Name: 次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 学ぶ植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析。差動遠心分離とメチル化フラクショネーションを用いて、次世代シークエンシングに適した高品質プラスチドおよびミトコンドリアDNAの分離技術を評価する。

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私たちは、米国農務省農業研究庁と国立科学財団（IOS 1025881およびIOS 1361554）からの資金提供を認めたいと思います。私たちはR. Caspersに温室保全とプラントケアに感謝します。イルミナライブラリーの調製と配列決定が行われたミネソタ大学ゲノミクスセンターにも感謝します。私たちはまた、ジャーナル編集者と4人の匿名の査読者からのコメントに感謝して、私たちの原稿をさらに強化しました。我々はまた、OECDに、これらのプロトコルを日本の同僚との共同プロジェクトに統合するためのSKへのフェローシップに感謝する。

<ol><li>Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+plant+development+and+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in plant development and stress tolerance.</a> Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).</li>
<li>Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odintifier--A+computational+method+for+identifying+insertions+of+organellar+origin+from+modern+and+ancient+high-throughput+sequencing+data+based+on+haplotype+phasing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing.</a> BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).</li>
<li>Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+plant+organellar+genome+assembly%2C+based+on+whole+genome+data+from+the+454+GS+FLX+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform.</a> Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).</li>
<li>Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+of+wild+and+domesticated+rices+%28Oryza+AA+genome+species%29+based+upon+whole+chloroplast+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences.</a> Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).</li>
<li>Iorizzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+the+carrot+mitochondrial+genome+using+next+generation+sequencing+of+whole+genomic+DNA+provides+first+evidence+of+DNA+transfer+into+an+angiosperm+plastid+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome.</a> BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequences+of+organelle+genomes+from+the+medicinal+plant+Rhazya+stricta+%28Apocynaceae%29+and+contrasting+patterns+of+mitochondrial+genome+evolution+across+asterids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids.</a> BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).</li>
<li>Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+mitogenome+of+the+parasitic+plant+Viscum+scurruloideum+is+extremely+divergent+and+dynamic+and+has+lost+all+nad+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).</li>
<li>Wicke, S., Schneeweiss, G. M. Chapter 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWicke%2C+S+%22Next+Generation+Sequencing+in+Plant+Systematics%22">Next Generation Sequencing in Plant Systematics</a>. Hörandl, E., Appelhans, M. , Koeltz Scientific Books. (2015).</li>
<li>Sloan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+ring+to+rule+them+all%3F+Genome+sequencing+provides+new+insights+into+the+%27master+circle%27+model+of+plant+mitochondrial+DNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure.</a> New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).</li>
<li>Woloszynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteroplasmy+and+stoichiometric+complexity+of+plant+mitochondrial+genomes--though+this+be+madness%2C+yet+there%27s+method+in%27t%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't.</a> J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).</li>
<li>Ahmed, Z., Fu, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+with+a+wider+applicability+to+isolate+plant+mitochondria+for+mtDNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction.</a> Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).</li>
<li>Ejaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+scale+methods+for+the+rapid+and+efficient+extraction+of+mitochondrial+DNA+from+wheat+crop+suitable+for+down-stream+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes.</a> Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).</li>
<li>Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+plant+mitochondria+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis.</a> Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).</li>
<li>Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+extraction+and+assembly+methods+for+simultaneously+obtaining+plastid+and+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes.</a> PLoS One. 9 (9), e108291(2014).</li>
<li>Pomeroy, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+respiratory+properties+of+mitochondria+isolated+from+developing+winter+wheat+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings.</a> Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).</li>
<li>Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+organelle+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis organelle isolation and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).</li>
<li>Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007487806583">A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower.</a> Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).</li>
<li>Pinard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+whole+genome+amplification-induced+bias+through+high-throughput%2C+massively+parallel+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing.</a> BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+Nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system.</a> BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).</li>
<li>Raley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.biorxiv.org/content/early/2014/03/25/003566">Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Tsai, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+Complexity+of+Human+Skin+Metagenomes+Using+Single-Molecule+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing.</a> MBio. 7 (1), e01948(2016).</li>
<li>Feehery, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+selectively+enriching+microbial+DNA+from+contaminating+vertebrate+host+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA.</a> PLoS One. 8 (10), e76096(2013).</li>
<li>Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+and+metagenome+sequencing%3A+Using+the+human+methyl-binding+domain+to+partition+genomic+DNA+derived+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues.</a> Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).</li>
<li>Noyszewski, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+evolution+of+the+mitochondrial+genome+in+an+alloplasmic+line+of+durum+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat.</a> BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).</li>
<li>Qiagen. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. , 5th ed, Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2016).</li>
<li>E.M. Corporation. User Guide: Microcon Centrifugal Filter Devices. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100</a> (2013).</li>
<li>Qiagen. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2001).</li>
<li>New England BioLabs, Inc.. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit: Instruction Manual Version 4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf">http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf</a> (2015).</li>
<li>Qiagen. QIAGEN Genomic DNA Handbook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2012).</li>
<li>PacificBiosciences. Guidelines for Using the BIO-RAD® CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electrophoresis System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf</a> (2016).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+cereal+mitochondrial+genomes+as+revealed+by+complete+nucleotide+sequencing+of+the+wheat+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).</li>
<li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+wheat+plastome+as+revealed+by+complete+sequencing+of+chloroplast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA.</a> Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).</li>
<li>International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-based+draft+sequence+of+the+hexaploid+bread+wheat+%28Triticum+aestivum%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+chloroplasts+and+mitochondria+contain+so+many+copies+of+their+genome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?</a> Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).</li>
<li>Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+DNA+damage%2C+molecular+integrity%2C+and+copy+number+for+plastid+DNA+and+mitochondrial+DNA+during+maize+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).</li>
<li>Ma, J., Li, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+genome+copy+number+variation+and+integrity+during+moderate+maturation+of+roots+and+leaves+of+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings.</a> Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).</li>
<li>Lang, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+of+pure+and+intact+chloroplasts+and+mitochondria+from+moss+as+the+basis+for+sub-cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics.</a> Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).</li>
<li>Tobin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+plant+tissues.+Isolation+of+chloroplasts+and+mitochondria+from+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves.</a> Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).</li>
<li>PacificBiosciences. Procedure & Checklist - 10 kb to 20 kb Template Preparation and Sequencing with Low (100 ng) Input DNA. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf</a> (2015).</li>
<li>PacificBiosciences. Template Preparation and Sequencing Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf</a> (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益がないと宣言している。 この刊行物に記載されている商号または商品の説明は、特定の情報を提供する目的のみであり、米国農務省の推奨または保証を意味するものではありません。 USDAは平等な機会提供者と雇用者です。

今日まで、ほとんどのオルガネラ配列研究は、特定のDNAを豊富にする伝統的なDC法を中心に研究しています。モス40を含む多様な植物からオルガネラを単離する方法が記載されている。小麦15および小麦11などの単子葉植物;アラビドプシス11 、ヒマワリ17 、ナタネ14などの双子葉植物が挙げられる。ほとんどのプロトコルは、いくつかの種子11を含む組織型の種々のために適合されたもので、葉組織13、14、15、16、17...

<html>ゲノム配列決定は、重要な植物形質の根底にある遺伝的根拠を解明するための強力なツールです。ほとんどのゲノムシーケンシング研究は、遺伝子の大部分が核内に位置するため、核ゲノムの内容に焦点を当てています。しかし、（真核生物にわたる）ミトコンドリアと色素体（植物中で、特殊な形式、葉緑体、光合成で動作）を含む細胞小器官のゲノムは、生物の開発、ストレス応答、および全体的なフィットネス1に不可欠な重要な遺伝情報を貢献します。オルガネラゲノムは、通常、核ゲノム配列決定を目的とした全DNA抽出に含まれますが、DNA抽出に先立つオルガネラ数を減らす方法も使用されています2 。多くの研究は、オルガネラゲノムを組み立てるために、総gDNAの抽出からの配列決定結果を使用していた3、4、5、外部参照&quot;&gt; 6、7。しかし、多くの人がしている読み取るための研究の目標は、合計のgDNAは、シーケンシングコストを増大させ使用して、細胞小器官のゲノムに焦点を当てているとき、『特に大きな核ゲノムを有する植物で、核DNA配列に』失われましたまた、による核ゲノム中へのオルガネラ配列の複製、転写および細胞小器官の間に、配列決定の正しいマッピング位置を解決することは、適切なゲノムに読み出しバイオインフォマティクス2,8に挑戦されている。核ゲノムからオルガネラゲノムの精製が1でありますミトコンドリアと葉緑体との間の相同性領域にマッピングされる読み取りを分離するために、さらなるバイオインフォマティクス戦略を使用することができる。 多くの植物種からのオルガネラゲノムが配列決定されているが、オルガネラゲノム多様性の幅についてはほとんど知られていない野生の集団または栽培された繁殖プールで利用可能である。オルガネラゲノムはまた、反復配列間の組換えのために重要な構造的再編成を受ける動的分子であることが知られている9 。さらに、オルガネラゲノムの複数のコピーが各オルガネラ内に含まれ、複数のオルガネラが各細胞内に含まれる。これらのゲノムの全てのコピーが同一であるとは限らず、ヘテロプラスミーとして知られている。 「マスターサークル」の正統図とは対照的に、サブゲノム円、線状染色体、線状コンカテマー、分枝構造など、細胞小器官ゲノム構造のより複雑な画像の証拠が増えています10 。植物オルガネラゲノムの集合は、それらの比較的大きなサイズおよび実質的な逆方向反復および直接反復によってさらに複雑になる。 オルガネラ単離、DNA精製およびその後のゲノムに関する従来のプロトコール<html> E配列は、多くの場合、煩雑であり、いくつかのグラム、組織入力の大容量を必要とするように上方に始点11、12、13、14、15、16、17、必要に応じて、若い葉の組織のグラム数百。これは、組織が限られている場合、細胞小器官のゲノム配列決定が不可能になります。いくつかの状況では、交配によって維持されなければならない雄性不稔性系統または世代別に配列決定する必要がある場合など、種子の量は限られる。このような状況では、細胞小器官のDNAを精製してから全ゲノム増幅を行うことができます。しかしながら、全ゲノム増幅は、構造変化、サブゲノム構造、およびヘテロプラスミーレベルを評価する際に特に問題となる、有意な配列決定バイアスを導入することができる&gt; 18。短リードシーケンシング技術のライブラリ作成における最近の進歩は、全ゲノム増幅を回避するために低入力障壁を克服してきた。例えば、Illumina Nextera XTライブラリー調製キットでは、1 ngのDNAを入力19として使用できます。しかしながら、PacBioまたはOxford Nanopore配列決定技術のような長時間配列決定アプリケーションのための標準ライブラリー調製は、オルガネラゲノム配列決定のための課題を提起することができる比較的多量の入力DNAを依然として必要とする。最近、新しいユーザー作られた、長読みシーケンシングプロトコルは、入力量を低減し、DNAのマイクログラム-量を得ることが21、20困難なサンプルではゲノム配列決定を促進するために開発されてきました。しかしながら、これらのライブラリー調製物に供給するための高分子量の純粋なオルガネラ画分を得ることは、依然として課題である。 私たちは全ゲノム増幅を必要とせずに、NGSに適したオルガネラDNA濃縮および単離法を比較し最適化する。具体的には、葉のサブサンプルなどの限られた出発物質から高分子量細胞小器官DNAを濃縮するためのベストプラクティスを決定することでした。この研究は、（1）市販のDNA CpG-メチル結合ドメインタンパク質プルダウンアプローチの使用に基づく（2）DNA分画プロトコルに対する、改変された伝統的な微分遠心分離プロトコルである細胞小器官DNAを濃縮する方法の比較分析を提示する22は、組織23を植える適用しました。我々は、小麦葉組織からのオルガネラDNAの単離のためのベストプラクティスを推奨しており、これは他の植物および組織タイプに容易に拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール(β-メルカプトエタノール;BME)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール (イソプロピルアルコール/イソプロパノール)、バイオ試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、Bio-Rad Cetified Megabase アガロース</td><td>Bio-Rad</td><td>1613108 分析</td><td></td></tr><tr><td>天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>AB54-S</td><td></td></tr><tr><td>天びん</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>セラミック粉砕シリンダー、3/8インチ x 7/8インチ</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブを保持するための組織ホモジナイザーと互換性のある極低温ブロック</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5 M溶液、pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr>ゲル<tr><td>イメージングシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル</td><td></td><td></td>染色剤(<td>GelRedや臭化エチジウム</td></tr>などの<tr><td>粉砕乳棒、2 mLコニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td>用ワイドチップ</tr><tr><td>グアニジン-HCl、8 M溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR)Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma harzianum</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>磁気ラック</td><td>ThermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、LoBind 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、標準的なヌクレアーゼフリー1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機、冷蔵</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Legend X1R</td><td>または同等の製品は、50 mLチューブ、Oak Ridgeチューブ、および1.5 mLチューブのマイクロ</td></tr><tr><td>遠心分離機、室温</td><td>のEppendorf</td><td>5424</td><td>または同等の製品用のローターで少なくとも18,000 x gに達することができる必要があります1.5 mLおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ用のローターで少なくとも18,000 x gに達することができる必要があります</td></tr><tr><td>Microcon DNA高速フロー遠心フィルターユニット</td><td>EMDミリポア</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>ミラクロス、漏斗に合うようにカットされたサンプルあたり1平方</td><td>EMD ミリポア</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBネクストマイクロバイオーム DNAエンリッチメントキット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックポットとトレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン (PVP)</td><td>フィッシャー</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>キアゲン</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>パルスフィールドゲル電気泳動装置 (CHEF DR III など) バイオ</td><td>・ラッド</td><td>1703697</td><td></td></tr><tr><td>精製ビーズ、Agencourt AMpureXP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 20/g ゲノムチップ DNA 抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen バッファー EB (溶出バッファー)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA抽出バッファーセット</td><td>Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCRマシン(例:Roche Light Cycler 480)</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCRプレートシーリングフィルム</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>qPCRプレート、96ウェルプレート</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット&nbsp;アッセイチューブ</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>キュービットブロードスペクトラムアッセイキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ Q32850</td><td></td></tr><tr><td>キュービット高感度アッセイキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット(20 mL)およびピペットエイド</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>小さな漏斗、サンプルごとに1つ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>アン<td>ビオン</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>ソフトペイントブラシ、サンプル</td><td></td><td></td><td></td>あたり2</tr><tr><td>SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinderまたは別のタイプの組織ホモジナイザー</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>または別の同等の組織ホモジナイザー。ティッシュホモジナイザーを利用できない場合は、事前に冷却した乳鉢と乳棒で粉砕するだけで十分です(詳細については、プロトコルを参照してください)。ただし、ホモジナイザーを使用すると、より一貫した結果が得られ、総均質化時間が短縮されます。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>オムニピュア</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>プロメガ</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>チューブ ローテーラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ、50 mL 円錐形ポリプロピレン</td><td>コーニング</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、50 mL高速ポリプロピレン&nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>例:Nalgene Oakridgeチューブまたは同等の</td></tr><tr><td>バーミキュライト</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水、滅菌済みでヌクレアーゼフリーの認定水&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー1481</td><td></td></tr><tr><td>水、滅菌ミリQ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラdna濃縮法の最適化と比較分析

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

植物オルガネラゲノムは、複雑な構造および/またはサブゲノム断片を形成するために対合または組換えを受ける可能性がある、大きな反復要素を含む。オルガネラゲノムはまた、所与の細胞または組織型（ヘテロプラスミー）内での混合物として存在し、多量のサブタイプは、発達中またはストレス下で変化し得る（化学量論的部分シフト）。オルガネラゲノムの構造と機能をより深く理解するためには、次世代シーケンシング（NGS）技術が必要です。伝統的な配列決定研究は、細胞小器官DNAを得るためにいくつかの方法を使用する：（1）大量の出発組織を使用する場合、それをホモジナイズし、分画遠心分離および/または勾配精製に供する。 （種子、材料、又は空間が限られている場合、すなわち、）（2）組織の少量が使用される場合、同じプロセスが（1）十分なDNAを得るために、全ゲノム増幅に続いてのように行われます。 （3）バイオインフォマティクス分析は、seq総ゲノムDNAを調べ、オルガネラの読みを解析する。これらの方法にはすべて固有の課題とトレードオフがあります。 （1）では、そのような多量の出発組織を得ることは困難であり得る。 （2）において、全ゲノム増幅は配列決定バイアスを導入し得る; （3）において、核ゲノムとオルガネラゲノムとの間の相同性が、アセンブリおよび分析を妨害する可能性がある。大きな核ゲノムを有する植物では、オルガネラDNAを濃縮して、バイオインフォマティクス分析の配列決定コストおよび配列複雑性を低減することが有利である。ここでは、伝統的な微分遠心分離法を第4の方法、適合したCpG-メチルプルダウン法と比較して、全ゲノムDNAを核および細胞小器官画分に分離する。いずれの方法も、ミトコンドリアおよび葉緑体において異なる比率であるにもかかわらず、細胞小器官配列に対して高度に濃縮されたNGS、すなわちDNAに対して十分なDNAを生じる。我々は、小麦の葉組織のためのこれらの方法の最適化を提示し、主要な利点およびdサンプル入力、プロトコルの容易性、および下流のアプリケーションの文脈における各アプローチの長所である。

この原稿で提示されたプロトコルは、植物組織からオルガネラDNAを富化するための2つの異なる方法を記載している。ここに示した条件は、小麦組織の最適化を反映しています。プロトコルの重要なステップ、必要な組織入力、およびDNA出力の比較を図1に示します。我々がテストしたDCプロトコールのステップは、以前に記載されたものと同様の条件に従う（ 図1A ）。収穫された組織は、新たに処理され、インタクトな細胞小器官を単離するために示差遠心分離および/または勾配に供されなければならない。オルガネラが溶解される前に核DNAが除去され、最後にDNAが抽出され、下流の用途に使用される。対照的に、MFプロトコルでは、使用前に植物組織を採取して保存することができ、完全な細胞小器官は不要である。その代わりに、核および細胞小器官のDNAは、<html> DNAのメチル化状態。両方のプロトコールは、ほぼ同量の細胞小器官DNAを産生する（ 図1C...

2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

この実験の全体的な目標は、次世代シーケンシングに適した植物葉組織からの色素体DNAとミトコンドリアDNAの両方である高品質のオルガネラDNAを単離するために使用される2つの方法を比較することです。これらの方法は、分類群全体のオルガネラの多様性の程度や、オルガネラのゲノム配列または構造の変化が発生とストレス応答にどのように影響するかなど、植物生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。1つの特定のオルガネラタイプを濃縮する示差遠心分離法と、小さな凍結組織サンプルから全オルガネラDNAを回収するメタ分画法の2つの技術を比較します。小麦の苗を育てるための標準的な手順は、バーミキュライトに種を植え、角ごとに4〜6個の種子が入った正方形の鉢に植えることです。鉢を温室に移し、16時間の光サイクルで移動します。毎日植物に水をやります。発芽時に小さじ1/4杯の粒状20-20-20 MPK肥料で植物を施肥し、発芽後7日目に再び肥料を与えます。小麦の苗の称賛、植物の種子の植え付け、標準的な手順と同様に植物の世話をします。ただし、ポットを暗い成長チャンバーに入れます。暗い成長室でこれらの苗を育てる代わりに、温室内の植物を覆うことですが、適切な換気が必要です。この手順の最初のステップは、細胞小器官を分離することです。5グラムの新鮮なティッシュを採取し、氷の上の冷やしたビーカーで冷たく滅菌した水ですすいでください。ハサミを使用して、葉の組織を約1cmの小片に切断し、2つのセラミック粉砕シリンダーを含む予冷済みの50mmチューブに直接入れます。手順全体を通してサンプルを氷の上に保ちます。クロスコンタミネーションを避けるためには、サンプル間でハサミを交換することが重要です。サンプルをヒュームフードに持って行き、各50ミリリットルのチューブに20ミリリットルのSTEバッファーを追加します。サンプルを組織粉砕装置内の予め冷却された極低温粉砕ブロックに入れ、サンプルを1分あたり1,750回転で30秒間粉砕します。サンプルを氷の上に約1分間置きます。サンプルの位置を回転させ、1分あたり1, 750回転でさらに30秒間粉砕します。サンプルをアイスバケツに戻します。各サンプルについて、氷の中に置かれたきれいな50ミリリットルのチューブに漏斗を挿入し、漏斗にろ過布の1つの層を置きます。ろ過布を5ミリリットルのSTEバッファーで事前に濡らし、流れを保存します。均質化された組織を漏斗に注ぎます。15ミリリットルのSTEバッファーで粉砕チューブをすすぎ、チューブをキャップして反転させ、壁と蓋をすすぎ、内容物を漏斗に注ぎます。セラミックストーンを慎重に取り除き、ろ過布を絞り出して漏斗に入れます。クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間で手袋を交換してください。こぼれないように、チューブキャップをパラフィンフィルムで包みます。2, 000 x Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、血清ピペットを使用して、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、密閉ガスケットが締まった50ミリリットルの高速遠心分離チューブに入れます。はかりに小さな氷のビーカーを置き、はかりを引き裂き、各上清を量ります。STE緩衝液を使用してチューブのバランスを0.1グラム以内に調整し、摂氏4度で18、000×Gで20分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、サンプルをドラフトに戻し、上清を捨てます。1ミリリットルのSTバッファーをペレットに加え、柔らかい絵筆を使用して穏やかに再懸濁します。24ミリリットルのSTバッファーを追加して、最終容量を25ミリリットルにします。懸濁液で絵筆を静かに回転させて混ぜ合わせ、チューブの側面にある絵筆を押してすべての液体を取り除き、絵筆を取り外す前に。チューブのバランスをとった後、摂氏4度で18, 000 x Gで20分間遠心分離します。この遠心分離中に、テキストプロトコルに記載されているようにDNAの1溶液を調製し、サンプルあたり1.5ミリリットルのチューブに200マイクロリットルを分注します。遠心分離が完了したら、上清を捨て、チューブを吸い取ります。各高速遠心分離チューブに、300マイクロリットルのSTEバッファーを追加し、柔らかいペイントブラシを使用してペレットを再懸濁します。あらかじめ用意した1.5ミリリットルのDNA1溶液200本入りチューブに絵筆を入れ、筆を回してブラシに詰まったペレットを取り除きます。DNAの1溶液を高速遠心チューブにピペットで移し、穏やかに渦巻いて混合します。各チューブの上部にパラフィンフィルムを巻き付け、37°Cの水浴中で30分間インキュベートします。インキュベーション中は、渦を巻いて穏やかに混合します。オリフィスが広いピペットチップを使用して、ペレット混合物をチューブから静かにピペットで取り出し、1.5ミリリットルの低結合チューブに入れます。500マイクロリットルの400ミリモルEDTA、pH 8.0を高速遠心チューブに加えます。静かにピペットでペレットを動かして残留ペレットを完全に取り除き、EDTAをペレット混合物を含む低結合チューブに移します。反転させてやさしく混ぜます。18, 000 x Gで、摂氏4度で20分間遠心分離します。その後、上清を捨て、各チューブを吸い取り、すぐにペレットをDNA単離に使用します。この方法では、市販のDNA抽出カラムを用いて抽出した全ゲノムDNAからオルガネラDNAを濃縮します。製造元の指示に従って、必要な量のMBD2 FCタンパク質結合磁気ビーズを調製し、総インプットDNAの1〜2マイクログラムを使用するように反応をスケーリングします。このデモンストレーションでは、1マイクログラムの総インプットDNAに対して160マイクロリットルのビーズが必要です。メチル化核DNAを捕捉するには、個々のサンプルごとに160マイクロリットルのMBD2結合磁気ビーズが入ったチューブに1マイクログラムの入力DNAを追加し、幅の広いボアチップで静かに上下にピペットで動かします。最終濃度が1倍になるように適切な量の5倍バインドウォッシュバッファーを添加し、幅の広いボアチップでサンプルを数回ピペットで上下に動かして混合します。チューブを室温で15分間回転させます。プルダウンを成功させるには、インキュベーション中にビーズを十分に混合することが重要です。特に、ビーズの凝集が著しい場合はなおさらです。ビーズの凝集を防ぎ、メチル化DNAを確実に引き下げるために、ワイドボアピペットチップでサンプルを優しくピペットで動かし、インキュベーション中にサンプルを2〜3回フリックします。DNAと磁気ビーズの混合物が入ったチューブを短時間回転させます。チューブを磁気ラックに少なくとも5分間置き、ビーズをチューブの側面に集めます。溶液は透明に見えるはずです、それは非メチル化オルガネラが豊富なDNAを含んでいます。ワイドボアチップを使用して、ビーズを乱さずに透明化した上清を慎重に取り除き、上清を清潔で結合力の低い2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。サンプルは摂氏20度または80度で保管します。急性PCRアッセイを使用して、全ゲノムDNA中の3つのオルガネラ特異的インプリコンの相対的な存在量と、両方の方法から得られたオルガネラDNA画分を評価しました。全体として、データは、示差遠心分離法がミトコンドリアを優先的に濃縮することを示しています。メチル分画された全ゲノムDNAの非メチル化画分は、両方のオルガネラ含意の実質的な濃縮を示す。ミトコンドリアまたは葉緑体中国の春とクリスで栽培された小麦の参照ゲノムにマッピングされたリードの割合は、QPCRの結果と一致しています。分画遠心分離は、ミトコンドリアDNAにより濃縮されたDNAを生じさせ、メチル分画は、2つのオルガネラゲノムの天然存在量を反映した可能性が高いDNAを生じさせる。Eを含むサンプルラベルは牧歌化されたサンプルを示し、NEは非牧歌化されたサンプルを示します。興味深いことに、アイディル化はオルガネラの存在量を変化させませんでした。どちらの方法でも、ミトコンドリアまたは葉緑体参照ゲノムの理論的カバレッジは、12のライブラリがアトレマルチプレックスされた場合でも、100倍を超えます。全ゲノムDNAは、フィールド後のゲル電気泳動で拡散塗抹標本として移動し、50キロベースを超えます。メチル分画後の核画分はサイズが小さくなりますが、50キロベース付近にとどまっており、メチルフラクチオアントDNAがロングリードシーケンシングに最も適していることが示唆されています。習得すると、両方のオルガネラDNA抽出技術は、適切に実行すれば、サンプル収集から最終製品の評価まで、1〜2日で実行できます。メチル分画技術は、組織インプットが非常に少ないため、オルガネラDNA研究の範囲を希少で困難なサンプルにまで大幅に拡大する可能性があります。ただし、ダウンストリーム研究にミトコンドリアDNAのみが必要な場合は、分画遠心分離が依然として望ましい場合があります。同様に、遠心分離のステップは、必要に応じて色素体DNAを優先的に抽出するように調整できます。どちらのオルガネラDNA抽出法も、次世代シーケンシングに適したDNAが得られますが、メチル分画はロングリードシーケンシングに最適な高分子率のDNAをもたらします。

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