次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。

この実験の全体的な目標は、次世代シーケンシングに適した植物葉組織からの色素体DNAとミトコンドリアDNAの両方である高品質のオルガネラDNAを単離するために使用される2つの方法を比較することです。これらの方法は、分類群全体のオルガネラの多様性の程度や、オルガネラのゲノム配列または構造の変化が発生とストレス応答にどのように影響するかなど、植物生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。1つの特定のオルガネラタイプを濃縮する示差遠心分離法と、小さな凍結組織サンプルから全オルガネラDNAを回収するメタ分画法の2つの技術を比較します。

小麦の苗を育てるための標準的な手順は、バーミキュライトに種を植え、角ごとに4〜6個の種子が入った正方形の鉢に植えることです。鉢を温室に移し、16時間の光サイクルで移動します。毎日植物に水をやります。

発芽時に小さじ1/4杯の粒状20-20-20 MPK肥料で植物を施肥し、発芽後7日目に再び肥料を与えます。小麦の苗の称賛、植物の種子の植え付け、標準的な手順と同様に植物の世話をします。ただし、ポットを暗い成長チャンバーに入れます。

暗い成長室でこれらの苗を育てる代わりに、温室内の植物を覆うことですが、適切な換気が必要です。この手順の最初のステップは、細胞小器官を分離することです。5グラムの新鮮なティッシュを採取し、氷の上の冷やしたビーカーで冷たく滅菌した水ですすいでください。

ハサミを使用して、葉の組織を約1cmの小片に切断し、2つのセラミック粉砕シリンダーを含む予冷済みの50mmチューブに直接入れます。手順全体を通してサンプルを氷の上に保ちます。クロスコンタミネーションを避けるためには、サンプル間でハサミを交換することが重要です。

サンプルをヒュームフードに持って行き、各50ミリリットルのチューブに20ミリリットルのSTEバッファーを追加します。サンプルを組織粉砕装置内の予め冷却された極低温粉砕ブロックに入れ、サンプルを1分あたり1,750回転で30秒間粉砕します。サンプルを氷の上に約1分間置きます。

サンプルの位置を回転させ、1分あたり1, 750回転でさらに30秒間粉砕します。サンプルをアイスバケツに戻します。各サンプルについて、氷の中に置かれたきれいな50ミリリットルのチューブに漏斗を挿入し、漏斗にろ過布の1つの層を置きます。

ろ過布を5ミリリットルのSTEバッファーで事前に濡らし、流れを保存します。均質化された組織を漏斗に注ぎます。15ミリリットルのSTEバッファーで粉砕チューブをすすぎ、チューブをキャップして反転させ、壁と蓋をすすぎ、内容物を漏斗に注ぎます。

セラミックストーンを慎重に取り除き、ろ過布を絞り出して漏斗に入れます。クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間で手袋を交換してください。こぼれないように、チューブキャップをパラフィンフィルムで包みます。

2, 000 x Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、血清ピペットを使用して、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、密閉ガスケットが締まった50ミリリットルの高速遠心分離チューブに入れます。はかりに小さな氷のビーカーを置き、はかりを引き裂き、各上清を量ります。

STE緩衝液を使用してチューブのバランスを0.1グラム以内に調整し、摂氏4度で18、000×Gで20分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、サンプルをドラフトに戻し、上清を捨てます。1ミリリットルのSTバッファーをペレットに加え、柔らかい絵筆を使用して穏やかに再懸濁します。

24ミリリットルのSTバッファーを追加して、最終容量を25ミリリットルにします。懸濁液で絵筆を静かに回転させて混ぜ合わせ、チューブの側面にある絵筆を押してすべての液体を取り除き、絵筆を取り外す前に。チューブのバランスをとった後、摂氏4度で18, 000 x Gで20分間遠心分離します。

この遠心分離中に、テキストプロトコルに記載されているようにDNAの1溶液を調製し、サンプルあたり1.5ミリリットルのチューブに200マイクロリットルを分注します。遠心分離が完了したら、上清を捨て、チューブを吸い取ります。各高速遠心分離チューブに、300マイクロリットルのSTEバッファーを追加し、柔らかいペイントブラシを使用してペレットを再懸濁します。

あらかじめ用意した1.5ミリリットルのDNA1溶液200本入りチューブに絵筆を入れ、筆を回してブラシに詰まったペレットを取り除きます。DNAの1溶液を高速遠心チューブにピペットで移し、穏やかに渦巻いて混合します。各チューブの上部にパラフィンフィルムを巻き付け、37°Cの水浴中で30分間インキュベートします。

インキュベーション中は、渦を巻いて穏やかに混合します。オリフィスが広いピペットチップを使用して、ペレット混合物をチューブから静かにピペットで取り出し、1.5ミリリットルの低結合チューブに入れます。500マイクロリットルの400ミリモルEDTA、pH 8.0を高速遠心チューブに加えます。

静かにピペットでペレットを動かして残留ペレットを完全に取り除き、EDTAをペレット混合物を含む低結合チューブに移します。反転させてやさしく混ぜます。18, 000 x Gで、摂氏4度で20分間遠心分離します。

その後、上清を捨て、各チューブを吸い取り、すぐにペレットをDNA単離に使用します。この方法では、市販のDNA抽出カラムを用いて抽出した全ゲノムDNAからオルガネラDNAを濃縮します。製造元の指示に従って、必要な量のMBD2 FCタンパク質結合磁気ビーズを調製し、総インプットDNAの1〜2マイクログラムを使用するように反応をスケーリングします。

このデモンストレーションでは、1マイクログラムの総インプットDNAに対して160マイクロリットルのビーズが必要です。メチル化核DNAを捕捉するには、個々のサンプルごとに160マイクロリットルのMBD2結合磁気ビーズが入ったチューブに1マイクログラムの入力DNAを追加し、幅の広いボアチップで静かに上下にピペットで動かします。最終濃度が1倍になるように適切な量の5倍バインドウォッシュバッファーを添加し、幅の広いボアチップでサンプルを数回ピペットで上下に動かして混合します。

チューブを室温で15分間回転させます。プルダウンを成功させるには、インキュベーション中にビーズを十分に混合することが重要です。特に、ビーズの凝集が著しい場合はなおさらです。ビーズの凝集を防ぎ、メチル化DNAを確実に引き下げるために、ワイドボアピペットチップでサンプルを優しくピペットで動かし、インキュベーション中にサンプルを2〜3回フリックします。

DNAと磁気ビーズの混合物が入ったチューブを短時間回転させます。チューブを磁気ラックに少なくとも5分間置き、ビーズをチューブの側面に集めます。溶液は透明に見えるはずです、それは非メチル化オルガネラが豊富なDNAを含んでいます。

ワイドボアチップを使用して、ビーズを乱さずに透明化した上清を慎重に取り除き、上清を清潔で結合力の低い2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。サンプルは摂氏20度または80度で保管します。急性PCRアッセイを使用して、全ゲノムDNA中の3つのオルガネラ特異的インプリコンの相対的な存在量と、両方の方法から得られたオルガネラDNA画分を評価しました。

全体として、データは、示差遠心分離法がミトコンドリアを優先的に濃縮することを示しています。メチル分画された全ゲノムDNAの非メチル化画分は、両方のオルガネラ含意の実質的な濃縮を示す。ミトコンドリアまたは葉緑体中国の春とクリスで栽培された小麦の参照ゲノムにマッピングされたリードの割合は、QPCRの結果と一致しています。

分画遠心分離は、ミトコンドリアDNAにより濃縮されたDNAを生じさせ、メチル分画は、2つのオルガネラゲノムの天然存在量を反映した可能性が高いDNAを生じさせる。Eを含むサンプルラベルは牧歌化されたサンプルを示し、NEは非牧歌化されたサンプルを示します。興味深いことに、アイディル化はオルガネラの存在量を変化させませんでした。

どちらの方法でも、ミトコンドリアまたは葉緑体参照ゲノムの理論的カバレッジは、12のライブラリがアトレマルチプレックスされた場合でも、100倍を超えます。全ゲノムDNAは、フィールド後のゲル電気泳動で拡散塗抹標本として移動し、50キロベースを超えます。メチル分画後の核画分はサイズが小さくなりますが、50キロベース付近にとどまっており、メチルフラクチオアントDNAがロングリードシーケンシングに最も適していることが示唆されています。

習得すると、両方のオルガネラDNA抽出技術は、適切に実行すれば、サンプル収集から最終製品の評価まで、1〜2日で実行できます。メチル分画技術は、組織インプットが非常に少ないため、オルガネラDNA研究の範囲を希少で困難なサンプルにまで大幅に拡大する可能性があります。ただし、ダウンストリーム研究にミトコンドリアDNAのみが必要な場合は、分画遠心分離が依然として望ましい場合があります。

同様に、遠心分離のステップは、必要に応じて色素体DNAを優先的に抽出するように調整できます。どちらのオルガネラDNA抽出法も、次世代シーケンシングに適したDNAが得られますが、メチル分画はロングリードシーケンシングに最適な高分子率のDNAをもたらします。