Name: α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ バイオルミネセンスイメージングによる神経炎症の定量化法。α-シヌクレイン線維を末梢投与したパーキンソン病マウスモデルで、非侵襲的に神経炎症を経時的にモニタリングし、神経疾患の早期診断に活用できます。

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著者はオルガ・シャルマ、テレサ・ハント、および技術サポートのためのDZNE顕微鏡および動物施設のスタッフに感謝します。

動物を含めたすべての手順は、ノルトライン=ヴェストファーレン州国家環境庁（LANUV）の動物保護委員会の承認を得て行きました。動物を飼育し、12時間の明/暗サイクル、食物および水に自由にアクセスできる標準条件に従って世話しました。 1.動物モデル<ol><li>マウス15、16：ヘミ接合バイジェニックTgは（GFAP -Luc +/- M83 +/-）を生成するためにヘミ接合のTg（M83 +/-）マウスとの交雑ヘミ接合性Tgは（GFAP -Luc +/-）マウス。 </li><li>トランスジーンエンコードヒトα-シヌクレインの存在およびホタルルシフェラーゼ12のための標準的なPCR、17でリアルタイムPCRを用いて子孫を遺伝子型。 </li><li> 6〜8週齢で動物を接種します。 </li></ol> 2.接種材料の調製<ol><li> MOを準備20mMのTris-HCl中150mMのNaClを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）緩衝液（pH 7.2）中にA53T変異を有するnomeric組換えヒトα-シヌクレイン以前14に記載されているように。 </li><li> 5日間800rpmで37℃でオービタルシェーカー中のモノマーの組換えヒトα-シヌクレインの3μg​​の/μLを攪拌することにより接種するための繊維状α-シヌクレインを調製します。 </li><li>腹腔内またはintraglossal接種のための2μg/μLのために1μg/μLの最終濃度に達するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にフィブリルアセンブリを希釈します。 </li><li>氷上で1分（0.5秒毎のパルス間1秒のポーズと持続時間と50％に設定された振幅の40個のパルス）用ロッドソニケーターでα-シヌクレイン線維を断片。クロスシーディングによる汚染を避けるために。別の接種物を準備するためにクリーンな超音波処理プローブを使用してください。 </li></ol> 3. Intraglossal注射<ol><li> intrapeで動物を麻酔100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンのritoneal注射。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>慎重に調査員の方を向いて頭と背臥位での加熱プレート上に粘着テープで麻酔し、動物を修正。 </li><li>超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBSの5μLと27 G使い捨て皮下注射器を充填します。 </li><li>動物の口が開いて保持するための鋸歯状の先端を有する1鈍い鼻の親指の鉗子を使用し、鉗子の第二の小さいペアは慎重に注入するための舌の下側にアクセスできるように舌を引き出します。 </li><li>舌下神経に近接した舌の右または左の下側に注射器の針を注入します。ゆっくりと5秒後に接種材料を注入。ゆっくり接種物ことを保証するために、5秒後に針を引っ込めます組織を貫通した針を後退しながら、失われることはありません。 </li><li>その執着から動物を放し、完全に回復するまでに一定の監視の下で加熱プレート上でそれを残します。 </li></ol> 4.腹腔内注射<ol><li>腹腔内注射のために、2リットル/分の流量及び2％に設定気化器を使用して、イソフルラン/酸素で吸入により麻酔チャンバー内ですぐに動物をnarcotize。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。 </li><li>超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBS50μlの27 G使い捨て皮下注射器を充填します。 </li><li>直接マウスの腹膜内に注入し、研究者から離れて面するヘッドと背面位置に動物を保持し、下方に約45°腹壁の背後に位置小腸もしくは盲腸を貫通避けます。彼らが回復するまで動物を監視麻酔から。 </li></ol> 5.生物発光イメージング<ol><li>画像のTg（M83 +/-：GFAP -luc +/-）マウス生物発光イメージングシステムを用いて、2〜4週間ごと。 </li><li>まもなく撮像2L / minの流量及び2％に設定気化器とイソフルラン/酸素チャンバ内でマウスを麻酔前。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。 </li><li>脱毛クリームでマウスの頭を剃るとdepilate。非特異的生物発光をブロックする非刺激性マーカーと黒に耳を着色。 </li><li> 30mg / mLのストック溶液をPBS中のD-ルシフェリンカリウム塩、ルシフェラーゼの基質を希釈します。 -20°Cで1 mLのアリコートでこれを保管してください。溶解したD-ルシフェリンは、光への暴露から保護します。 </li><li>注射前に、動物を計量。 150 mg / kg体重の注入のためのD-ルシフェリンの正確な量を計算します。腹腔Dを注入-luciferinと麻酔室に動物を返します。 </li><li>イメージングソフトウェアを起動します。撮像システムは、その動作温度に達した後、コントロールパネルの「初期化」ボタンをクリックすることによって、システムを初期化します。 </li><li>ボタンの発光」と「写真」を選択します。 、60秒に露光時間を設定して「中」にビニング、F /ストップ「1」に、そして「オフ」にEMゲイン。 </li><li>励起フィルタを「開く」に「ブロック」と発光フィルタに設定されていることを確認し、1.50 cmの被写体の高さを設定します。 </li><li> D-ルシフェリンの注射後10分で、撮像チャンバ内の加熱プレート上に動物を配置し、それらのグリグリが正しく麻酔出口に配置されていることを確認。吸入室からイソフルラン/酸素の流れを閉じ、0.25リットル/分の流量及び2％の蒸発と撮像チャンバのためのフローを開きます。撮像チャンバPRのドアを閉めますoperly。 </li><li> 60秒を要する生物発光を測定するために「獲得」ボタンをクリックしてください。イソフルランの流れを停止し、彼らは完全に自分のケージに戻ってそれらを戻した後回復するまで動物を監視します。 </li><li>生物発光を定量化するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 「ツールパレット」の中で「ROIツール」を選択します。 「ROIのツール」内の「タイプ」の下に「測定ROI」を選択します。 </li><li> 「ROIのツール」内の「円」ツールをクリックし、プルダウンメニューから描画するROIの数を選択する - 理想的に「3」を3匹のマウスのために。 </li><li>画像では、各ROIを右クリックして「プロパティ」は1.25センチメートルに幅と高さを調整する下。定量化された脳の領域の上に、各ROIを置きます。 </li><li>画像の左上に、「放射（光子）」に単位パネルを設定します。 </li><li> 「ツールパレット」の中で、選択し「画像調整」と最小値を調整し、0.20e6から1.00e6に例えば「カラースケール」の最大値。 </li><li> 「ファイル」の下に「保存」を使用してデータを保存します。 </li></ol> 6.生化学分析<ol><li>確立されたプロトコル18、19による脳と脊髄を分離します。 </li><li>組織ホモジナイザーで6,000rpmで有する2回の30秒サイクルで（PBS中で1倍に希釈）、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下でPBSに別々に全脳および全脊髄サンプルを均質化します。脳および脊髄サンプルを20％（重量/体積）の最終濃度に均質化されていることを確認します。 </li><li> 10秒の一定のパルスと50％に設定された振幅と氷上でそれらを維持しながら二回サンプルを超音波処理。 </li><li> PBS中の1.5 M NaClで1：それらの1に希釈することによりPBSおよび750mMのNaCl中10％ホモジネートを調整します。 </li><li>細胞破片を分離するために、5分で1000×gでホモジネートを遠心4°C。次のステップのために上清を保持し、ペレットを捨てます。 </li><li>製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてホモジネート中のタンパク質濃度を測定します。氷上で15分間、10％（重量/体積）の最終濃度でN-laurylsarcosyl脊髄ホモジネートからの脳ホモジネートからの総タンパク質の1.0ミリグラムまたは0.8ミリグラムをインキュベートします。 </li><li>蒸留水中の10％（wt / vol）の3mLのスクロースクッション上にホモジネートをオーバーレイし、4℃で1時間、465,000×gでそれらを超遠心。 </li><li> 4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、2％βメルカプトエタノール、192 mMグリシン、25 mMトリス、5％（重量/容量）のスクロースを含有する緩衝液中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 5分間、100℃でサンプルを沸騰およびモルホリンエタンスルホン酸（MES）緩衝液系中での電気泳動のためにSDSポリアクリルアミドゲル上にロードします。 </li><li> SEMにおけるポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に分離されたタンパク質を転送しますidryブロッティングシステム。 </li><li>膜と架橋タンパク質に35回転ロータに室温で30分間PBS中の0.4％（vol / vol）のホルマリン溶液中で膜をインキュベートします。 </li><li>室温で1時間、0.05％（体積/体積）のTween 20および5％（wt / vol）のミルクを含むTBS緩衝液中で膜をブロックします。 </li><li> 4℃で一晩ブロッキング緩衝液中で一次抗体と共にブロットをインキュベートします。 </li><li> TBS緩衝液中で膜を3回洗浄し、室温で1時間、TBS中のペルオキシダーゼまたは蛍光団コンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートします。 </li><li>確立されたプロトコール20に従って化学発光又は蛍光によって結合した二次抗体を可視化します。 </li></ol> 7.免疫蛍光分析<ol><li>組織処理ステーションでの解剖脳と脊髄を脱水し、パラフィンステーションを使用してパラフィンにそれらを埋め込みます。 </li><li>パラフィン包埋TISをカット厚さ8μmの冠状切片でミクロトームで提訴し、スライドガラス上のセクションをマウントします。 </li><li> 5〜10分間、二つの別々のキシロール浴でそれらをインキュベートすることにより組織切片を脱パラフィン化し、段階的エタノール浴のシリーズを介してそれらを再水和（100％、90％、70％、50％）、そして最後にH 2 Oで</li><li>室温で5分間、0.01 Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で切片をインキュベートし、さらに電子レンジで10分間、それらを沸騰。 </li><li>セクションでは、室温まで冷却し、内因性ペルオキシダーゼを阻害する30分間3％過酸化水素溶液でそれらをインキュベートしてみましょう。 </li><li>室温で1時間PBS中の20％（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（vol / vol）のウシ血清アルブミン（BSA）とのインキュベーションによって、組織切片をブロックし、そして0.5％のTriton X-100。 </li><li> 4℃で一晩、1％に希釈した一次抗体（vol / vol）の正常ヤギ血清でセクションをインキュベートし、1％（体積/体積）BSA、PBS中の0.25％トリトンX-100。 </li> &lt;LI&gt; PBSで一度0.25％（vol / vol）のPBS中のTriton X-100で二回セクションを洗浄し。 </li><li>室温で1時間、対応するフルオロフォア結合二次抗体と1％に希釈した核色素DAPI（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（体積/体積）BSA、PBSで切片を染色します。 </li><li> 0.25％（容量/容量）のTriton X-100 PBSで一度PBSで2回洗浄した後、包埋媒体とスライドをカバースリップおよび共焦点レーザー走査顕微鏡で染色を可視化します。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）の腹膜内へのα-シヌクレイン線維の末梢注射したマウスは、シヌクレイノパチーの重要な特性を再現するために、神経炎症を伴う神経疾患を誘発するための容易な方法を表します。同様に、舌の注射は、トランスジェニックマウスにおけるα-シヌクレインprionoidsによって神経侵入のための別のルートを表すが、あまり効率的です。私たちは、注射後420日で実験を終了することを選んだと私たちはより多くのまたはフィブリル注射したマウスのすべての後の時点で疾患を発症している可能性が可能性を排除することはできません。また、Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）を使用したマウスは、アストログリオーシスの非侵襲的な可視化を可能にし、全体の寿命にわたってα-シヌクレインの神経侵入によって引き起こされる炎症応答を監視するための簡単な方法を表しますマウス。 重要なステップは、準備です接種材料の。集約時間、超音波処理時間、エンドトキ...

α-シヌクレインは、特に自己シードする能力で、プリオンタンパク質のものと類似しており、細胞間および神経経路に沿ったミスフォールディングを伝搬特性を有することが成長の証拠があります。 α-シヌクレインのこの特性はまた、「プリオン様」または「prionoid」と呼ばれ、罹患ニューロンから新たに移植され、健康なニューロン1にミスフォールドα-シヌクレインの透過性を示唆している移植実験において観察によって支持され、2 、3、4。また、脳または周囲、 例えば後肢筋肉または腸壁の遠位部分にα-シヌクレイン病理の広がりにおける結果に誤って折り畳まれたα-シヌクレインの直接注入CNS 5、6、7、&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 8、9、10。我々は、より詳細には、末梢経路を介してα-シヌクレインprionoidsの伝送を分析し、ミスフォールドα-シヌクレインは、単一intraglossalまたは腹腔内注射後にCNSをneuroinvadeできるかどうかを疑問に対処し、以前にプリオンのためではなく、ミスフォールドアルファのために示された機能シヌクレイン。舌へのプリオンの注入後の、CNSの神経侵入は、脳幹11に位置する舌下神経の核につながる舌の舌下神経に沿って伝播を介して達成されます。プリオンプロモーターからのヒトα-シヌクレインのA53T変異体を過剰発現マウス、及びホタルによってアストロサイトの活性化をモニターするために、GFAPプロモーターの制御下でルシフェラーゼ：マウスモデルとして、我々はTgが（GFAP -Luc +/- M83 +/-）を選択しました生物発光、以前の脳に示すように、プリオン感染マウス12。我々の手ではバイジェニックTgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-）他13で示されているようマウスは生後23ヶ月まで、疾患を発症しませんでした。 α-シヌクレインprionoidsという仮説を支持するマウス：脳及びTgは（GFAP -Luc +/- M83 +/-）の脊髄での病理と神経疾患を誘発しintraglossalまたは腹腔内経路を介してヒトα-シヌクレイン線維の単回注射プリオン14との重要な特徴を共有します。

<table><tbody><tr><td>抗アクチン抗体</td><td>メルクミリポア</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>抗α-synuclein, phospho S129抗体 [pSyn#64]</td><td>和光</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>抗α-synuclein, phospho S129抗体 [EP1536Y]</td><td>アブカム</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>抗GFAP抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>抗IBA-1抗体</td><td>和光</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>抗セクエストソーム-1 (p62) 抗体</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗ユビキチン抗体 [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&nbsp;</td><td>レシオファーム</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>レシオファーム</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 G シリンジ</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline ラボマーカー&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリンカリウム塩</td><td>アクリス</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL 原液</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>ソノパルス Mini20 超音波処理機</td><td>バンデリン</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS ルミナ II イメージングシステム</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-)マウスまたはB6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>ナローパターン鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 超遠心機&nbsp;</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターTLA-110</td><td></td>ローター&nbsp;</tr><tr><td>厚壁ポリカーボネートチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP 標識抗体</td><td>ケイマン</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 標識抗体&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200 イメージングシステム</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 赤外線イメージングシステム&nbsp;</td><td>LI-CORバイオサイエンスTween</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF 膜</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>作業溶液 3%</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>作業希釈率 1:50,000</td></tr><tr><td>フルオロマウント培地&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT proteaseおよびホスファターゼ阻害剤</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Precellys 24-デュアルホモジナイザー&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488標識抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594標識抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;BCA&nbsp;タンパク質&nbsp;アッセイ&nbsp;キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム RM2255</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

ミスフォールドα-シヌクレインのプリオンのような挙動を研究するために、マウスモデルは、中枢神経系（CNS）内の神経病理を引き起こすα-シヌクレインprionoids、迅速かつ簡単な伝送を可能にする必要があります。プリオンタンパク質プロモーターからA53T変異を有するヒトα-シヌクレインを過剰発現し、ホタル由来のルシフェラーゼマウス、：ここでは、バイジェニックのTg（GFAP -Luc +/- M83 +/-）にα-シヌクレイン原線維のintraglossalまたは腹腔内注射を記述しますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のプロモーターは、神経病理学的疾患を誘導するのに十分です。 8ヶ月の年齢で始まる深刻な神経症状を発症ホモ接合体のTg（M83 + / +）マウスと比較して、ヘテロ接合のTg（M83 +/-：GFAP -luc +/-）、彼らが到達するまでの動物は、自発的な病気の自由なまま22ヶ月の年齢。興味深いことに、intraperitone介しα-シヌクレイン線維の注射229±17日の中央値はインキュベーション時間をマウス：アルルートは4 5のTg（GFAP -luc +/- M83 +/-）で麻痺と神経疾患を誘発しました。病気にかかった動物は自分の脳や脊髄にリン酸化αシヌクレインの深刻な沈着を示しました。 α-シヌクレインの蓄積は、サルコシル不溶性であり、ユビキチンおよびP62と共局在し、そして星状細胞グリオーシスおよび小膠細胞を生じる炎症応答を伴いました。驚くべきことに、舌へのα-シヌクレイン線維の接種285日後にα-シヌクレイン病理を示す5注射した動物の一方のみで疾患を引き起こすにはあまり効果的でした。マウス。：私達の調査結果は、intraglossal経路を介して接種し、より多くのように腹腔内経路では、Tgのシヌクレイノパチーの関連する顕著な特徴（GFAP -luc +/- M83 +/-）で神経学的な病気を誘発するのに適していることを示していますこれは、誘導プリオンなどの病因を研究するための新しいモデルを提供しますより詳細にα-シヌクレインprionoidsによってDは

マウス（ 表1及び図1）：舌又はバイジェニックTgはCNS（GFAP -Luc +/- M83 +/-）で腹膜誘導される神経病理を介してα-シヌクレインprionoidsの周辺注射。 α-シヌクレイン線維を持つ単一の腹腔内注射した後、5匹のマウスの4つが229±17日の中央値はインキュベーション時間と神経疾患を発症しました。驚くべきことに、唯一の5匹のマウスは、285日後に、α-シヌクレイン原繊維とintraglossal注入後のCNS疾患を発症しました。 PBSの接種は、実験の420日の期間内に疾患を引き起こすことはありませんでした。 ウェスタンブロッティングおよびα-シヌクレインのSer129に対するホスホ特異EP1536Y抗体でプローブすることによって生化学的分析は、両方の送信経路のために罹患動物は、リン酸化およびサル...

Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）の腹膜または舌にα-シヌクレイン原線維の末梢注入家族A53T変異ホタルルシフェラーゼでヒトα-シヌクレインを発現するマウスは、神経炎症を含む、神経病理を誘導することができます、その中枢神経系インチ

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

この生物発光イメージング法の全体的な目的は、α-synuclein線維の末梢投与後におけるパーキンソン病マウスモデルの中枢神経系における神経炎症を定量化することです。本手法は、神経変性疾患のマウスモデルにおいて、いつ、どの程度神経炎症が発生するかを判断するのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスに神経疾患が現れるまで、非侵襲的に繰り返し神経炎症をモニタリングできることです。神経炎症による生物発光の増加は、神経疾患に伴うだけでなく、しばしばその前兆として現れるため、この手法は神経疾患の10時間後の診断に寄与します。まず、手術のために動物を適切に麻酔します。足指を挟む刺激（toe-pinch）を行い、動物が肢を引っ込めないことを確認して、手術に適した麻酔深度にあることを判断します。麻酔中の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布します。粘着テープを用いて、動物を背腹臥位で、頭部を研究者側に向けて加熱プレート上に注意深く固定します。次に、27ゲージの使い捨て皮下注射用シリンジに、超音波処理したalpha-synucleinフィブリルを5 µL充填します。次に、鈍端のピンセットを使用して動物の口を開かせ、もう一方の小さいピンセットで舌を慎重に引き出し、舌の下面に注射できるよう準備します。シリンジの針を舌の右側または左側の底面、舌下神経の近傍に刺入します。5秒後、接種物をゆっくりと注入してください。接種液が組織に浸透するように、針をそのままさらに5秒間保持し、その後注意深く針を抜きます。注入後、動物を放し、完全に回復するまで継続的に監視しながら加熱プレート上に保持します。腹腔内注射を行う場合は、イソフルランを用いた麻酔チャンバー内で動物を短時間麻酔させます。再度、動物の足趾をつまみ、後肢を引っ込めないことを確認して、適切に麻酔がかかっていることを確かめます。27ゲージの使い捨て皮下注射用シリンジに、超音波処理したalpha-synuclein fibrilsまたはPBSを50 µL充填します。動物を背側向きに保持し、頭部を研究者とは反対方向に向け、約45度の角度で下向きにします。腹壁の背後にある小腸や盲腸を貫通させないように注意して、マウスの腹腔内に直接注入します。動物が麻酔から回復するまで観察してください。イメージングを行う前に、イソフルランで麻酔をかけたマウスの頭部を剃毛し、脱毛処理します。非刺激性のマーカーで耳を黒く塗り、非特異的な生物発光を遮断します。注射前に動物の体重を測定してください。その後、体重1kgあたり150mgとなるように、注射するD-ルシフェリンの正確な量を算出します。計算した量のD-Luciferinを腹腔内注射し、その後、各動物を麻酔チャンバーに戻します。イメージングソフトウェアを起動します。イメージングシステムが動作温度に達した後、コントロールパネ

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。...

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

パーキンソン病は、農薬への暴露に関係している。ここでは、所望の濃度と腸神経系ではα-シヌクレインの蓄積で、その効果を分析する方法で胃管を使って殺虫剤を提供する方法を示しています。...

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

小説としてルシフェラーゼおよびin vivoイメージングシステム（IVIS）を活用することで臨床開発が発生する前に病気のエンドポイントを識別することを意味します。...

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

このビデオは、α-シヌクレインフィブリルをマウスに注入して神経炎症を誘発する方法を示しています。このフィブリルは、変異したα-シヌクレインタンパク質を発現するトランスジェニックマウスに腹腔内に注入されます。中枢神経系に到達すると、原線維はニューロンに入り、変異したタンパク質の凝集を誘導します。凝集体は、隣接するニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトに広がります。凝集体の認識は、ミクログリアが神経炎症を誘発し、ニューロンを損傷する引き金となります。...

α-シヌクレイン線維の注射によるマウスの神経炎症の誘導

出典:Breid, S., et.al. α-Synuclein Fibrilsの末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング。J. Vis. Exp.

トランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

出典:Bosco, A., 他.In vivo 神経変性中の網膜ミクログリア活性化のダイナミクス:マウス緑内障における共焦点眼鏡イメージングと細胞形態測定。J. Vis. Exp. (2015) このビデオは、緑内障のマウスモデルにおける網膜ミクログリアのin...

緑内障マウスモデルにおける網膜ミクログリアのin vivoイメージング

出典: Schmitz, K., et al., マウスの多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎および脳炎症の生物発光および近赤外イメージング. J. Vis. Exp.

EAEマウスモデルにおける生物発光イメージング

我々は、炎症ステージを区別するための非侵襲的な画像化方法を記載している。ルミノールの全身送達は、好中球MPO活性に依存して急性炎症の領域を明らかにする。これとは対照的に、ルシゲニンの注入はマクロファージにおけるphoxの活動に依存して慢性炎症の可視化を可能にします。...

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

このプロトコルを記述する方法高解像度イメージング スペクトル領域光干渉断層法などと小さい齧歯動物, 眼科画像処理プラットフォーム...

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

このプロトコルの目的は、生体内でα-シヌクレインの形成を複製するセルベースのシステムを集約を提供することです。細胞内の α-シヌクレイン介在物は一次ニューロンに内面化することによって播かれ、伝搬の外因性投与罹患 α-シヌクレイン遺伝子組換えマウスから隔離されたネイティブのミクロソームによる...

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

学ぶ バイオルミネセンスイメージングによる神経炎症の定量化法。α-シヌクレイン線維を末梢投与したパーキンソン病マウスモデルで、非侵襲的に神経炎症を経時的にモニタリングし、神経疾患の早期診断に活用できます。

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

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