ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

この実験戦略の全体的な目的は、アフィニティー精製したタンパク質複合体のブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画と、質量分析相関プロファイリングを通じて、タンパク質が関与し得る個別の機能的アセンブリを解明することです。この手法により、アフィニティー精製・質量分析実験で得られたタンパク質リストに組織的な情報を付加することができます。この手順の主な利点は、操作が簡単で分解能が高く、従来のゲルCMS-MSと同程度の作業量で実施できることです。

このプロトコルは、FLAGタグ付きタンパク質を内在性レベルで発現している2億から5億個の細胞からタンパク質複合体を精製するために最適化されています。テキストプロトコルに記載されている方法で細胞ペレットを解凍した後、DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷したライシスバッファー5 mLを細胞懸濁液に加え、渦巻状に混ぜ合わせます。懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。

細胞懸濁液を冷却済みのホモジナイザーに移します。密着したペスルの使用により、目に見える粘性がなくなるまで20〜30回ストロークして細胞を溶解し、その後、ホモジナイズした液を冷却済みのマイクロ遠心チューブに移します。チューブを遠心分離した後、上清のライセートを清潔で冷却されたチューブに移します。この際、約50 µLのライセートを元のチューブに残してください。

タンパク質濃度の測定および精製のモニタリング用に、ライセートを35 µL分取して保存します。次に、事前に準備したビーズからバッファーを除去します。ビーズをライセート 1 mLで再懸濁し、その後、残りのライセートと混合します。

混合物を回転ローターを用いて4°Cで1〜2時間インキュベートします。マグネットを用いてビーズをチューブの壁面に集めます。上清を30 µL分取し、残りは廃棄します。

ピペッティングを4〜6回行い、ビーズを0.5 millilitersのIPP150バッファーに再懸濁します。次に、懸濁液を1.5 milliliterの冷却チューブに移します。続いて、0.5 millilitersのFLAG溶出ネイティブバッファーでビーズを3回洗浄します。

最後の洗浄後、ビーズを新しい冷えたチューブに移します。緩衝液を完全に除いてください。ビーズを、ネイティブ溶出緩衝液で調製した200 micrograms per milliliterの3X5ペプチド 100 microlitersに再懸濁します。

その後、緩やかに回転させながら4 °Cで10分間インキュベートします。磁石を用いてビーズを回収し、上清を新しい冷却チューブに移します。すべての溶出液を回収する前に、この手順を2回繰り返します。

遠心分離フィルターユニットを用い、4 °C、10,000 ×gで遠心分離し、溶出液を25 µLまで濃縮します。濃縮した25 µLの溶出液に4X nativeサンプルロード用バッファーと0.5% G-250サンプル添加剤を加え、サンプルを調製します。サンプルとnative分子量マーカーをロードし、その間に空のウェルを1つ設けます。

次に、空のすべてのウェルに1X nativeサンプルローディングバッファーを10〜20 µL注入します。サンプルを乱さないように注意しながら、陰極槽に1X native PAGEダークブルー陰極バッファーを200 mL満たします。陽極槽に1X native PAGE陽極バッファーを550 mL満たします。

ゲルを150 Vで30分間電気泳動させます。泳動停止後、セロロジカルピペットを用いて濃い青色のカソード緩衝液を除去し、1Xの薄い青色のカソード緩衝液と交換します。さらに60分間泳動を続けた後、ゲルカセットを開き、カセットプレートの一方を廃棄します。

ゲルはもう一方のカセットプレートに付着したままになります。ゲルを、それを覆うのに十分な量の固定液が入ったトレイに入れ、緩やかに揺らしながら30分間インキュベートします。その後、固定液を取り除き、水に交換してからゲルをスキャンします。

質量分析の準備として、まず、廃棄物を回収するために、円錐底96ウェルプレートを別の96ウェルプレートの上に配置します。21ゲージの針を用いて、円錐底96ウェルプレートのウェル底を穿孔します。次に、穿孔したプレートのウェルに、50%アセトニトリル、0.25%ギ酸を200 µL加えます。

プレートスタックをシェーカーで10分間インキュベートします。次に、プレートを500 ×gで1分間遠心分離し、液体が孔を通って廃液回収プレートに流れるようにします。洗浄工程を2回繰り返した後、穿孔済み96ウェルプレートの各ウェルに50 mM炭酸水素アンモニウムを150 µL充填します。

次に、ゲルを清潔な表面の上に置きます。サンプルを含むレーンを48等分にスライスします。ゲルの上端にある最後の5枚のスライスを除き、各スライスをさらに2〜3個の小さな断片に切り分けます。

各スライスを、穿孔済みの洗浄済み96ウェルプレートの各ウェルに順次配置します。各ウェルに50 µLのアセトニトリルを加え、プレートを振盪しながら30〜60分間インキュベートします。遠心分離により液体を除去した後、各ウェルに2 mM TSEBおよび50 mM重炭酸アンモニウムを200 µLずつ加えます。

プレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートした後、前と同様に遠心分離により液体を除去します。純アセトニトリル200 µLを加え、ゲル片が白濁して不透明になるまで、室温で20分間振とうしながらインキュベートしてゲル片を脱水します。アセトニトリルを除去した後、各ウェルに冷冷炭酸水素アンモニウム溶液で調製したトリプシン150 µLを加えます。

プレートを37°Cで2時間振とう培養します。次に、ゲルの入ったプレートの下に、向きを合わせて清潔な円錐底プレートを配置します。その後、200 ×gで1分間遠心分離し、ペプチドを含む液体を回収します。

ペプチドを含むプレートを遠心濃縮機に設置し、次のステップを同時に行いながら液を蒸発させます。ゲルピースに150 µLの50%アセトニトリルおよび0.25%ギ酸を添加します。37 °Cで30分間、振盪しながらインキュベートします。

200 ×gで1分間遠心分離し、部分的に乾燥したプレートに液体を集めます。次のステップを行いながら、ペプチドを含むプレートの蒸発を続けます。ペプチド溶液を洗浄済みの遠心ろ過プレートに移します。

ペプチドを回収するため、その下に清潔な円錐底プレートを配置し、前述と同様にプレートスタックを遠心分離します。円錐底プレート内の液体を、ウェルが完全に乾燥するまで蒸発させます。乾燥後、プレートにシリコン蓋を被せ、テキストプロトコルに記載されている質量分析およびデータ解析を行うまで-20°Cで保存できます。

Mta2および共精製タンパク質のBlue Native PAGE移動度プロファイルの階層的クラスタリングによる代表的な結果を、デンドログラムおよびタンパク質強度を示すヒートマップとしてここに示します。Mta2の移動度プロファイルには2つのピークが見られ、これは2つの異なる複合体の存在を示しています。一部のNuRDサブユニットでも同様のパターンが認められ、低分子量の会合体において最も高い存在量を示しています。

対照的に、他のNuRDサブユニットは、より分子量の大きいNuRDアセンブリに多く含まれています。一方で、Mta2の相互作用因子であるCdk2ap1は、より分子量の大きいNuRDアセンブリにのみ存在します。この手法を習得すれば、2.5日間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、タンパク質複合体の解離を防ぐため、すべてのサンプルと試薬を氷上で保持することが重要です。この手順は、ネイティブ条件下での競合溶出によってアフィニティー媒体から回収可能なあらゆる標的タンパク質に適用できます。本手順の後、同定されたサブ複合体を検証するために、逆共免疫沈降や逐次共免疫沈降などの他の手法を行うことができます。