Name: 肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶ肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導法。microRNA-200とGRHL2の発現により、がんの表現型可塑性と治療への影響を解明し、上皮様状態への移行を促す治療戦略の開発に貢献する。

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JASはデュークがん研究所、デューク大学泌尿生殖器腫瘍学研究所、および整形外科のデューク大学の学部からの支援を認めています。 HLは、理論生物物理学のための国立科学財団（NSF）センターによってサポートされていました（NSF PHY-1427654）およびNSF DMS-1361411、およびテキサス州の癌研究におけるCPRITとして（がん予防とテキサス州の研究所）奨学生ライス大学。 KEWはメアリー・C・ファラック-カーソン、JN Onuchic、サミル・M・ハナッシュ、ケネス・J・ピエンタ、ドナルドS. Coffeyのに有用な議論の恩恵を受けたNIH F32 CA192630 MKJ及びHLによって支持されました。

試薬の調製<ol><li>ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン（5,000 U / mL）をDMEMの500mLのに5mlを50ミリリットルを添加することによって、細胞培養のためのDMEMを調製します。この媒体は最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> 10μMの最終濃度にヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥されたプライマーを再懸濁します。 -20℃で保存して再懸濁したプライマー。 </li><li>放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（150mMのNaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、50mMトリス、pH8.0）に調製します。使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足し、使用時には氷の上のバッファを維持します。 4°Cで保存。 </li><li> 0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを用いて滅菌水およびシリンジフィルター中10mg / mLのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）を準備。ソリューションは、最大6ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> PBSの10mLの中10mgを溶解することによりニトロブルーテトラゾリウムクロリドの1mg / mlのワーキング溶液を調製します。 4°Cで保存。</li></ol> GRHL2 2.レンチウイルス形質導入 1日目 <ol><li>プレート補充DMEM 2mL中の6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 HEK293T細胞。自動細胞カウンターを用いて細胞を定量化します。 5％CO 2で37℃で一晩培養した後、60％コンフルエント-細胞は40でなければなりません。 </li></ol> 2日目 <ol start="2"><li> 1.8pΔ8.9μgのとのpCMV-VSV0.2μgのと共に無血清培地200μlの2空ベクターμgの（のpCMV-UBC-EGFP）又は2のpCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24μgの、25を希釈-Gヘルパープラスミド。別個のチューブにおいて、トランスフェクションあたり無血清培地の200μL（二つのサンプル400μL8μL）中の脂質ベースのトランスフェクション試薬の4μLに希釈します。各プラスミド溶液に、トランスフェクション試薬混合物の200μLを加え、室温で20分間インキュベートします。 </li><li> incuba中、ンは、真空吸引によって培地を除去し、PBS 1mLで細胞を洗浄することによりHEK293T細胞を洗浄します。無血清培地の800μLとPBSを交換してください。 5％CO 2中で37℃で2時間細胞を各ウェルにステップ2.2滴下からのプラスミド混合物をインキュベートし、20分後、トランスフェクション試薬の200μLを加えます。 </li><li>慎重に真空吸引によりトランスフェクション培地を除去して補充したDMEMの2mLで交換してください。一晩の培養インキュベーターにセルを返します。 注：HEK293T細胞は緩く付着しています。メディアの交換は、皿またはフラスコの底から細胞を除去することを制限するように注意して行わなければなりません。 </li></ol> 3日目 <ol start="5"><li>補充DMEM 2 mlにトランスフェクトされたHEK293T細胞とプレートの6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 RD細胞を培地をリフレッシュ。一晩の培養細胞。 RD細胞は、市販のヒト横紋筋肉腫細胞株です。 </li></ol> 4日目 </P&gt; <ol start="6"><li> HEK293T細胞からのウイルスのメディアを収集します。新しい15 mLコニカルにHEK293T細胞および場所からDMEM培地をピペット。慎重に新しいDMEM培地に交換し、次の日のために戻っインキュベーターでHEK293T細胞を置きます。 </li><li>二つの新しい50mlにウイルス培地1mL当たりの10mg / mLのポリブレンコニカルチューブ（空ベクタートランスフェクション用とGRHL2トランスフェクションのための別）の2μLを加えます。 3mLのシリンジからプランジャーを取り外し、先端に0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けることにより、シリンジフィルターウイルス媒体。 <ol><li>注射器のバレルにステップ2.6に収集ウイルスメディアを追加し、そしてポリブレンを含有する新しい50 mLコニカルチューブに培地を突入。真空吸引によってRD細胞から培地を除去し、RD細胞濾過ウイルスメディアを追加します。 </li></ol></li></ol> 5日目 <ol start="8"><li>ウイルスのメディアが収集された後に繰り返して4日目HEK293T細胞を破棄することができます。 </li></ol> 7日目 </強いです&gt; <ol start="9"><li> PBS 1mlで洗浄RD細胞およびウェルあたり0.05％トリプシンの200μLを加えます。 、5分間37℃でインキュベート補充した培地2 mLを加え、そして新しい15 mLコニカルに細胞懸濁液を移動させます。室温と吸引メディアで5分間250×gで遠心分離細胞。 DMEM 1mLの（5％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）中に再懸濁します。 注：FBSの高い割合を使用するには、フローサイトメトリーの間に目詰まりを起こすことがあり<ol><li>フローサイトメトリーのためのフィルタセル。氷上のチューブと場所チューブ、フローサイトメトリーに30μmのフィルターを通して1mLのRD細胞懸濁液を適用するためにピペットを使用。 </li><li> DMEMの0.5 mLを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブにソート+ EGFP細胞26は、氷上で、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン及び場所を補充しました。プレートEGFP +培養インキュベーター中、12ウェルプレート及び場所の単一のウェルに添加したDMEM 1mLの合計で細胞を選別しました。 ;注：フローサイトメトリーからこの形質導入後のEGFP +細胞の収率は、通常、低い（50,000〜100,000細胞）です。ステップ3に進む前に、14日 - 細胞は、10培養する必要があるかもしれません。 </li></ol></li></ol> miR-200Sの3リバーストランスフェクション<ol><li>反復凍結/融解サイクルを回避するために、-20℃で、ヌクレアーゼフリーのH 2つの Oアリコートストック及びストアを使用したmiR-200模倣体の50μMのストックを調製。 </li><li> 300μlの無血清培地を無血清培地300μLまたは50μM陰性対照miRNAの9μLを各50μMのmiR-200模倣（MIR-200A、のmiR-200B、およびmiR-200C）の3μLを加えます。 </li><li>無血清培地の600μLに対するsiRNA特異的トランスフェクション試薬の6μLを添加し、2本のチューブ、ステップ3.2からの二つのmiR混合物の各々のための1つに、この混合物の300μLを分割します。トランスフェクション試薬の300μLの混合物でステップ3.2からそれぞれのmiR混合物の300μLを組み合わせます。部屋TEで20分間インキュベートmperature。 </li><li>インキュベートしながら、処置あたり無血清培地の2.4mLの（250個の細胞/μL）でセクション2で作成したEVやGRHL2を発現60万EGFP + RD細胞の細胞懸濁液を調製します。 </li><li> 24ウェルプレートでは、6つのウェルにステップ3.3からのmiR-200の混合物または陰性対照ミックスウェル当たり100μLを追加し、それぞれのmiRミックスの3つのウェルに各細胞懸濁液400μLを加えます。 </li><li>一晩CO 2 5％で37℃で細胞をインキュベートし、完全に次の日DMEMを補完するために、メディアを変更します。適切な緩衝液（下記参照）を使用して分析のために2日後に細胞を回収。 METを受けRD肉腫細胞のタイムラプスイメージングは​​、補足資料として提供されています。画像の自動化生細胞イメージャ27を使用して10倍を目的とした各ウェルごとに2時間。 </li></ol> 4. RNA抽出、逆転写、および定量PCR <ol><li>標準RNAを使用して、製造業者の指示に従ってRNAを抽出抽出キット24。抽出されたRNAは、-80℃で保存することができます。 </li><li> RNA濃度を定量化します。解凍し、氷上でRNAで動作します。 RNA濃度を定量化するために、製造業者のプロトコルに従ってプレートリーダー分光光度計を用いて260nmでのUV吸光度を測定します。ヌクレアーゼフリー水で最低の濃度になるように、全ての試料を希釈します。 </li><li>相補的DNA（cDNA）にトータルRNAの逆転写を行います。 20μlの反応容量24に転写し、ヌクレアーゼフリー水、逆PCRバッファ、dNTPミックス（100ミリモル）、ランダムヘキサマープライマーを用いてトータルRNAのない未満100 ngのを結合しません。製造者のプロトコールに従ってRTサイクルを実行します。 cDNAを-20℃で長期保存することができます。 </li><li>ヌクレアーゼを含まないH 2 Oの80μL100μLに20μLの反応を希釈</li><li>蛍光ベースの挿入色素2倍のqPCRマスターミックスの5μL、各10μMプライマーの0.06μLを混合サンプルあたりの希釈RT反応のND 2μL。 </li><li>蛍光ベースのマスターミックスのための製造業者のプロトコルに従って、定量PCRを実行します。 </li><li>デルタCT法によるmRNAの相対量を定量化し、GAPDHに正規化します。各治療群の標準偏差±生物学的複製の平均mRNA発現をプロットします。 注：RNAを扱う場合には、特別な注意事項は、RNaseフリーのプラスチックおよび試薬を使用するなどのRNase、との接触を避けるように注意する必要があります。非使い捨て機器は、RNアーゼを削除するには、使用前に処理しなければなりません。 </li></ol> 5.免疫蛍光染色<ol><li>次のステップ3.6、24ウェルフォーマットでRD細胞からの真空吸引により吸引媒体。 </li><li>ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLを加えることによって細胞を固定し、室温（RT）で15分間インキュベートします。必要に応じて固定後、リン酸場所細胞を4℃で一晩生理食塩水（PBS）とストアバッファリング。 </li><li>透過処理PBS + 0.2％のTriton-X100の500μLを添加し、RTで30分間インキュベートすることにより細胞。真空吸引によって、透過化緩衝液を除去し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> 5％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBS 500μLでブロックし、室温で30分間、細胞をインキュベートします。必要であれば、細胞を4℃で一晩保存することができます。 </li><li>一次抗体の希釈を準備します。 15 mLコニカルに5％BSAのピペットを200μL/ウェルPBS（12個のウェル= 2.4 mL）および5％BSA 1mLあたり一次抗体の1μLを追加/ PBSは、必要に応じ。真空吸引によってブロッキングバッファーを除去し、各ウェルに希釈した一次抗体200μLを分注します。 <ol><li>室温で又は一晩4℃で1時間、5％BSA / PBS中で一次抗体を希釈千：1で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li></ol></li><li>上記のように5％BSA / PBSの同じ体積の二次抗体の希釈液を調製。 2000希釈：1を使用して遠赤色色素結合二次抗体を追加します。さらに追加ミックスにHoechst色素を1μg/ mLです。 PBSを削除し、各ウェルにミックスの200μLを追加します。 <ol><li>暗所で室温で1時間インキュベートします。 PBSで3回洗浄し、PBSで細胞を残し、そして箔を用いた光から細胞を保護します。必要であれば、細胞を4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 650nmの - 励起波長594を有する倒立落射蛍光顕微鏡で400倍総合倍率で画像セル。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティング<ol><li>氷冷PBSで2回3.6から細胞を洗浄します。氷の上に、1×RIPA緩衝液の50μLで溶解細胞は、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。 </li><li> 15分間4℃でロック溶解物を、1.5mLのチューブにライセートを収集し、そしてサンプルを明確に5分間高速（2万XG）で遠心分離。必要に応じて細胞溶解物を-80℃で長期保存することができます。 </li><li>ブラッドフォードアッセイを用いて総タンパク質を定量し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに等量のタンパク質をアリコート。ブリン2-メルカプトエタノールを補充したRIPA緩衝液と3倍のLaemmliローディング緩衝液を用いて等量のg個のサンプル。 </li><li> 95℃で5分間、1XのLaemmliサンプルローディングバッファーでサンプルをインキュベートし、45分間200 Vで4-12％のトリス - グリシンゲルを用いてSDS-PAGEを実行します。タンパク質の量は、細胞株に応じた範囲をロードしました。いくつかのケースでは、全タンパク質の50〜100μgの間葉系細胞株におけるE-カドヘリンを検出するために必要とされます。 </li><li> 1×トリス - グリシントランスファー緩衝液中の50 Vで2時間ニトロセルロース膜に転写タンパク質。 </li><li> BSAベースのブロッキング緩衝液中で室温または一晩、4℃で1時間ブロック膜。 </li><li> 、ブロッキング緩衝液5ml 1,000濃度を膜に希釈液を追加し、穏やかに室温で又は一晩4℃で1時間、揺らしながらインキュベート：1で一次抗体を希釈します。 0.05％Tween-20を用いて膜をPBSで3回洗浄します。 </li><li>赤外蛍光結合secondarと共にRTで1時間膜をインキュベート1のY抗体：上記のようにブロッキング緩衝液20,000希釈。 </li><li> 0.05％のTween-20を含むPBS中で膜を2回洗浄し、PBS中で次に一度。 </li><li>標準の赤外蛍光検出を用いた画像の膜。 </li></ol> 7.足場非依存性増殖アッセイ注：詳細軟寒天アッセイプロトコルの場合、28を参照してください。 <ol><li>湯浴中で42°Cまで暖かい滅菌2X DMEM培地。この間、熱が3分間マイクロ波中で1％アガロースを事前オートクレーブ。必要に応じて、一度に又は完全に溶融するまでさらに30秒間電子レンジ。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置き、1で1％アガロース及び2X DMEM培地を混ぜる：6ウェルプレートにウェルあたり混合物1.5mlのための1比アカウンティング。必ずピペッティング誤差を考慮して、気泡を避けるために、余分なDMEM /アガロースを準備します。 </li><li>に混合物を追加ウェルの側面、気泡フォームを確保せず、室温で30分間放置。 </li><li>底層が固化されている間、培地を吸引し、1mLのPBSで1回洗浄することにより、ステップ3でトランスフェクトされたRD細胞の各群を準備します。吸引PBSと0.05％トリプシンの0.2 mLを加え、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>単一細胞懸濁液を形成するために、メディア及び粉砕物細胞の0.8 mLのトリプシンを中和します。 15 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li>細胞を数え、ウェルあたり10,000個の細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算します。 </li><li>完全に溶融するまでの時間で30秒、続いて3分間マイクロ波で0.6％アガロースを加熱します。 42°Cの水浴にアガロース移動します。 </li><li>無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置きます。 6ウェルプレートにウェル当たり混合物の1.5mLのを準備するために1：1の比で0.6％アガロース希釈細胞懸濁液を混合します。必ずピペッティング誤差を考慮して混ぜアガロース/余分な細胞懸濁液を調製し、泡を避けるために。 注：ここは42°Cで動作することが重要です。温度が低すぎると、混合物は、めっき前に固化し、42°C以上の温度では細胞生存率に影響を与えます。 </li><li>細胞を数回粉砕することによってよく混合し、気泡フォームを保証しない、ウェルに細胞混合物を添加し、RTで20分間凝固させ。 </li><li> 各ウェルに添加した培地2 mLを加え、インキュベーターにプレートを移動させます。 <ol><li> 3-4週間または多細胞コロニーが形成するまで、週に一度メディアを変更します。真空吸引により培地を除去する際の寒天に触れないように注意してください。代替的に、液体媒体の最上層を除去するために、P1000を使用します。 </li><li>ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液の200μL（PBS中1mg / ml）を添加することによって、軟寒天プレートを染色し、37℃で一晩プレートをインキュベートします。撮像のためにPBSで翌日のメディアを交換してください。 </li><li>倒立顕微鏡で40倍総合倍率での画像ウェル。 </li><li>コロニー面積と数のためのImageJの分析を行います。プロットは、標準偏差±生物学的複製のコロニー数を意味します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

肉腫はまれですが、間葉系細胞系譜の非常に攻撃的な癌。彼らの間葉系統にもかかわらず、肉腫のサブセットは、より多くの上皮様状態への表現型の転移を起こすように見えます。より多くの上皮様腫瘍の患者は、24あまり積極的であるとして、このMET-のようなスイッチは、予後関連性を持っています。その臨床的関連性にもかかわらず、肉腫でこれらの表現型の遷移を駆動する分子メカニズムを扱ういくつかの研究があります。 肉腫細胞におけるMETのような遷移を調べるために、我々は、上皮要因GRHL2とのmiR-200ファミリーの発現を組み合わせることによって、MET-誘導モデルを開発しました。この方法は、急速に上皮様形態および遺伝子発現の変化によって測定されるようになること肉腫細胞を誘導します。肉腫細胞にMETを誘導するためにこのプロトコルを使用すると、このような、肉腫の侵略を駆動表現型のこれらの遷移の影響の研究を促進します移動、浸潤、増殖と死の抵抗として、どのように生物学におけるこれらの変化のそれぞれは、薬剤耐性に影響を与えることができます。 <p cla...

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表現型の可塑性は、細胞の表現型との間の可逆的な遷移を指し、一般に二つのタイプ、上皮 - 間葉（EMT）遷移と間葉ツー上皮移行（MET）に分割されています。この表現型の可塑性は、このような開発や創傷治癒1と多細胞生物の正常なプロセスにおいて重要な役割を果たしています。しかしながら、これらの同じ経路および遺伝子発現プログラムはまた、線維症のような疾患につながることができ、（2に概説、3、4）、癌転移（参考文献5、6、7、8に概説）。転移の間に、例えば、EMTは、細胞極性、細胞-細胞相互作用を破壊、および浸潤9,10を促進します。一緒に、EMTが貢献します癌細胞の普及を促進する表現型状態秒。また、EMTはまた、癌細胞の代謝6の規制緩和、薬物抵抗11、12の開発を含む積極的な表現型を駆動する他の表現型の変化、増加腫瘍開始能13,14及び免疫回避15をホストのホストにつながります。 表現型可塑性はよく癌の進行に研究されてきました。しかし、肉腫はまた、表現型の可塑性を示します。癌における表現型の可塑性の同じドライバーのいくつかはまた、肉腫の可塑性と積極性に貢献しているかのよう興味深いことに、それが表示されます。例えば、肉腫患者からの循環腫瘍細胞（CTCのは）のEpCAM、典型的には上皮細胞16に見出される細胞表面タンパク質を発現することが示されています。 ADDItionally、250個の軟部組織肉腫サンプルは遺伝子発現に基づいて、上皮様または間葉様に分類しました。上皮様バイオマーカーの署名の患者は間葉様バイオマーカーの署名17の患者よりも良い予後を持っていました。これは、より多くの上皮様癌の患者は、より間葉様腫瘍18の患者と比較して、より良い結果を持っている多くの癌腫、と一致しています。 いくつかの肉腫は、バイオマーカーおよびMETと一致した遺伝子発現の経路を表示しますが、この表現型可塑性の分子基盤はよくわかっていないまま。肉腫にMETのメカニズムおよびドライバを研究するために、我々は2上皮固有の要因を使用してMET誘導のモデルを開発し、マイクロRNA（MIR）-200家族とgrainyheadのような2（GRHL2）。 MIR-200S messenの3&#39; のUTRに結合することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAのファミリーでありますGERのRNAとタンパク質への翻訳を阻止します。 miR-141およびmiR-200Aを含むもの、およびmiR-200B、MIR-200C、およびmiR-429を含む他の - のmiR-200ファミリーは、2つのサブグループから成ります。 miR-200ファミリーのメンバーは、上皮組織に富んでいる、とのmiR-200Sの損失は癌19に転移と関連しています。 miR-200ファミリーはまた、正常組織20と比較して、軟組織肉腫にダウンレギュレートされます。 miR-200Sと同様に、GRHL2は、上皮の開発21のために重要である重要な調節因子です。例えばE-カドヘリンなどの上皮の遺伝子をアップレギュレートする2つの方法でGRHL2転写因子が作用する：1）上皮細胞において、GRHL2直接EMTマスタレギュレータ、ZEB1 22を抑制する。 2）GRHL2直接上皮遺伝子23の転写を活性化します。私たちの以前の研究は、肉腫細胞におけるmiR-200SとGRHL2の組み合わせ表現を示していますMET様表現型24を誘導します。ここで、我々は、miR-200SとGRHL2の異所性発現を使用して肉腫細胞におけるMET誘導のin vitroモデルを作成するための詳細なプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>Countess 自動カウンター</td><td>ライフテクノロジー</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCRマイクロプレート</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Starting Block (PBS) Blocking Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSAベースのブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>Agarose General Purpose LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>ランニングバッファー</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu;m ニトロセルロース</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA mimic negative control #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>抗エカドヘリン抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>抗βアクチン</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad(株)ラボラトリ</td>ーズ <td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>パルテックセルトリクス</td><td>シスメックス</td><td>04-004-2326</td><td>30 &m 流れ用フィルター</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>エカドヘリン-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>エカドヘリン-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACカガガクトGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>ニトロブルーテトラゾリウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン</td><td>シグマ</td><td>H9268</td><td>ポリブレン</td></tr><tr><td>3 mL シリンジ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>309657シリン</td><td></td></tr>ジ <tr><td>フィルター</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5mL ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>352063</td><td></td><td>フローサイトメトリーチューブ</td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4368814</td><td>逆転写キット</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルジヒド</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>ΣA7906</td><td></td></tr></tbody></table>

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

表現型の可塑性は、細胞が一過別系統の形質を獲得する現象をいいます。癌の進行中に、表現型可塑性が侵略、普及および転移を駆動します。表現型の可塑性の研究のほとんどは、上皮由来の癌の文脈でされているが実際に、それはmesenchymal-に似た現象を受け肉腫のサブセットで、また、表現型の可塑性を示し、起源に間葉ある肉腫を、判明します上皮移行（MET）。ここで、我々は、それぞれ、順次GRHL2およびmiR-200ファミリーは、細胞形質導入およびトランスフェクションを使用して発現肉腫患者samples.Weで観察されたこのMET状現象を模倣するためのmiR-200ファミリーとgrainyhead様2（GRHL2）を含む方法を開発しました、より良い肉腫細胞におけるこれらの表現型の遷移の分子基盤を理解します。 miR-200SとGRHL2を表現肉腫細胞が強化された上皮characteristを実証しました細胞形態および上皮および間葉バイオマーカーの変化にICS。これらのメソッドを使用して今後の研究では、より良い、このような移動、浸潤、転移性の傾向、および治療抵抗として肉腫細胞にMETのようなプロセスの表現型の結果を理解するために使用することができます。

肉腫細胞におけるMETの誘導のためのスキーマ肉腫細胞におけるMET状変化の誘導のための一般的なタイムラインは、 図1に示されています。プロトコルは、miR-200ファミリー（ 図1B）のトランスフェクションに続いてGRHL2（ 図1A）を 、形質導入することによって開始します。 GRHL2またはmiR-200ファミリーメンバーは、単独で発現された場合に、RD細胞の外観に影響を与えることができなかったが、一緒にGRHL2及びmiR-200Sの異所性発現RD細胞における上皮様形態学的変化をもたらします。増加した細胞-細胞接触（ 図1C）とより丸みを帯びた外観に紡錘状の形態からの細胞転移。 肉腫細胞におけるMETのよ...

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

本手順の全体的な目的は、肉腫における間葉系-上皮系移行に伴う表現型への影響を研究することです。この手法は、上皮様肉腫が、より間葉系に近い肉腫と比較してなぜ予後が良好であるのかという重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、肉腫における間葉系-上皮系移行に関連する下流の遺伝子調節ネットワークおよび表現型を研究するための、簡便で再現性のある手段を提供することです。肉腫における表現型可塑性をより深く理解することで、肉腫をより緩徐な上皮様状態へと移行させることが可能な治療的介入を特定したいと考えています。本手順の実演は、当研究室の学部生であるJackson XuとShivee Giljaが行います。導入の1日目に、サプリメント添加DMEM 2 mLを用いて、6ウェルプレートの2つのウェルにそれぞれ3 × 10⁵個のHEK293T細胞を播種します。プレートを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。一晩培養した後、顕微鏡下で細胞を確認してください。コンフルエンシーが40〜60%になっている必要があります。次に、1.8 µgのp delta 8.9および0.2 µgのpCMV-VSV-Gヘルパープラスミドを含む200 µLの無血清培地を入れた個別のチューブに、2 µgの空ベクターおよび2 µgのGRHL2含有ベクターをそれぞれ希釈します。別のチューブで、1回のトランスフェクションあたり4 µLの脂質ベースのトランスフェクション試薬を200 µLの無血清培地で希釈します。2サンプル分の場合、これは8 µLの試薬と400 µLの培地になります。各プラスミド溶液に200 µLのトランスフェクション試薬混合液を加え、室温で20分間インキュベートします。その間に、バキュームアスピレーターを用いてHEK293T細胞から培地を除去します。細胞を1 mLのPBSで1回洗浄し、PBSを800 µLの無血清培地に置き換えます。20分後、400 µLのトランスフェクション試薬およびプラスミド混合液を、播種済みの細胞が入った各ウェルに滴下して加えます。ディッシュを37°C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。インキュベーション後、真空吸引を用いてトランスフェクション培地を慎重に除去します。HEK293T細胞は接着性が弱いため、培地を吸引する際は、ディッシュやフラスコの底から細胞を剥離させないよう注意してください。吸引した培地を、2 mLのサプリメント添加DMEMに置換します。細胞をインキュベーターに戻し、一晩培養します。翌日、トランスフェクションしたHEK293T細胞の培地を交換します。次に、補完済みDMEMを1ウェルあたり2mL含む6ウェルプレートの各ウェルに、RDヒト横紋筋肉腫細胞を3×10⁵個ずつ播種します。両方のプレートを一晩培養します。4日目に、ピペットを用いてHEK293T細胞からウイルス含有培地を回収し、空ベクターを含むレンチウイルス用とGRHL2プラスミドを含むレンチウイルス用の2本の新しい15mLコニカルチューブにそれぞれ移します。培地を新しいDMEMに慎重に交換し、HEK293T細胞をインキュベーターに戻して一晩培養します。次に、空ベクター導入用とGRHL2導入用の2本の新しい50 mLコニカルチューブに、ウイルス培地1 mLあたり10 mg/mL polybreneを2 µLずつ加えます。3 mLシリンジからプランジャーを抜き、シリンジの先端に0.45 µmポリエーテルスルホンフィルターを取り付けます。先に回収したウイルス培地をシリンジのバレルに入れ、polybreneを含む新しい50 milliliter conical tubeのいずれかに注入します。もう一方のサンプルでもこの操作を繰り返します。次に、RD細胞から培地を真空吸引で除去し、ろ過したウイルス培地サンプルを各2 milliliterずつ、RDプレートの別々のウェルに加えます。RD細胞を、加湿したインキュベーター内で37 °Cでインキュベートします。翌日、ウイルス含有培地の回収を繰り返し、以前に感染させたRD細胞が入っている同じウェルに感染培地を加えます。ウイルス含有培地の回収後、HEK293T細胞は廃棄して構いません。細胞をさらに2日間インキュベートします。7日目に、RD細胞を1 mLのPBSで洗浄し、各ウェルに0.05% trypsinを200 µL加えます。37 °Cで5分間インキュベートします。2 mLの補充培地を加え、細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに移します。室温で250 gで5分間、細胞を遠心分離します。遠心後、培地を吸引し、5% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補充したDMEM 1 mLで細胞を再懸濁します。フローサイトメトリーの準備として細胞をろ過するため、ピペットを用いて1 mLのRD細胞懸濁液を、滅菌済みの30 µmチューブトップフィルターを通してフローサイトメトリー用チューブに分注します。チューブを氷上に置きます。フローサイトメーターを使用し、EGFP陽性細胞を、10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM 0.5 mLを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに分取します。ソートした細胞を再び氷上に置きます。空ベクターおよびGRHL2を導入した両方のEGFP陽性細胞を、12ウェルプレートの別々のウェルに、サプリメント添加DMEM計1 mLで播種します。その後、細胞をインキュベーターに入れ、培養します。フローサイトメトリー後のEGFP陽性細胞の回収数は通常かなり少なく、50,000から100,000細胞の範囲となります。そのため、次のステップに進む前に、細胞をさらに10〜14日間培養する必要がある場合があります。マイクロ遠心チューブに、50 µMの各miR-200 mimicを3 µLずつ、300 µLの無血清培地に加えます。別のチューブに、50 µMのネガティブコントロールmicro RNA 9 µLを、無血清培地300 µLに加えます。次に、別のマイクロ遠心チューブに、siRNA特異的トランスフェクション試薬6 µLを、無血清培地600 µLに加えます。この混合液から300 µLを2本のチューブに分け、それぞれ2種類のmiR混合液に使用します。各miR混合液300 µLを、300 µLのトランスフェクション試薬混合液と合わせて混ぜ合わせます。室温で20分間インキュベートします。インキュベートしている間に、MDベクターまたはGRHL2を発現するEGFP陽性RD細胞600,000個の細胞懸濁液を、1処理あたり血清不含有培地2.4 mL（250 cells/µL）で調製します。24ウェルプレートの6つのウェルに、miR-200または陰性コントロールミックスを1ウェルあたり100 µLずつ添加します。次に、各miRミックスの3つのウェルに、それぞれの細胞懸濁液を400 µLずつ添加します。プレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、培地を完全補完 DMEM に交換します。2日後に、適切なバッファーを用いて解析用の細胞を回収します。自動ライブセルイメージング装置を用い、10倍対物レンズで2時間ごとに各ウェルを撮影します。これらのタイムラプス画像は、GRHL2、EGFP、およびmiR-200 miRNAを発現するRD細胞における間葉系-上皮系移行（MET）を示しています。細胞は紡錘形から石畳状の外観へと変化し、細胞間接着が増加し、より円形に近い形態となります。他の処理条件下ではMETは観察されません。その代わりに、細胞は細胞間接着が少ない、細長い紡錘形の形態を示します。MET誘導において、GRHL2およびmiR-200の過剰発現に伴うRD細胞の形態変化は、qPCRおよびウェスタンブロッティングで測定した上皮マーカーであるE-cadherinの発現上昇を伴っていました。miR-200sの添加のみでE-cadherinは発現上昇しましたが、miR-200sとGRHL2を併せて過剰発現させた場合、E-cadherinの発現が相乗的に増強されました。免疫蛍光顕微鏡法で示されたように、白矢印で示される上皮性接着分子EpCAMおよびTJP-1が、細胞間接合部において増加していました。上皮性タンパク質のアップレギュレーションは、qRT-PCRによる間葉系遺伝子ZEB1およびNotch1のダウンレギュレーションを伴っていました。METの誘導により、ソフトアガー増殖アッセイで測定したRD細胞の足場独立性増殖が抑制されました。軟寒天中での増殖抑制はmiR-200sのみによって誘導され、GRHL2の過剰発現は足場独立性増殖の増加をもたらしました。これは、GRHL2の発現が足場独立性増殖を誘導するという以前の報告と一致しています。本手順に続き、肉腫におけるMETの表現型への影響を解明するために、細胞の遊走、浸潤、転移、および治療応答の変化を測定するアッセイを含む他の手法を実施することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

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癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

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創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ...

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

蛍光活性化細胞選別によるヒト肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍開始細胞の単離に関する詳細なプロトコルを説明し、ヒト白血病抗原-1(HLA-1)を陰性マーカーとして用い、さらなる検証を行う。これらのHLA-1陰性腫瘍始発細胞の特徴付け。...

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β...

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

このシグナル経路に関与するタンパク質および遺伝子発現を研究することにより、TGF-βシグナル伝達およびTGF...

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

本プロトコルは、血小板活性化因子(PAF)誘導形質転換を研究するために改変された非形質転換乳房上皮細胞株MCF10Aの3D...

三次元培養におけるリン脂質メディエーター誘導形質転換

学ぶ肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導法。microRNA-200とGRHL2の発現により、がんの表現型可塑性と治療への影響を解明し、上皮様状態への移行を促す治療戦略の開発に貢献する。

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

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