ペアになっているビーズと磁石配列変数の凹面形状とマイクロウェルを成形
January 28th, 2018
この原稿は、高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成の堅牢なメソッドを紹介します。磁気力、スチール ビーズ、貫通穴の配列を使用して、いくつかの百マイクロウェルは 3 cm × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板に形成されました。
この方法の全体的な目標は、磁力アシスト、セルフロック金属ビーズを利用して、凹状の球状マイクロウェルを製造することです。こんにちは、私の名前はギ・フン・リーで、中安大学のティーチングアシスタントです。私たちの研究室では、バイオ機器の開発、その培養、新しいミクロ構造に関する研究を強化するために、さまざまなマイクロスケールのデバイスやプラットフォームを作製することに興味を持っています。
私たちの研究テーマの一つは、これを3次元環境で収縮させるための新しいマイクロデバイスと方法論の開発です。私たちはこれをカルチャーと呼んでいます。培養は、従来の2次元平面培養よりも実際の組織に似ているため、3次元応答を理解するのに非常に役立ちます。
フラスコやチューブ、ドラムネット、電子レンジなど、スプレッド生産のためのいくつかの方法が試みられてきました。これらの方法の中で、凹型マイクロ法は、3つのDプロデュースを生成するための非常に強力なツールです。マイクロウェアの任意のピッチは、それぞれが監視し、球体のサイズと分布を制御する能力です。
ここでは、ビーズと小さな磁石を並べた凹型マイクロウェアの作製方法を提案します。この技術により、静止ビーズを補助する磁力機構により、100個の凹型マイクロウェアを作製することができます。増強は、各凹面で異なるプロセスにあり、繰り返し発生する命題スケールはありません。
まず、230 x 30のスルーホールアレイアルミニウムプレートは、CNCロータリー彫刻機を使用して作られました。この場所は、次のセクションに示すように、ビーズのガイドロールを提供します。砂鉱は異なる直径のドリルビットで穴を開け、小さい穴のプレートを底に配置しました。
プレートを揃えるために、外側の角にも穴が開けられています。次に、2つのプレートを位置合わせ、積み重ね、N本のボルトをリメン穴に挿入してロックし、ナットで固定します。前述のように、メーカーは、ビーズがガイドウェル内に固定されるように、底に小さな穴を開けたプレートを配置することが重要です。
次のステップは、ネオジム磁石の30×30アレイを準備することです。まず、磁石を手動で絶縁し、2×2の配列に配置します。次に、ピンセットを使用してそれらをより大きな配列に整列させます。
適切なマグネットアレイを作成するには、各磁石が隣接する磁石と反対の極性である必要があります。さらに、アレイの破損や飛散を防ぐために、マグネットアレイの底面に両面テープでアルミ板を貼り付けています。これで、マイクロウェルモールドに作った各ピースを組み立てる準備が整いました。
マグネットアレイは、通常のテープを使用して底板に慎重に取り付けられます。マグネットアレイは、磁石が下を向くように取り付けられていることが重要です。アルミニウム板とマグネットアレイが適切に順序付けられた後、鋼ビーズがプレートアセンブリに配置されます。
私たちの論文で使用されているビーズは、直径600ミクロンのSUJ2つのスチールビーズです。私たちのアライメントプロセスは非常にシンプルです。アセンブリに十分な数のビーズを流し込み、アクリル板を使用してそれらをこすり落とします。
下部の磁石がビードを閉じ込め、アルミ板の穴に入り込み、穴に詰まらなかった余分なビードは掻き取り工程で取り除かれます。余分なビーズは別の磁石を使用して除去されます。ビーズがガイドウェル内にきちんと収まったら、トッププレートの取り外しに進みます。
この過程で、ビーズが脱落してずれてしまう場合があります。この場合、ピンセットを使用して手動でビーズを穴に戻します。これで、凹型マイクロウェルモールドの準備が整いました。
プラットフォームを別のペトリ皿に移動し、次のステップに備えます。PDMSは、メーカーの指示に従って、PDMSモノマーと硬化剤を10対1の割合で混合して調製します。PDMS混合物に閉じ込められた気泡を取り除くために、混合物をデシケーターに約1時間入れて脱気します。
これが完了したら、脱気したPDMS混合物を取り、それを凹型マイクロウェルモールドに注ぎ、再度脱気します。次に、PDMS混合物を80°Cのホットプレートで2時間焼き、PDMSサブトレイを埋め込みます。次のプロセスは細心の注意を払って実行する必要があります。
除去プロセスを容易にするために、メタノールをサブトレイに注ぎ、周辺PDMSサブトレイを順番に除去します。製造業者は、メタノールが隙間に十分に浸透してきれいに除去されるように確認する必要があることに注意する必要があります。その後、PDMSサブトレイをアルミプレートから取り外すと、サブトレイを剥がす前に端をカットする方が簡単です。
最後に、PDMSサブトレイからビーズを取り出します。取り外す前に、サブトレイを伸ばしてしばらく飛ばし、ビーズとPDMSサブトレイの間の結合を緩めます。ビーズの実際の除去は非常に簡単で、大きな磁石を使用して行うことができます。
凹型マイクロウェルの作製が終了し、マイクロウェルは細胞培養の準備が整いました。当社のPDMSプラットフォームが細胞の培養に適しているかどうかを確認するために、以下の手順を実施しました。まず、直径14mmのバイオプシーパンチを使用して、凹型マイクロウェルパターンPDMSサブトレイを切断しました。
PDMSサブトレイを滅菌した後、24ウェルプレートに入れます。次に、PDMSサブトレイ全体を4%のプルロン酸F-127溶液で一晩コーティングして、細胞がマイクロウェル表面に付着するのを防ぎます。コーティングプロセスでは、マイクロウェルに閉じ込められた気泡をピペッティングまたは超音波クリーナーを使用して除去する必要があります。
気泡が残っていないことを確認した後、約200万個の細胞を含む1ミリリットルの細胞培地溶液をPDMSサブトレイに播種します。次に、1000マイクロリットルのピペットを使用して培地を吸引し、マイクロウェルに閉じ込められなかった余分な細胞を取り除き、細胞がインキュベーターに入るようにすべてを設定します。マイクロウェルパターンの凸型を作製することに成功し、市販の鋼ビーズを30×30のスルーホールアレイに閉じ込めた。
ビーズは、ビーズと対応するスルーホールとの間にガスなしでしっかりと保持されました。作製した凹型マイクロウェルの形状は、直径600ミクロンの凹型半球状で、これはスチールビーズの形状と同じです。凹型マイクロウェルの断面図を見ると、隣接するマイクロウェルからの距離は1mmで、スルーホールと同じであることがわかります。
脂肪由来幹細胞を凹型マイクロウェルで培養しました。直径14mmの凹型マイクロウェルアレイに200万個の細胞を播種しました。24時間後、細胞はスフェロイドに凝集しました。
マイクロウェルアレイで形成されたスフェロイドの平均直径は185.68ミクロンでした。3日目には、細胞はより凝集していましたが、スフェロイドの平均直径は147ミクロンに減少しました。この手順に従うと、100の凹状球状マイクロウェルを、コスト効率が高く、比較的簡単な方法で製造できます。
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概要
この原稿では、磁力とスチールビーズを使用して凹面マイクロウェルを製作する堅牢な方法を紹介します。この技術により、3cm x 3cmのポリジメチルシロキサン（PDMS）基板に数百のマイクロウェルを形成することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- マイクロファブリケーション
- バイオテクノロジー
背景
- 凹面マイクロウェルは、三次元細胞培養を研究するために不可欠です。
- 従来の製作方法は複雑で高価になる可能性があります。
- この研究は、手軽に入手可能な材料を使用してプロセスを簡素化することを目指しています。
- 磁力支援技術は、マイクロデバイス製作の効率を向上させることができます。
研究の目的
- 凹面マイクロウェルを作成するためのコスト効果の高い方法を開発すること。
- 三次元細胞培養環境の理解を深めること。
- バイオデバイス開発とマイクロ構造製作の研究を促進すること。
使用された方法
- スチールビーズを操作するための磁力の利用。
- PDMS基板に貫通穴配列の作成。
- コンパクトな領域に数百のマイクロウェルを形成すること。
- 細胞培養のための製作されたマイクロウェルの有効性の評価。
主要な結果
- 複雑な機器なしで凹面マイクロウェルの製作に成功。
- この方法のスケーラビリティと効率性の実証。
- 三次元細胞培養研究の向上における潜在的な応用。
- 実験結果を通じた方法の検証。
結論
- この方法は、マイクロファブリケーションの研究者にとって実用的な解決策を提供します。
- 三次元環境における細胞反応を研究するための新しい道を開きます。
- このアプローチにより、マイクロデバイス製作に関連するコストを大幅に削減できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Uniform spheroid generation in concave microwells enables predictive modeling of cellular behavior in drug discovery and regenerative medicine research. This scalable, cost-efficient fabrication method supports high-throughput, reproducible 3D culture platforms critical for early-stage screening and mechanistic de-risking. The approach enhances portfolio confidence by standardizing microenvironmental conditions for functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables controlled 3D microenvironments for interrogating cell-cell interactions and pathway responses.
- Supports functional validation of targets in physiologically relevant spheroid models.
- Facilitates mechanistic de-risking by minimizing variability in spheroid size and distribution.
- Improves predictive confidence for downstream biological triage.
Screening & Assay Development
- Provides standardized microwell arrays for reproducible spheroid-based assays.
- Enables quantitative assessment of compound effects on uniform spheroids.
- Supports scalability for high-content screening and platform reuse.
- Reduces assay variability by ensuring consistent spheroid formation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro spheroid models with disease-relevant tissue architecture.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation using consistent 3D systems.
- Supports translational biomarker studies by enabling controlled microenvironments.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible data.
Pipeline & Workflow Integration
This microwell fabrication method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and assay development in 3D culture systems.
- Discovery Biology: Standardizes 3D culture conditions for hypothesis-driven target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spheroid assays for compound evaluation.
- Analytics: Enables precise measurement of spheroid size and aggregation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking tissue-like environments.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform adaptable across cell types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D cell-based assays.
- Operational Value: Streamlines fabrication, enhances reproducibility, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust 3D data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication and 3D cell culture techniques.
- Needs access to basic laboratory instrumentation and analytical imaging tools.
- Demands cross-team standardization for reproducible spheroid formation and analysis.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific applications.
- Limited by manual assembly steps and potential for bead displacement during fabrication.
