IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデルインビボ炎症反応の長期モニタリング

この手順の全体的な目標は、細菌培養上清などの炎症誘発性刺激による非侵襲的チャレンジ後のマウスの肺の炎症をリアルタイムで監視することです。この方法は、どの細菌製品が呼吸器感染症の原因であるかなど、宿主と病原体の相互作用に関する特定の質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、侵襲的ではなく、同じ動物を長時間繰り返し監視できることです。

この方法は、テキストだけではインストール手順を学習するのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。この手順をデモンストレーションするのは、フランチェスカ・ルシッティ、アンジェラ・サンドリ、フェデリコ・ボスキ、私の研究グループのすべての外部協力者です。in vivo遺伝子導入のためには、まず核酸複合体を室温まで温めます。

次に、実験動物の尻尾を摂氏50〜53度の水で30秒間温めます。尾静脈が拡張したら、マウスを適切な拘束装置に置き、拡張した尾静脈に27〜30ゲージの針を20〜30度の角度で挿入して、複合体の200マイクロリットルを注入します。全量が投与されたら、針を取り外し、注射部位に圧力をかけます。.

24時間から48時間後、新たに調製したD-ルシフェリンのキログラムあたり10ミリリットルを、生物発光イメージングの15分前に最大5匹の完全に麻酔された複合体注射動物に腹腔内注射します。in vivoイメージングシステムを開き、ブラックカードストックをイメージングチャンバーに入れ、次にマウスをイメージングチャンバーに入れます。in vivoイメージングシステムソフトウェアを開き、システムを初期化します。

発光(Luminecent)の隣にチェックマークを追加し、励起フィルターがブロックに設定され、発光フィルターがオープンに設定されていることを確認します。発光イメージングモードの場合は、露光時間を5分、ビニングを8、F/ストップを1を選択します。写真イメージングモードの場合は、ビニングを4に、F /ストップを8に選択します。

視野メニューで、面積が 19 x 19 センチメートル、被写体の高さが 1.5 センチメートルの D 視野を選択します。すべてのパラメータを設定したら、[取得] をクリックして動物を画像化します。画像を取得したら、動物を完全に回復するまで監視しながら動物をケージに戻します。

特定の関心領域から放出される光子を定量化するには、イメージングシステムソフトウェアを開き、関心領域ツールを選択します。タイプメニューで「Measurement Region of Interest」を選択し、正方形ツールを使用して、1匹の動物の胸部の周りに正方形の関心領域を描画します。この関心領域をコピーして他の各動物に貼り付けて、同じディメンションの関心領域を生成し、[関心領域の測定] をクリックして、すべての関心領域の合計強度を測定します。

次に、[エクスポート] をクリックし、対象領域の測定データを保存するフォルダーを選択します。in vivo遺伝子送達の少なくとも7日後に、スプリング付きの5ミリリットル注射器、100マイクロリットルのハミルトン注射器、および使い捨てゲージを3方向ストップコックに接続します。PE 190マイクロ医療用チューブの一部を使い捨てゲージとペンセントリーニードルに接続します。

5ミリリットルの注射器に800マイクロリットルの空気を入れます。ストップコックを回し、100マイクロリットルの注射器を満たしてチューブ内の上清を引き上げ、麻酔をかけた実験用マウスをプレキシガラス挿管プラットフォームに入れ、動物を切歯で固定します。利き手ではない手で喉頭鏡の電源を入れ、もう一方の手で鈍い端の鉗子と喉頭鏡の先端を使用して、口をそっとこじ開けます。

鉗子を使用して舌を横に引き、喉頭鏡の刃を口の後ろに導きます。気管の開口部が見えるまで、喉頭鏡を90度下向きの角度で非常に静かに押します。一方、PEチューブの端に接続されたデリバリーチューブを気管に挿入し、三方弁を回転させて緑膿菌接種物を送達し、すべての接種物が送達されるとすぐにチューブを取り外します。

マウスを数秒間直立させて、接種物が肺に吸い込まれるようにします。最後に、1キログラムあたり150ミリグラムのD-ルシフェリンを接種動物に腹腔内注射し、気管内刺激装置の4時間後、24時間後、および48時間後にin vivoイメージングシステムで肺を画像化し、その後、先ほど示したように光子定量化を行います。ここでは、生物発光イメージングを使用して、ウシインターロイキン-8ルシフェラーゼ一過性トランスジェニックBALB/cマウスの肺炎症のリアルタイムin vivoモニタリングを行い、先ほど示したように、分泌された病原性因子を含む濃縮細菌上清を投与しました。

誘発された炎症反応は、設置後2.5時間という早い時期に生物発光シグナルの増加として検出され、光子の放出は5時間から24時間の間にピークに達し、刺激の少なくとも48時間後まで検出可能なままでした。この手順に続いて、気管支肺胞洗浄などの他の方法を実行して、治療時に作成される免疫細胞の数と種類に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、マウスで肺の炎症を使用する方法と、生物発光イメージングを使用してin vivoで肺の炎症を監視する方法についてよく理解できるはずです。