3: DNA メチル化解析

DNAメチル化は、さまざまな細胞状況下での遺伝子発現に影響を与えるDNAの化学修飾です。DNAメチル化の異常ががんなどの疾患と関連していることから、このプロセスのメカニズムや機能には多くの研究者が関心を寄せています。

このビデオでは、DNAメチル化の背後にある原理とそれを検出する方法について説明します。次に、これらの方法の1つであるバイサルファイト分析の一般的なプロトコルと、この手法のいくつかの応用について検討します。

まず、DNAメチル化とは何か、そしてそれをどのように検出できるのかを見てみましょう。

この生化学的プロセスの間に、細胞はDNAのシトシン塩基にメチル基として知られる化学タグを追加します。ほとんどのメチル化シトシンは、同じDNA鎖のグアニン塩基の隣に存在し、これらの隣接するヌクレオチドとそれらを結合するホスホジエステル結合は「CpG」と呼ばれます。ほとんどの脊椎動物のCpGはメチル化されていますが、メチル化されていないものはCpGの「島」で互いに近接して発生する傾向がありますか?活発に発現する遺伝子のプロモーター、およびその他のさまざまな調節配列要素の近く。

DNAメチル化の変化が遺伝子調節にどのように寄与するかは、まだ精力的な研究の対象となっています。CpGアイランドのメチル化は、特定の遺伝子の起源親特異的発現であるゲノムインプリンティングや、雌哺乳動物の各細胞における2つのX染色体のうちの1つのサイレンシングであるX染色体不活性化などのエピジェネティックなプロセスで見られる安定した長期的な遺伝子サイレンシングにとって重要であるようです。CpGアイランドの異常なメチル化による重要な遺伝子の抑制も、制御不能な細胞増殖に寄与し、癌につながる可能性があることが示されています。機構的には、DNAメチル化は、転写因子がプロモーターと結合するのを防ぐか、ヒストンを修飾してクロマチンを転写的に非許容性の状態にリモデリングするタンパク質を動員することにより、遺伝子サイレンシングに寄与する可能性があります。

DNAのメチル化状態を検出する方法はいくつかあります。

1つの手法であるHELPアッセイには、HpaIIとMspIと呼ばれる2つの制限エンドヌクレアーゼが含まれ、それぞれ非メチル化CCGG配列のみ、またはメチル化と非メチル化の両方のCCGG配列を切断します。これら2つの酵素が産生する消化パターンを比較することで、DNAのメチル化状態を推定できます。

メチル化DNA免疫沈降法または?MeDIP、?メチル化シトシンに結合する抗体を使用して、メチル化DNA配列を濃縮します。

最後に、バイサルファイト分析は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する化学反応を行うことにより、DNA中のメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別するために使用されます。この変換後、バイサルファイト処理されたDNAをPCRにかけ、配列を決定し、参照ゲノムと比較することができます。非メチル化シトシンは、参照に存在するものですが、バイサルファイト分析とPCR後にチミンに置き換えられます。バイサルファイト処理されたDNAを質量分析にかけることにより、研究者は「メチル化エピグラム」を作成することもできます。これは、ゲノム内の異なるCpGを線形に表し、それぞれのメチル化の程度を示しています。このようなエピグラムは、研究者が異なる細胞タイプ間のメチル化パターンを比較したい場合に特に有用です。

それでは、バイサルファイト分析のプロトコールについて詳しく見ていきましょう。

まず、水酸化ナトリウムをゲノムDNAの調製物に添加し、95°Cでインキュベートします。これにより、DNAが変性し、その塩基がその後の化学反応にアクセスできるようになります。次に、メタ重亜硫酸ナトリウムが変性DNA混合物に導入され、2つの化学反応ステップが発生します。最初のステップであるスルホン化では、非メチル化シトシンに亜硫酸基を付加してシトシンスルホン酸を形成します。次に、ヒドロリック脱アミノ化中に、アミノ基がシトシンスルホン酸から除去され、ウラシルスルホン酸が生成されます。

化学反応のこれらの最初の段階を促進するために、DNA調製物は蒸発を防ぎ、メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度を維持するのに役立つ鉱物油で覆われています。その後、反応は55でインキュベートされますか?暗闇の中でC。このステップでは、キノールなどの酸化を防ぐための薬剤も混合物に添加されます。

ウラシルスルホン酸を含み、鉱物油を含まない修飾DNAを収集するために、混合物を遠心分離し、最も低い液体層を回収します。次に、この溶液中のDNAを精製します。

次に、水酸化ナトリウムをDNA混合物に添加し、37°Cでインキュベートします。これは、ご想像のとおり、ウラシルスルホン酸から亜硫酸基を除去し、ウラシルを形成して化学反応を完了するために行われます。

最後に、混合物を酢酸アンモニウムを添加して中和し、DNAをエタノール沈殿によって収集します。バイサルファイト変換されたDNAが精製されたら、PCRとシーケンシングにかけられます。

バイサルファイト分析の基本的な手法について説明したので、いくつかの実験アプリケーションを見てみましょう。

一部の研究者は、バイサルファイト解析を使用してゲノムインプリンティングを調査しています。今回、研究者たちは、遺伝的な違いを持つシロイヌナズナの2つの系統を交配し、母方と父方のDNAを区別することができました。次に、得られた胚と関連する胚乳、または胚を支える組織のメチル化パターンを比較しました。この方法を用いて、タンパク質をコードする遺伝子であるMEAの母体対立遺伝子のCpGは、胚ではメチル化されない傾向があることを発見しました。これは、組織特異的なインプリンティングを示しています。

他の研究者は、この手法を使用して、環境的または社会的要因がメチル化パターンをどのように変化させるかを理解しています。ここでは、マウスの仔を母親から引き離してストレスを誘発し、その後、脳組織を分離しました。バイサルファイト処理されたDNAのシーケンシングに続いて、科学者たちは、ホルモンをコードする遺伝子であるAVPのメチル化パターンが、特定の脳領域で「分離」して変化したことを決定しました。子犬、初期の人生経験の長期的な生物学的影響の可能な分子メカニズムを示唆しています。

最後に、多くの研究者は、個々の固有の細胞間のメチル化パターンの比較を容易にするために、バイサルファイト分析を最適化しようとしています。今回、研究者らはバイサルファイト分析法を改良し、アガロースに包埋した個々のマウス卵子に対してすべてのステップが実行されるようにしました。これにより、DNAの損失を防ぐことができました。この方法を使用して、研究者は、複数のメチル化パターンを示すものを探すことにより、他の細胞で汚染された単一卵子サンプルを簡単に特定することができました。

JoVEのメチル化感度解析に関するビデオをご覧になりました。ここでは、DNAメチル化が遺伝子調節に果たす役割、研究者がゲノム内のメチル化領域を同定するために使用する方法、バイサルファイト解析の一般化されたプロトコル、そして最後に、この技術のいくつかの応用について説明しました。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!