代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ

このサンプリング法の全体的な目的は、その後のタンデム液体クロマトグラフィー質量分析による定量のために、Staphylococcus aureusから代謝物サンプルを回収することです。当研究室では、ヒトの健康に関連する細菌における代謝と病原性の交差についての研究に関心を持っています。現在は、ヒトの日和見感染菌であるStaphylococcus aureusをモデル生物として使用しています。

私たちが解明したい重要な問いの一つは、宿主感染中の栄養枯渇に直面した際に、細菌がどのように生理機能と病原性を調整するかということです。この手法は、生理状態への摂動を最小限に抑えながら、活発に増殖している細胞内の多くの代謝経路における特定の代謝物の分布をスナップショットとして得られるため有用です。まず、凍結グリセロールストックから目的のS.aureus株をトリプチックソイ寒天培地に画線し、単離します。

細胞を37°Cで16～24時間インキュベートします。翌日、滅菌済みのガラス製インキュベーションチューブに4 mLのトリプチケースソイブイヨン（TSB）を分注し、各株の単一コロニーを接種します。培養物を傾斜させた状態で回転させながら、37°Cで16～20時間インキュベートします。

分光光度計を用いて、培養液の600ナノメートルにおける光学密度（OD600と略記）を測定します。この測定値に基づき、250 mLのDelongフラスコ内で、滅菌済みTSB培地50 mLを用いて細胞をOD600が0.05になるように希釈します。培養液を37°Cの恒温槽に入れ、280 rpmで振とう培養します。

30分ごとにOD600を測定します。光学密度が高くなるにつれ、分光光度計の直線的な吸光度範囲内に収まるように、TSBで培養液を希釈する必要がある場合があります。細胞の増殖に合わせて、テキストプロトコルに記載されている通り、入手可能な最高純度の試薬を用いて抽出バッファー溶液を調製します。

培養液のOD600が0.8から1.0に達したら、あらかじめ加温しておいた新鮮なTSB 50 mLにOD600が0.01から0.05になるように継代し、インキュベーションと測定の手順を繰り返します。ガラス皿、アイスバケット、クーラーなどの適切な容器に、砕いたドライアイスを敷き詰めて準備します。培養液の光学密度が目的の回収点に近づいたら、未処理の35 mmペトリ皿にクエンチ溶液を1 mL加え、ドライアイス上で少なくとも5分間予冷します。

本目的において、望ましい回収時期は光学密度が約 0.4 から 0.5 に達した時点です。ただし、これは実験目的によって変更可能です。次に、ステンレス製フィルターフリットをゴムストッパーに装着し、施設内真空ラインまたは真空ポンプに接続した吸引フラスコの上に設置します。

真空をかけ、その上に混合セルロースエステル膜を配置します。すべての細胞を回収するために、フリットと同じ直径のフィルターを使用してください。特定の条件下での代謝物の存在量のスナップショットを得るためには、可能な限り迅速に細胞を回収し、代謝活性を停止させることが極めて重要です。

わずかな遅延であっても、細胞の定常状態の生理機能に影響を及ぼす可能性があります。OD600が0.4から0.5の間になったら、セロロジカルピペットを用いてフラスコから13 mLの培養液を回収してください。回収後、直ちにサンプルをフィルターに適用します。

サンプル全体のろ過が完了したら、直ちに5 mL以下の氷冷PBSでフィルターを洗浄し、培地由来のメタボライトを除去します。次に、真空ポンプを切り、滅菌ピンセットを用いてフリットからフィルターを取り出します。フィルターをあらかじめ冷却しておいたクエンチ溶液の中に反転させて投入します。

フィルターをクエンチ液に入れ、ドライアイス上で少なくとも20分間インキュベートします。滅菌ピンセットを使用して、フィルターをペトリ皿の中で反転させ、マイクロピペットを用いて膜上の細胞をクエンチ液で洗い出します。細胞をクエンチ液で再懸濁し、その後、約100 µLの0.1 mm シリカビーズを含む滅菌済みの2 mL耐衝撃チューブに細胞懸濁液を移します。

これをドライアイスまたは-80°Cで保存します。代謝物抽出を開始するには、まずサンプルを氷上で解凍します。次に、ホモジナイザーを用いて、6000 rpmで30秒間の破砕を4回行い、各サイクルの間にドライアイスで2分間の冷却時間を設けて細胞を破砕します。

あらかじめ冷却した冷蔵マイクロ遠心管を用い、最大速度で15分間、ライセートを遠心分離して清澄化します。遠心後、上清を清潔なマイクロ遠心管に回収します。マイクロピペットを使用して、テキストプロトコルに記載されている残存ペプチド量の定量用に、サンプルの一部を別のマイクロ遠心管に移します。

サンプルの残りは-80°Cで保存する。液体クロマトグラフィーおよび質量分析による代謝物の分析については、テキストプロトコルを参照すること。CodYタンパク質は、これらの栄養素の濃度低下に応じて数十個の遺伝子の発現を調節するため、分枝鎖アミノ酸の枯渇を調べるためにCodY欠損株を用いた。

codY変異はS.aureus細胞の増殖速度にほとんど影響しません。3時間目の時点での光学密度の低下は、回収前の細胞分裂回数を増やし、一晩の培養中に蓄積したさまざまな分子を希釈するためのバックダイリューション（再希釈）ステップを示しています。2つの菌株のトランスクリプトームのRNA配列解析により、アスパラギン酸系アミノ酸の合成に関与する遺伝子の発現に有意な変化があることが示されました。

ここでは、遺伝子名の下に記された数値は、野生型株と比較した際のcodY欠損変異株における発現量の変化倍率を示しています。抽出した代謝物のLC-MS定量後、2つの株の間で含有量を比較しました。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸に関連するいくつかの化合物に着目すると、アスパラギン酸やO-アセチルホモセリンなどの前駆体の含有量は、codY変異株において減少しています。

逆に、トレオニンやイソロイシンなどの最終産物は増加します。ここで、破線はこの実験における存在量の変化のカットオフ値を示しています。このビデオを視聴することで、液体クロマトグラフィー質量分析による定量のために、Staphylococcus aureusから代謝物を回収する方法について十分に理解できたはずです。

このプロトコルは、修正を加えることで他の細菌種からの代謝物回収にも適用可能です。細菌は動的な環境に反応するため、サンプリングによって誘発される生理学的変化を最小限に抑えるには、ろ過および洗浄ステップを迅速に行うことが重要です。また、サンプリング中にフリットとPBSを冷やしておくことでも、これらの変化を最小限に抑えることができます。