Name: 重大な病気のマウスモデルにおける流体、医薬品や栄養管理のための中心静脈ラインの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ中心静脈ラインを用いたマウス敗血症モデル構築法。CLP法と集中治療技術を組み合わせ、長期重篤疾患の代謝変化と内分泌異常の病態を再現し、集中治療医学の治療戦略研究に応用可能です。

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GVdBは、ルーヴェン大学(KU Leuven)を通じて、フランダース政府が資金提供するメスサレムプログラム(METH08/07)から長期的な構造研究支援を受け、欧州連合の第7次フレームワークプログラムのアイデアプログラムから欧州研究評議会アドバンスドグラントAdvG-2012-321670を保持しています。SETは、フランダース研究財団(FWO)のリサーチアシスタントフェローシップを受賞しました。

プロトコルは、動物研究のための大学ルーベンの倫理審査委員会によって承認されました。 静脈ラインの調製<ol><li>迅速にホット（&gt; 220°C）ゴマ油60センチmicrorenathane（MRE）管の中央部を浸漬することにより、静脈カテーテルの先端を準備します。続いて穏やかに互いに離れるチュービングの端部を移動させることにより、細径（外径（OD）&lt;0.5 mm）を生成するために、チューブの中央部分を伸ばします。 </li><li> （ 図1、 表1参照 ）30センチメートルそれぞれの2つの部分にチューブを切断する手術用メスの刃を使用します。 </li><li>ポリエチレンPE50コネクタを用いてポリエチレンチューブPE10にMREチューブを接続し、旋回の底部に、このPE10チューブを接続します。 PE10チューブにスイベルの上部を接続し、 図1の通りPE50コネクタチューブとのルアースタブ針にこれを接続します。 </li><li>適用強い高速ACTIすべての接続に接着糊をngの、空気を流すことにより、漏れのためのカテーテルをテストします。ガスは、使用前にカテーテルを殺菌します。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" /> 図1： 静脈ラインの構築。静脈ラインが小径にMREチューブを延伸し、げっ歯類スイベルデバイスにポリエチレンチューブを介して接続することによって調製されます。異なる部分の長さの指示については、表1を参照されたいです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 伝説 </td><td> 長さ </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 1）ルアースタブ針22G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2）PE50 - ポリエチレン0.023&quot; ×0.038&quot; </td><td> 5センチメートル</td><td> 13μL </td></tr><tr><td> 3）PE10 - ポリエチレン0.011&quot; ×0.024” </td><td> 50センチメートル</td><td> 30μL </td></tr><tr><td> 4）げっ歯類スイベル20 G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5）PE-10 </td><td> 15センチメートル</td><td> 9μL </td></tr><tr><td> 6）PE-50（コネクタ） </td><td> 5センチメートル</td><td> 13μL </td></tr><tr><td> 7）MRE025ヒント伸ばしmicrorenathane 0.025&quot; ×0.012&quot; </td><td> 30センチメートル</td><td> 27μL </td></tr><tr><td>総合計</td><td> 105センチメートル</td><td> 92μL </td></tr></tbody></table> 表1：静脈ラインの構築。このテーブルには、 図1の凡例を提供します。 2.麻酔や手術前の処理<ol><li> （ - 32グラム27）24週齢の雄性C57BL / 6Jマウスを使用してください。 注：この年齢は、集中治療患者の平均年齢とのより良い対応として、私たちは、24週齢のマウス（成熟した大人）を使用します。私たちは、エストロゲンの周期的影響を回避するためだけ雄マウスを使用します。好適な場合には技術はまた、若い（16週齢マウスで試験）動物と女性に使用することができます。 </li><li>使用前に、すべての手術器具を滅菌します。任意の気泡を除去し、開通性および潜在的な漏れを試験するために生理食塩水、滅菌自家製静脈カテーテルを洗い流します。 </li><li> 80センチの長さの金属ワイヤ（直径0.8mm）を切断折り曲げてそれをダブルループを作ります。ループに倍増ワイヤ上3個の真珠を導きます。 3つの真珠を通してカテーテルの先端を案内することにより、金属ワイヤにカテーテルを取り付けます。 注：金属取付ワイヤは、カテーテルが接続されたスイベルの回転のために必要です。このように、マウスは、静脈ラインを遮断することなく、自由に移動することができます。 </li><li>メートルを麻酔0.03 mLのケタミンの混合物の腹腔内（IP）注射（100mg / kg）および0.02 mLのキシラジン（13ミリグラム/キログラム）によってウーズ。麻酔は、反射の有無を確認することで十分であることを確認してください。そっと舌を飲み込むことで窒息を避けるために、鉗子で外にマウスの舌を引っ張ります。 注：10分後、マウスはまだ撤退しようとした場合、その手足は0.01 ムル・ボラスとして、追加のケタミンを与えます。 </li><li> ）ヘッドの基部に腹部、首の腹側（顎、胸骨と鎖骨の間の三角形）を含む、手術領域を剃り、そして肩甲骨の間。 </li><li> 、予熱した加熱パッド上に腹臥位にマウスを置き、70％エタノールで皮膚を消毒し、乾燥から目を保護するために眼科用潤滑剤の少量を適用します。 0.2 mLのロピバカイン（0.67ミリグラム/ kg）を手術部位（背腹部、首前面と）を浸潤します。 </li><li>マウスは、腹臥位のままであるが、背側のベースに小さな切開を作りますメスやハサミで頭の。後頸部の筋肉を露出させ、そして筋肉の下に3.0ナイロン糸を導くことによって3.0ナイロンと取付ワイヤのループに筋肉を結びます。 </li><li>その右側にマウスを置きます。メスやハサミで腹、首の皮膚に小さな縦の切開を行います。視覚的な指導の下、背中の切開部に向かって、この腹切開を通ってトンネル18ゲージ針皮下は以前に作られ、腹側でそれをexteriorizeする針を通してカテーテルを通します。 </li><li>その背中にマウスを置きます。加熱パッドにマウス、テープそれを下の上部切歯後ろ3.0ナイロン糸を通過させます。酸素（2 L /分）を送達するためのフェイスマスクにヘッドを固定します。尾二つ前肢をダウンテーピング延伸位置にマウスを固定します。 注：単独のケタミン - キシラジン麻酔が十分でない場合、吸入イソフルラン（0.5から1.5パーセント）が手術中にお届けすることができます。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。慢性留置カテーテルの配置<ol><li>解剖顕微鏡下でマウスを置きます。頸静脈を可視化することができるまで、腹、首に予め切開では、静かにピンセットで脂肪組織と腺をいじめます。 </li><li>露骨静脈および結合組織との間の鉗子の先端を配置し、静脈と平行に繰り返し鉗子を開くことによって、容器上及び周りに結合し、皮下組織から頸静脈を解放する解剖。そのため、静脈の損傷は回避されます。 </li><li>静脈の下に鈍鉗子を置くことによって、頸静脈を分離します。静脈の下で3.0絹糸3枚、位置ワンピース頚静脈（頭蓋結紮）の分岐部に近位および胸鎖乳突筋（尾結紮）に近い一体フィード。頭蓋結紮静脈を伸ばし、カテーテルを配置しながら、過度の出血を防ぐために、尾合字を締めます。 Tすなわち中央の糸で緩い結紮を後にカテーテルの簡単な固定を確保します。 </li><li>マイクロはさみを使用して、頭蓋と尾合字間静脈カテーテルを通すのに十分な大きさに沿って切開部を作ります。鉗子でカテーテルをつかみ、そして静脈にカテーテル11ミリメートルを挿入します。緩く中間結紮糸を結紮することによってカテーテルを固定し、穏やかに滅菌生理食塩水でフラッシュすることにより正しい配置を確認します。 </li><li>しっかりと容器とカテーテルの周りの真ん中と尾リガチャをオフに結びつけることによって、カテーテルを固定します。タイはしっかりとカテーテルを固定するために一緒に尾側と中央のリガチャーを終了します。ノットは、すべての結び目が作られた後、カテーテルをフラッシュすることで、静脈を閉塞していないことを確認してください。最後に、尾と頭蓋合字を縛ります。 5.0絹縫合糸で切開部を閉じます。 </li></ol> 4.盲腸結紮および穿刺<ol><li>メスやはさみで腹部の下半分の皮膚を通って1 cmの正中切開を行います。腹腔内に侵入しないように注意してください。 </li><li>腹筋の白線を識別し、腹膜腔への参入を得るためにintermuscular切開部を作ります。盲腸を見つけて、盲腸を分離し、それをexteriorizeする鈍い解剖学的鉗子を使用しています。 </li><li> 3.0絹縫合糸で、その長さの50％に盲腸の結紮。腸の連続性が維持されるように、回盲弁を連結していないことを確認してください。 </li><li>連結および盲腸の先端との間の単一の貫通アンド穿刺途中で18ゲージの針を用いて盲腸を穿孔。針を除去した後、開通性を確実にするために穴から糞便の少量を押し出します。 </li><li>腹腔内に腸の位置を変えて、5.0絹縫合糸で腹膜、皮膚を閉じます。 注：平均して、新たな訓練生がスムーズに静脈カテーテルを配置し、45分以内にCLPを行うことができるように10〜15匹の動物を必要とします。研修期間、麻酔/手術後RELA10％のテッドの死亡率が期待できます。 </li></ol> 5.術後の治療および輸液蘇生術<ol><li>仰臥位でマウスを置き、テープで取り付け線にカテーテルを固定します。個々のケージにマウスを移動します。 25センチメートルマウス上に旋回装置を保持するために、調整可能なクランプとスタンドを使用し、しっかりとスイベルの回転点に対する金属取付ワイヤの自由部分をテープ。 </li><li>静脈ラインに流体蘇生を開始する：平衡コロイド及びクリスタ（4 1）の混合物を含有する注射器を取り付けます。 </li><li> 12時間の明暗サイクルの制御された温度（27°C）動物キャビネット内にケージを配置し、正確なシリンジ駆動型注入ポンプを介して静脈内輸液蘇生（10 ml / kg / h）を開始します。ケージなどネスティング材料として濃縮および木製ブロックを提供します。 </li></ol> 6.集中ケア<ol><li> 6時間後動作時、皮下痛を注入medicationおよび抗生物質（0.3 mLのブプレノルフィン（0.15ミリグラム/ kg）および0.2 mLのイミペネム（16.67mg / kg）で）。注：機関の獣医政策によって指示されるように、標準的な実験動物医学の練習後は、痛みのクスリの最初の用量は、初期外科的切開の前に与えられています。皮下注射は慎重に皮下空間に注入されなければなりません。 </li><li> 20後 - 流体蘇生の24時間、完全非経口栄養（6.67ミリリットル/ kg /時）によってクリスタ/コロイドを置き換えます。 注：投与合計静脈栄養（5.8キロカロリー/ 24時間）は、集中治療室の患者の早期のカロリー摂取に似たマウスの毎日の必要カロリーの約40％をカバーしています。 </li><li>皮下鎮痛薬および抗生物質（0.6 mLのブプレノルフィン（0.3ミリグラム/ kg）および0.2 mLのイミペネム（16.67ミリグラム/ kg）の重大な病気の全期間中、12時間毎に投与します。 </li><li>日中の動物に少なくとも3時間ごとに確認してください。痛みを与えることによって、苦しみを評価します検証マウスしかめっ面スケール11に基づいて得点。高い疼痛スコアを有する動物の監視を強化します。 </li></ol>実験の終了7. 注：人間のエンドポイント用の承認とモデルとガイドラインの重症度のレベルや政策上の勧告は動物研究のために地元の機関投資家の倫理審査委員会から求められるべきです。 注：ブロックされたカテーテルは、カテーテルの非局在化のような非機能的静脈ラインの場合には、シリンジポンプの問題は、動物は研究から除外し、安楽死させます。 <ol><li>実験期間の終了時に、深く0.03 mLのケタミン（100mg / kg）および0.02 mLの（13ミリグラム/ kg）のキシラジンの混合物を用いてマウスを麻酔。心臓穿刺により血液を回収することによって、マウスを安楽死させます。ストアは、-80℃での関心の凍結組織サンプルをスナップ。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、流体、薬や栄養投与のための中心静脈ラインを使用して敗血症を誘発するために盲腸結紮穿刺法を組み合わせることにより、重大な病気のより臨床的に関連するマウスモデルを開発しました。この実験は再現性がある、ここヒト臨床状況1を模倣し、安定した死亡率に重大な病気と結果の長期の位相を勉強することができます。 盲腸結紮および穿刺は広範囲に敗血症6、7の主な特徴を再現する急性の重大な病気の動物モデルとして認識されています。しかし、急性重症疾患のこのモデルは、非分解多臓器不全、筋肉の消耗、および内分泌および重大な病気の長期相に典型的な代謝変化の研究を許可していません。さらに、このモデルでの前臨床所見は、しばしばtranslatに失敗します8、9、10を</...

重大な病気は、一つ以上の臓器系の機能を集中医療支援が投与されない限り、患者は、死亡する程度に妨害された疾患状態です。集中治療室（ICU）への入院のための最初の原因は、とりわけ低灌流、低酸素症および過剰な炎症によって引き起こされる、外傷、複雑な外科手術、火傷、疾患の増悪から敗血症に至るまで、すべての重篤患者は、細胞の損傷に苦しむ、変えることができ、一方、 、臓器不全につながります。ほとんどの患者は、彼らの急性発作を生き残るが、患者の重要な一部分はすぐに回復し、長時間の集中治療を必要としません。彼らは非分解多臓器不全による死亡のリスクが高いです。さらに、重大な病気の長期の位相が病因は現在、完全には理解されているの深遠な筋力低下および内分泌および代謝の変化によって品質証明されています。 いくつかのRodentモデルは、クリティカルケアの研究の設定で使用されています。 2つの殆ど使用されるモデルは、リポ多糖（LPS）および盲腸結紮および穿刺（CLP）の外因性投与です。両方のモデルは、感染の調節不全宿主応答によって引き起こされる生命にかかわる臓器不全として定義される敗血症の急性期を模倣するために開発され、世界中のICU 1、2に入場するための主な理由の一つです。それは一時的にのみサイトカインの放出および動物3の血行動態に影響を与えるとして、LPSモデルにはいくつかの欠点があります。ヒトとは異なり、げっ歯類はまた、エンドトキシンに対して特に耐性があり、エンドトキシンの「高用量」の使用は、本明細書にさらにこの方法4,5の有効性の懸念を上げ、低血圧および死亡率を生成するために必要です。他のモデル、盲腸結紮および穿刺モデル（CLP）貫通アンド針穿刺に続いて盲腸の部分の連結を特徴とします。この手順は、血液区画への細菌の移行に続く組織損傷に複数菌腹部感染症を引き起こします。これは、全身性炎症反応や敗血症の発症の引き金となるでしょう。過剰炎症、血管拡張、低血圧および心拍出量の増加6、7：CLPモデルは広く、敗血症の主な特徴を再現する急性の重大な病気の動物モデルとして認識されています。しかし、このモデルは非分解多臓器不全、筋肉の消耗、および内分泌および重大な病気の長期相に典型的な代謝変化の研究を許可していません。マウスモデルからの調査結果は、常に人間設定8に変換することができないので、最近は重大な病気のためのマウスモデルの妥当性は、疑問視されています、9、10。可能な説明は、病気のヒトの患者を批判するために提供される支持療法は、危篤状態のマウスに提供されるケアは実質的に異なることがあります。 したがって、より密接に人間の設定に似ているし、重大な病気の長期相の調査を可能にするために、我々は、大規模な静脈内輸液投与および抗生物質治療として、ヒトに与えられる急性集中治療を模倣するマウスモデルを開発し、かつ可能な栄養サポートなど重大な病気の長期の位相を、生き残るために支持療法を管理します。この目的のために、我々は、敗血症のための黄金の標準である、CLP誘発性敗血症のマウスモデルを適応し、および流体、栄養および薬剤の投与を可能にする中心静脈ラインを置きました。

<table><tbody><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>エクファー</td><td></td><td>獣医 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>コロイド</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr><tr><td>crystalloids</td><td>Baxter</td><td></td><td>Plasmalyte a viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>Imipenem</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&nbsp;注射液用mg粉末</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ユーロベット</td><td></td><td>イソベット</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ユーロベット</td><td></td><td>ニマテック 100 mg/mL</td></tr><tr><td>LocTite スーパーグルー3 すべてのプラスチック&nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - ポリエチレン.011" x .024"&nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50チューブ.023" x.038"</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類スイベル20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ロピバカ&iuml;ネ</td><td>・アストラゼニカ</td><td></td><td>・ナロピン2&nbsp;mg / mL</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>VMD</td><td></td><td>塩酸キシラジン2%</td></tr></tbody></table>

重大な病気のマウスモデルにおける流体、医薬品や栄養管理のための中心静脈ラインの使用

Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

このプロトコルは、長期の重大な病気の中央にカテーテルを挿入し、マウスモデルを記述しています。我々は、ヒト臨床環境を模倣する流体、薬物および栄養投与のための中心静脈ラインを使用して敗血症を誘導する盲腸結紮および穿刺方法を組み合わせます。重症患者は、生き残るために集中的な医療支援を必要とします。患者の大半は、数日以内に回復しますが、患者さんの約四分の長時間の集中治療を必要とし、非分解多臓器不全で死亡するリスクが高いです。さらに、重大な病気の長期化相は病因が現在完全には理解されているの深遠な筋力低下、および内分泌および代謝変化によって品質証明されています。クリティカルケア研究において最も広く使用されている動物モデルは、敗血症を誘発する盲腸結紮穿刺モデルです。これは、人間の9月に似た急性炎症性および血行動態の変化で、非常に再現モデルです重大な病気の急性期を研究するために設計されてSIS、。しかし、このモデルは、臨床的なヒトの状況と異なる高致死率によって品質証明されており、重大な病気の長期の位相を研究するために開発されていません。したがって、私たちはより良い重大な病気のヒト臨床状況を模倣するために、私たちは臨床的に関連する対症療法を管理できるように頚静脈に中心静脈カテーテルを配置することによって、技術を適応しました。このマウスモデルは、動物の大規模な外科的手技や日常の集中治療を必要とするが、それは重大な病気の急性および長期の相の関連するモデルになります。

上記のようにC57BL / 6マウスは、重症行きました。 7日目（N = 22）後CLPまで、5日までの生存率（N = 15）と生存：我々は2つの時点までポストCLP生存を評価するために、2つの実験を行いました。 2回の実験の生存曲線は、実験の再現性を示す、（5日目まで比較して）有意に異なりませんでした。非生存動物は死を発見したかにより、人間のエンドポイントに到達する安楽死させました。抗生物質と組み合わせた盲腸の50％のライゲーション、頸静脈に静脈カテーテルを介して流体蘇生および完全非経口栄養は、記載されているように、重大な病気の1日後に13％の死亡率をもたらし、24％の死亡率を3日後重大な病気、27 - 重大な病気の5日後に31％の死亡率と重大な病気の7日後に36％。決定的の栄養摂取にカロリー制限された健康なペアフィードマウス病気のマウスは、任意の死亡率を示しませんでした。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/...

このプロトコルは、長期にわたる重篤な疾患の中枢カテーテルマウスモデルを記述しています。敗血症を誘発するための盲腸結紮法と穿刺法を組み合わせ、体液、薬物、栄養投与のための中心静脈ラインを使用して、人間の臨床環境を模倣します。

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

盲腸結紮穿刺（CLP）に関するこの中心的に分類されたマウス手法の総合的な目的は、ヒトの臨床現場を模倣するための集中治療措置を伴う、再現可能な遷延性重症疾患モデルを構築することです。この手法は、急性および遷延性重症疾患における内分泌および代謝変化の病態生理に関する、集中治療医学分野における重要な疑問への回答に寄与します。この手法の主な利点は、十分に標準化されたCLP法と、液体、薬剤、および栄養剤の投与に用いる中心静脈ラインの使用を組み合わせている点にあります。本手順の実演は、当研究室の技術者であるThomas Dufourが行います。静脈ラインの先端を準備するために、60 centimeterのマイクロレナサンチューブの中央部分を、220 °C以上の高温のゴマ油に素早く浸します。チューブの両端をそっと引っ張って中央部を伸ばし、中央の直径を細くします。次に、メスでチューブを30 centimeterの等しい2本の断片に切断します。ここで、チューブをポリエチレンPE 50コネクター、スイベル、およびルアースタブニードルに接続して、デモンストレーション通りにカテーテルを構築し、すべての接続部に強力で速乾性の接着剤を塗布します。接着剤が硬化した後、カテーテルに空気を流して漏れがないか確認します。次に、直径0.8 millimeterの金属線を80 centimeterの長さに切断し、その線を折り返してループを作成します。ループの二重になったワイヤーに3つのパールを通し、滅菌済みカテーテルの先端をその3つのパールに通して、カテーテルをワイヤーに固定します。体重27〜32 g、週齢24週のC57BL/6雄マウスを麻酔し、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認して鎮静状態を確認します。舌を飲み込まないように、ピンセットを用いて舌を口からそっと引き出します。次に、手術部位の毛を剃り、あらかじめ温めておいたヒーティングパッドの上にマウスを腹臥位で配置します。露出した皮膚を70%ethanolで消毒し、少量の眼科用潤滑剤を塗布します。手術部位に鎮痛薬を浸潤させ、頭部背側の基部に小さな切開を加えます。後頸部筋肉を露出し、3.0ナイロンを筋肉の下に通して、固定用ワイヤーのループを筋肉に結紮します。次に、マウスを右側臥位にし、頸部腹側の皮膚に小さな垂直切開を加えます。18ゲージの針を、この腹側切開部から背側の切開部に向かって皮下でトンネルさせ、カテーテルを針に通して腹側から針と共に体外に導出します。マウスを仰向けにし、3-0ナイロン糸を上顎切歯の後ろに通して、ナイロン糸をヒートパッドにテープで固定します。次に、尾と前肢を伸ばした状態で固定します。続いて、解剖顕微鏡の焦点を合わせ、ピンセットを用いて腹側切開部の脂肪組織と腺を慎重に除き、頸静脈が視認できるようにします。フォースップスの先端を静脈と結合組織の間に挿入し、静脈と平行にフォースップスを繰り返し開閉させることで、頸静脈を周囲の結合組織および皮下組織から鈍的に剥離します。血管が単離されたら、鈍的フォースップスを頸静脈の下に配置し、3-0シルク糸を2本、静脈の下に通します。1本は頭側結紮用に頸静脈の分岐点に近い位置に、もう1本は尾側結紮用に胸鎖乳突筋に近い位置に配置します。カテーテル挿入時の過剰な出血を防ぎ、静脈を伸展させるために、頭側と尾側の結紮糸を締め付けます。3本目の糸で緩い結紮を作り、マイクロシザーを用いて、頭側と尾側の結紮の間でカテーテルを通過させられる十分な大きさの静脈切開を行います。ピンセットを用いて、カテーテルを静脈内に11 millimeters挿入し、中央の結紮糸でカテーテルを緩く固定します。滅菌生理食塩水でカテーテルを緩やかにフラッシュし、正しく留置されていることを確認します。次に、尾側および中央の結紮糸をしっかりと締め付けます。カテーテルを固定するため、尾側と中央の結紮糸の両端を互いに結び合わせます。結紮ごとにカテーテルをフラッシングし、結紮した結び目で静脈が閉塞していないことを確認します。最後に、頭側の結紮部位も結紮します。その後、5-0シルク糸で切開部を縫合します。盲腸結紮穿刺（Cecal Ligation and Puncture）を行うには、腹部の下半分にある皮膚に1 cmの正中切開を加え、腹腔を貫通しないように注意します。腹壁筋の白線（linea alba）を確認した後、筋間切開を行い、腹腔内へ進入します。鈍端の解剖用鉗子を用いて、盲腸を分離し、体外へ露出させます。腸管の連続性を維持するため、回盲弁を締め付けないように注意しながら、盲腸の長さの50%の位置を3-0シルク縫合糸で結紮します。次に、18Gの針を用いて、結紮部と盲腸先端の中間点を1回貫通させて穿刺し、針を抜いた後に開通していることを確認するため、穿孔部から少量の糞便を押し出します。腸を腹腔内に戻し、5-0シルク縫合糸で腹膜と皮膚を閉鎖します。マウスを仰臥位にし、カテーテルを固定用ワイヤーにテープで固定します。その後、ネスティング材と木製ブロックを入れた個別のケージにマウスを入れます。調節可能なクランプ付きのスタンドを使用し、スイベルデバイスをクランプに固定し、金属アタッチメントワイヤーの自由端をスイベルの回転点にしっかりとテープで固定します。次に、ケージを、明暗サイクル12時間の27 °Cに温度制御された動物飼育キャビネット内に設置します。バランスコロイド液と晶質液の適切な混合液が入ったシリンジを静脈ラインに接続し、精密なシリンジポンプを用いて、0.3 mL/hで輸液蘇生を開始します。6時間後、鎮痛剤と抗生物質を投与します。5日間および7日間の盲腸結紮穿刺実験の生存曲線を解析した結果、両研究間で5日目までの生存率に有意な差は見られず、実験系の再現性が裏付けられました。盲腸の50%を結紮し、抗生物質の投与、輸液蘇生、および頸静脈カテーテルを介した完全静脈栄養を併用したところ、重症状態から1日後の死亡率は13%となりました。重症疾患から3日後の死亡率は24%、5日後には27%から31%、そして7日後には36%でした。一方で、重症疾患マウスの栄養摂取量と同等にカロリー制限を行った健康なパラフェッドマウスでは、いずれの実験においても死亡は見られませんでした。10匹から15匹の動物を用いて手技を習得した後、手順が適切に行われれば、カテーテルの留置およびCLPを45分以内で完了させることができます。この手順を行う際は、カテーテルを慎重に静脈に挿入してください。カテーテルを心臓に深く挿入しすぎると、不整脈を誘発する恐れがあります。また、挿入が不十分な場合は、容易に脱落する可能性があります。カテーテルが確実に血管腔内に留置されていることを常に確認してください。カテーテルが血管壁の層間に留置された場合、液体が周囲の組織に漏出します。このモデルでは、大規模な外科的手術および動物への日常的な集中ケアが必要となる場合があります。しかし、これにより、急性および遷延性のクリティカルケア疾患の多くの側面を研究することが可能な、安定し再現性の高いモデルが得られます。

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