC-MS / MSのために準備されます。定量的MS情報は、青色ネイティブ分離挟んで同定されたタンパク質の移行プロファイルを生成するために使用されます。重なり合うピークを有する別個の複合表示同様の移動プロファイルを形成するように相互作用するタンパク質。関心対象のタンパク質が複数のアセンブリに関与する場合、複数のピークは、その移行プロファイルで観察されたサブ複合体は、ブルーネイティブゲルの分解能の範囲内である与えられています。 MIGの体系的な比較配給プロファイルは、階層的クラスタリングを使用してプロファイリングタンパク質相関によって達成することができます。すべての画分についてのデンドログラムとピーク強度は、異なるタンパク質複合体（ 図8）に属するタンパク質相互作用の同定を容易に、ヒートマップに可視化されます。 我々はMTA2、複雑な20を改造NURDクロマチンのコアサブユニットの相互作用パートナーを分析するために、この戦略を使用していました。 図9に示すように、MTA2の移動プロファイルは、より高い存在量を表示低い質量ピークと、700 kDaの1.2 MDA間の異なる強度の2つのピークを示しました。 MTA1 / 3、HDAC1 / 2とMBD3を含む他のNURDコアサブユニットは、サブユニット、すなわちChd4の一部についてのピークはあるが、同一の分離パターンを示し、B Gatad2a /及びRbbp4 / 7は、（図9A逆存在量分布を有しB）。これとは対照的に、のCdkのプロフィール2ap1は、Wnt遺伝子のプロモーター23にNURD複合体を動員調節因子は、唯一のより高い質量ピーク（ 図9C）を表示し、そうSALL4もNURD 20、24、25結合することが示されている転写リプレッサーを行いました。したがって、ブルーネイティブPAGEによってアフィニティー精製MTA2関連タンパク質の分画は、NURD複合体の2つの異なる形式を解決することができました。 ABC-MSはまた、特定のタンパク質のエンティティに割り当てる一方、新規相互作用の同定を可能にします。ヒートマップで表されるタンパク質クラスターと分数強度の検査を通じて、我々はWDR5 2つのNURD Pと一致する2つの移行のピークを示すと共に、NURDサブユニットとWDR5、MLLメチルトランスフェラーゼ複合体26の調節サブユニットとの間の強い相関を検出しましたWDR5とNURDの間の新規の相互作用を示唆しeaks（ 図8）。私たちは、共免疫沈降およびサイズ排除クロマトグラフィー20での同時移行により、この相互作用を確認しました。 階層的クラスタリングにおける距離メトリック計算の選択は、クラスタひいては相関の形状に影響を与えるであろう。私たちは、目的のタンパク質または複合体の既存の相互作用の知識を持つ最高のフィット感を実現するために異なるメトリックを試してお勧めします。一般的に、我々は、マンハッタン（L1）距離メトリック20で最良の結果を達成しました。ピアソン相関やユークリッド距離メトリックは、代替分別技術10、11、12に基づいて、複合体を同定するために報告されています。 泉ブルーネイティブ画分から得られたtitative MSデータはまた、タンパク質複合体の化学量論を決定するために用いることができます。 iBAQ（強度基づいて絶対定量）値は、同定されたタンパク質27、28の相対的存在量の尺度を提供します。マイグレーションプロファイルピーク内の全ての画分中のタンパク質複合体メンバーのiBAQ値は、相対的な量を得るために、ベイトタンパク質のそれに正規化されます。所与のタンパク質複合体のプロファイルのピークを横切る正規iBAQs水平トレンドに従うべきであり、トレンド値は、ベイトタンパク質に対する相互作用タンパク質の化学量論を反映します。化学量論計算のより詳細な表現については、20を参照してください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> 図7：ABC-MS Sを要約する概略ワークフローtrategy。この図は、20から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> MTA2の相互作用のBN-PAGE移動プロファイルの図8の階層的クラスタリング。 MTA2関連タンパク質は、それらの移動プロファイルの類似性に基づいてクラスタ化されました。 NURD錯体を含有するヒートマップの一部のみが（青色のボックスに囲まれている）に示されています。黄色のボックスは、NURD複合体とWDR5の強い相関関係を強調しています。注釈付きの分子量は、同一ゲルで実行タンパク質標準の移動距離から推定しました。この研究は、もともと生化学とMoのためのアメリカの社会は、分子細胞プロテオミクス20に掲載されました<html> lecular生物学。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> NURDサブユニットおよび関連タンパク質の図9 BN-PAGEの移行プロファイル。 A）同様の強度パターンに存在MTA2とNURDサブユニット。逆強度パターンを有するB）MTA2とNURDサブユニット。唯一のより高い分子量のNURDエンティティ中に存在するC）MTA2とCdk2ap1、。注釈付きの分子量は、タンパク質標準の移動プロファイルから推定しました。この研究は、もともと分子細胞プロテオミクス20生化学・分子生物学のためのアメリカの社会に掲載されました。_blank &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="補足ファイル" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> 補足データ：サンプルデータセット。 ABC-MS実験からのタンパク質同定および定量値を含むMaxQuant由来proteingroups.txtファイル。この研究は、もともと分子細胞プロテオミクス20生化学・分子生物学のためのアメリカの社会に掲載されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

この実験戦略の全体的な目的は、アフィニティー精製したタンパク質複合体のブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画と、質量分析相関プロファイリングを通じて、タンパク質が関与し得る個別の機能的アセンブリを解明することです。この手法により、アフィニティー精製・質量分析実験で得られたタンパク質リストに組織的な情報を付加することができます。この手順の主な利点は、操作が簡単で分解能が高く、従来のゲルCMS-MSと同程度の作業量で実施できることです。このプロトコルは、FLAGタグ付きタンパク質を内在性レベルで発現している2億から5億個の細胞からタンパク質複合体を精製するために最適化されています。テキストプロトコルに記載されている方法で細胞ペレットを解凍した後、DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷したライシスバッファー5 mLを細胞懸濁液に加え、渦巻状に混ぜ合わせます。懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。細胞懸濁液を冷却済みのホモジナイザーに移します。密着したペスルの使用により、目に見える粘性がなくなるまで20〜30回ストロークして細胞を溶解し、その後、ホモジナイズした液を冷却済みのマイクロ遠心チューブに移します。チューブを遠心分離した後、上清のライセートを清潔で冷却されたチューブに移します。この際、約50 µLのライセートを元のチューブに残してください。タンパク質濃度の測定および精製のモニタリング用に、ライセートを35 µL分取して保存します。次に、事前に準備したビーズからバッファーを除去します。ビーズをライセート 1 mLで再懸濁し、その後、残りのライセートと混合します。混合物を回転ローターを用いて4°Cで1〜2時間インキュベートします。マグネットを用いてビーズをチューブの壁面に集めます。上清を30 µL分取し、残りは廃棄します。ピペッティングを4〜6回行い、ビーズを0.5 millilitersのIPP150バッファーに再懸濁します。次に、懸濁液を1.5 milliliterの冷却チューブに移します。続いて、0.5 millilitersのFLAG溶出ネイティブバッファーでビーズを3回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを新しい冷えたチューブに移します。緩衝液を完全に除いてください。ビーズを、ネイティブ溶出緩衝液で調製した200 micrograms per milliliterの3X5ペプチド 100 microlitersに再懸濁します。その後、緩やかに回転させながら4 °Cで10分間インキュベートします。磁石を用いてビーズを回収し、上清を新しい冷却チューブに移します。すべての溶出液を回収する前に、この手順を2回繰り返します。遠心分離フィルターユニットを用い、4 °C、10,000 ×gで遠心分離し、溶出液を25 µLまで濃縮します。濃縮した25 µLの溶出液に4X nativeサンプルロード用バッファーと0.5% G-250サンプル添加剤を加え、サンプルを調製します。サンプルとnative分子量マーカーをロードし、その間に空のウェルを1つ設けます。次に、空のすべてのウェルに1X nativeサンプルローディングバッファーを10〜20 µL注入します。サンプルを乱さないように注意しながら、陰極槽に1X native PAGEダークブルー陰極バッファーを200 mL満たします。陽極槽に1X native PAGE陽極バッファーを550 mL満たします。ゲルを150 Vで30分間電気泳動させます。泳動停止後、セロロジカルピペットを用いて濃い青色のカソード緩衝液を除去し、1Xの薄い青色のカソード緩衝液と交換します。さらに60分間泳動を続けた後、ゲルカセットを開き、カセットプレートの一方を廃棄します。ゲルはもう一方のカセットプレートに付着したままになります。ゲルを、それを覆うのに十分な量の固定液が入ったトレイに入れ、緩やかに揺らしながら30分間インキュベートします。その後、固定液を取り除き、水に交換してからゲルをスキャンします。質量分析の準備として、まず、廃棄物を回収するために、円錐底96ウェルプレートを別の96ウェルプレートの上に配置します。21ゲージの針を用いて、円錐底96ウェルプレートのウェル底を穿孔します。次に、穿孔したプレートのウェルに、50%アセトニトリル、0.25%ギ酸を200 µL加えます。プレートスタックをシェーカーで10分間インキュベートします。次に、プレートを500 ×gで1分間遠心分離し、液体が孔を通って廃液回収プレートに流れるようにします。洗浄工程を2回繰り返した後、穿孔済み96ウェルプレートの各ウェルに50 mM炭酸水素アンモニウムを150 µL充填します。次に、ゲルを清潔な表面の上に置きます。サンプルを含むレーンを48等分にスライスします。ゲルの上端にある最後の5枚のスライスを除き、各スライスをさらに2〜3個の小さな断片に切り分けます。各スライスを、穿孔済みの洗浄済み96ウェルプレートの各ウェルに順次配置します。各ウェルに50 µLのアセトニトリルを加え、プレートを振盪しながら30〜60分間インキュベートします。遠心分離により液体を除去した後、各ウェルに2 mM TSEBおよび50 mM重炭酸アンモニウムを200 µLずつ加えます。プレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートした後、前と同様に遠心分離により液体を除去します。純アセトニトリル200 µLを加え、ゲル片が白濁して不透明になるまで、室温で20分間振とうしながらインキュベートしてゲル片を脱水します。アセトニトリルを除去した後、各ウェルに冷冷炭酸水素アンモニウム溶液で調製したトリプシン150 µLを加えます。プレートを37°Cで2時間振とう培養します。次に、ゲルの入ったプレートの下に、向きを合わせて清潔な円錐底プレートを配置します。その後、200 ×gで1分間遠心分離し、ペプチドを含む液体を回収します。ペプチドを含むプレートを遠心濃縮機に設置し、次のステップを同時に行いながら液を蒸発させます。ゲルピースに150 µLの50%アセトニトリルおよび0.25%ギ酸を添加します。37 °Cで30分間、振盪しながらインキュベートします。200 ×gで1分間遠心分離し、部分的に乾燥したプレートに液体を集めます。次のステップを行いながら、ペプチドを含むプレートの蒸発を続けます。ペプチド溶液を洗浄済みの遠心ろ過プレートに移します。ペプチドを回収するため、その下に清潔な円錐底プレートを配置し、前述と同様にプレートスタックを遠心分離します。円錐底プレート内の液体を、ウェルが完全に乾燥するまで蒸発させます。乾燥後、プレートにシリコン蓋を被せ、テキストプロトコルに記載されている質量分析およびデータ解析を行うまで-20°Cで保存できます。Mta2および共精製タンパク質のBlue Native PAGE移動度プロファイルの階層的クラスタリングによる代表的な結果を、デンドログラムおよびタンパク質強度を示すヒートマップとしてここに示します。Mta2の移動度プロファイルには2つのピークが見られ、これは2つの異なる複合体の存在を示しています。一部のNuRDサブユニットでも同様のパターンが認められ、低分子量の会合体において最も高い存在量を示しています。対照的に、他のNuRDサブユニットは、より分子量の大きいNuRDアセンブリに多く含まれています。一方で、Mta2の相互作用因子であるCdk2ap1は、より分子量の大きいNuRDアセンブリにのみ存在します。この手法を習得すれば、2.5日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、タンパク質複合体の解離を防ぐため、すべてのサンプルと試薬を氷上で保持することが重要です。この手順は、ネイティブ条件下での競合溶出によってアフィニティー媒体から回収可能なあらゆる標的タンパク質に適用できます。本手順の後、同定されたサブ複合体を検証するために、逆共免疫沈降や逐次共免疫沈降などの他の手法を行うことができます。

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