ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決
2017年4月1日
ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。
この実験戦略の全体的な目標は、青色のネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティー精製タンパク質複合体の分画、および質量分析相関プロファイリングを通じて、タンパク質が関与する可能性のある異なる機能集合体を分離することです。この方法は、アフィニティー精製の大規模分光実験によって生成されたタンパク質リストに組織情報を追加するのに役立ちます。この手順の主な利点は、実行が簡単で、分解能が良好で、従来のゲルCMSMSよりも手間がかからないことです。
このプロトコールは、FLAGタグ付きタンパク質の内因性レベルを発現する2億から5億個の細胞のタンパク質複合体の精製に最適化されています。細胞ペレットを解凍した後、テキストプロトコルに記載されているように、DTTおよびプロテアーゼ阻害剤を含む5ミリリットルの氷冷溶解緩衝液を細胞懸濁液に加え、渦巻き状にして混合します。懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。
細胞懸濁液をコールドダウンホモジナイザーに移します。目立つ粘度がなくなるまでタイトな乳棒を使用して、20〜30回のストロークで細胞を溶解し、ホモジネートを冷たいマイクロ遠心チューブに移します。チューブを遠心分離した後、透明化したライセートを清潔なコールドチューブに移し、約50マイクロリットルのライセートを残します。
35マイクロリットルのライセート分を保存して、タンパク質濃度を測定し、精製をモニターします。次に、前に調製したビーズからバッファーを取り出します。ビーズを1ミリリットルのライセートで再懸濁し、残りのライセートと混合します。
混合物を摂氏4度の回転ホイール上で1〜2時間インキュベートします。チューブの側面にあるビーズを磁石で集めます。30マイクロリットルのアリコートの上清を収集し、残りを捨てます。
0.5ミリリットルのIPP150バッファーに4〜6回ピペッティングしてビーズを再懸濁します。次に、懸濁液を1.5ミリリットルのコールドチューブに移します。次に、0.5ミリリットルのFLAG溶出ネイティブバッファーでビーズを3回洗浄します。
最後の洗浄で、ビーズを新しいコールドチューブに移します。バッファを完全に取り外します。100マイクロリットルの200マイクログラム/ミリリットルの3X5ペプチドにビーズを再懸濁します。
その後、4°Cで10分間、穏やかに回転させてインキュベートします。ビーズを磁石で集め、上清を冷たい新しいチューブに移します。この手順を 2 回繰り返してから、すべての溶出液を取り出します。
溶出液を遠心フィルターユニット内で25マイクロリットルまで濃縮し、摂氏4度でGの10,000倍を遠心分離します。25 μL の濃縮溶出液に 4X ネイティブサンプルローディングバッファーと 0.5%G-250 サンプル添加剤を加えて、サンプルを調製します。サンプルと天然分子量マーカーをロードし、それらの間に空のウェルを残します。
次に、10〜20マイクロリットルの1Xネイティブサンプルローディングバッファーをすべての空のウェルにロードします。カソードチャンバーに200ミリリットルの1X native PAGEダークブルーカソードバッファーを慎重に充填し、サンプルを乱さないようにします。アノードチャンバーに550ミリリットルの1X PAGEネイティブアノードバッファーを充填します。
ゲルを150ボルトで30分間泳がせます。ランを停止した後、セロジカルピペットでダークブルーカソードバッファーを取り外し、1Xライトブルーカソードバッファーと交換します。60分間泳動を続けた後、ゲルカセットを開けてカセットプレートの1枚を捨てます。
ゲルは他のカセットプレートに付着したままです。ゲルを覆うのに十分な固定液が入ったトレイにゲルを置き、穏やかに振とうしながら30分間インキュベートします。次に、固定液を取り出し、水で置き換えてからゲルをスキャンします。
質量分析の準備をするには、まず円錐形の底部96ウェルプレートを別の96ウェルプレートの上に置いて、廃棄物を回収します。円錐形の底部96ウェルプレートのウェルの底に21ゲージの針で穴を開けます。次に、200マイクロリットルの50%アセトニトリル、0.25%ギ酸をピアスプレートのウェルに加えます。
プレートスタックをシェーカーで10分間インキュベートします。次に、プレートをGの500倍で1分間遠心分離し、液体が穴を通って廃棄物収集プレートに流れ込むようにします。洗浄手順を2回繰り返した後、ピアスを開けた96ウェルプレートのウェルに150マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウムを満たします。
次に、ゲルをきれいな面に置きます。サンプルを含むレーンを 48 個の同一のスライスにスライスします。各スライスを2つまたは3つの小さな部分にカットしますが、ゲルの上部にある最後の5つのスライスを除いて。
各スライスを、ピアス端洗浄96ウェルプレートの1つのウェルに順次配置する。各ウェルに50マイクロリットルのアセトニトリルを加え、プレートを30〜60分間振とうしながらインキュベートします。遠心分離により液体を除去した後、各ウェルに200マイクロリットルの2mmTSEBと50ミリモルの重炭酸アンモニウムを加えます。
プレートを室温で30分間振とうしながらインキュベートした後、前回と同様に遠心分離により液体を除去します。200マイクロリットルの純粋なアセトニトリルを加えてゲル片を脱水し、ゲル片が白く不透明になるまで室温で20分間振とうしながらインキュベートします。アセトニトリルを除去した後、各ウェルに冷たい重炭酸アンモニウムに150マイクロリットルのトリプシンを加えます。
プレートを摂氏37度で2時間振とうしながらインキュベートします。次に、ゲル含有プレートの下にきれいな円錐形の底プレートを置き、プレートの正しい向きを確保します。次に、ペプチドを含む液体をGの200倍で1分間遠心分離して回収します。
ペプチド含有プレートを遠心式蒸発器に入れ、次のステップを実行しながら液体を蒸発させます。150マイクロリットルの50%アセトニトリル、0.25%ギ酸をゲル片に加えます。37°Cで30分間振とうしながらインキュベートします。
部分的に乾燥させたプレートに液体を200倍Gで1分間遠心分離して集めます。次のステップを実行しながら、ペプチド含有プレートの蒸発を続けます。ペプチド溶液を洗浄した遠心ろ過プレートに移します。
その下にきれいな円錐形の底板を置き、ペプチドを収集し、以前と同様にプレートスタックを遠心分離します。ウェルが完全に乾くまで、円錐形の底板で液体を蒸発させます。乾燥したら、プレートをシリコン製の蓋で覆い、テキストプロトコルに記載されている質量分析とデータ分析を行うまで、摂氏マイナス20度で保存できます。
ここでは、Mta2 の青色ネイティブ PAGE 移動プロファイルと共精製タンパク質の階層クラスタリングの代表的な結果を、樹状図とタンパク質強度を表すヒートマップとして示しています。Mta2の移行プロファイルは、2つの異なる複合体を示す2つのピークを示しています。一部のNuRDサブユニットは、低分子量アセンブリで存在量が最も多い同様のパターンを示します。
対照的に、他のNuRDサブユニットは、高分子量のNuRDアセンブリに多く含まれています。一方、Mta2インタラクターであるCdk2ap1は、高分子量のNuRDアセンブリにのみ存在します。一度習得すれば、このテクニックは2日半で完了します。
この手順を試みる際には、タンパク質複合体の解離を避けるために、すべてのサンプルと試薬を氷上に保管することを覚えておくことが重要です。この手順は、天然条件での競合溶出によってアフィニティー培地から観察できる場合に限り、関心のある任意のタンパク質に適用できます。この手順に続いて、リバースまたはシーケンシャル共免疫沈降などの他の方法を実行して、同定されたサブコンプレックスをバリデーションすることができます。
概要
この記事では、タンパク質複合体のアフィニティ精製に続くブルーネイティブPAGEと質量分析のプロトコルを提示します。この方法は相互作用網を明確なタンパク質複合体に効果的に分解します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- プロテオミクス
背景
- アフィニティ精製はタンパク質相互作用の研究に不可欠です。
- ブルーネイティブPAGEはタンパク質複合体の分離を可能にします。
- 質量分析はタンパク質の定量分析を提供します。
- この方法はタンパク質の機能と相互作用の理解を深めます。
研究目的
- タンパク質複合体の精製のための効率化されたプロトコルを開発する。
- タンパク質相互作用データの解像度と組織化を改善する。
- 大規模な細胞集団からのタンパク質複合体の分析を容易にする。
使用した方法
- 細胞溶解物からのFLAGタグ付きタンパク質のアフィニティ精製。
- タンパク質複合体の分離のためのブルーネイティブPAGE。
- タンパク質相関プロファイリングのためのラベルフリー定量質量分析。
- 2億から5億個の細胞からの精製の最適化。
主な結果
- 明確なタンパク質複合体の分解に成功。
- 質量分析によって高品質なデータを取得。
- プロトコルは単純性と良好な分解能を示しました。
- タンパク質相互作用と機能の理解が深まりました。
結論
- 開発されたプロトコルはタンパク質複合体の研究に効果的です。
- 質量分析の信頼性の高い方法を提供します。
- このアプローチはプロテオミクス研究に大きく貢献できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Resolving protein complex topology enhances target validation by revealing functional assemblies beyond binary interactions. This method supports mechanistic de-risking in early discovery by distinguishing distinct complexes that may drive divergent signaling outcomes. It enables predictive confidence in target selection by linking interactome data to structural organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving whether a bait protein engages distinct functional complexes under native conditions.
- Operational Value: Adds organizational dimension to AP-MS data without requiring extensive re-engineering of existing workflows.
- Predictive Value: Enables discrimination between transient scaffolding interactions and stable effector complexes for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitatively resolvable complex migration profiles suitable for correlation-based profiling in screening cascades.
- Reproducibility: Blue native PAGE separation provides consistent electrophoretic behavior across replicates, supporting assay standardization.
- Scalability: Compatible with 200–500 million cell inputs, aligning with industrial-scale cell culture outputs for target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Resolved complexes can be tracked across models to assess disease-relevant assembly shifts, supporting biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Distinguishing complex isoforms reduces risk of misattributing phenotypic effects to incorrect interaction partners.
- Preclinical Modeling: Enables validation of complex-specific perturbations in disease models where subunit composition influences therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates affinity purification with orthogonal separation to enrich discovery-stage interactome maps with structural context before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving whether observed interactions occur within discrete molecular entities rather than promiscuous associations.
- Screening: Enables assay development based on complex-specific migration shifts as quantitative readouts for compound-induced remodeling.
- Analytics: Correlation profiling generates quantitative migration profiles that allow bioinformatic assignment of proteins to distinct complexes.
- Translational Research: Facilitates continuity from complex resolution to preclinical validation by preserving native-state organization.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for complex topology analysis applicable across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in interactome data by assigning proteins to specific complex assemblies.
- Operational Value: Leverages existing AP-MS infrastructure with minimal added steps, improving throughput without major retooling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether target engagement occurs in disease-relevant versus incidental complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on complex-specific functional evidence rather than interaction counts alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native protein complex handling and blue native PAGE optimization.
- Dependent on access to high-resolution electrophoresis systems and quantitative mass spectrometry platforms.
- Necessitates standardized protocols for complex preservation during lysis and purification to avoid artifactual dissociation.
- Involves adaptation considerations for varying complex stability, detergent sensitivity, and epitope accessibility across target classes.
- Practical limitation: Resolution depends on complex mass differences; near-identical assemblies may require complementary methods.
