Name: ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶGPCR薬理学的特性評価法。ヒト胚性腎細胞を用いて[35S]GTPγS標識GTP結合を測定し、Gタンパク質共役型受容体シグナリングの初期イベントを解析する。創薬研究に有用な機能アッセイです。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金DA-000266および医療科学者養成プログラムT32助成金（CV、NWZ、およびPCS）によって支持されました。著者は、Science＆Medical Illustrationsの図書館のsomersault18：24（somersault1824.com）に感謝したいと思います。

培養細胞における組換えHA-MOR1の発現注：滅菌層流フード内のすべての細胞培養プロトコールに従ってください。 <ol><li> 70％エタノールで細胞培養層流フードを滅菌し、細胞培養全体に無菌技術を維持する。 </li><li> 2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清（FBS）を補充したヒト胎児腎臓細胞293（HEK293）細胞培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） ）。 </li><li>プレート2.5×10 6個の HEK293細胞を、10mLの完全培養DMEM中の10cm組織培養プレート上に置き、37℃および5％CO 2で 、70〜80％の集密度に達するまで（O / N）インキュベートする。 注：完全なGTP結合実験のために十分なタンパク質を集めるためには、少なくとも3×10cmの細胞プレートをプレートする。 </li><li>選択したトランスフェクション試薬を使用してHA-MOR1で細胞をトランスフェクションし、; sガイドライン。 36-48時間インキュベートする。 注：ヒトMOR-1 cDNA（NCBI参照配列：NM_000914.4）は、Gavril Pasternakから寄贈されたもので、pCMV-HAにクローニングした。 </li></ol> 2.細胞分画および膜回収<ol><li> 以下の溶解バッファーを調製する： <ol><li>緩衝液1：10mM 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pH7.4; 1mMエチレングリコール - ビス（β-アミノエチルエーテル）-N、N、N &#39;、N&#39;-テトラ酢酸（EGTA）。 10％スクロース;プロテアーゼ阻害剤カクテル;および1mMジチオスレイトール（DTT）を含む。膜分離の日に新鮮なDTTを加える。 </li><li>緩衝液2：10mM HEPES、pH7.4; 1mM EGTA; 1mM MgCl 2 ;および1mMのDTTを含む。膜分離の日に新鮮なDTTを加える。 </li></ol></li><li>インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を除去し（ステップ1.4）、培地を吸引し、5mLの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で細胞をすすぐ。 PBSと過剰な液体を吸引するプレート。 </li><li>細胞に600μLの緩衝液1を加える。細胞スクレーパーを使用して、プレート表面から細胞を除去し、細胞懸濁液を1.6mL微量遠心管にピペットで移す。 </li><li>マイクロ遠心チューブを液体窒素中で直ちに凍らせます。サンプルが凍結したら、ライセートを氷上で解凍するか、または長期保管のために-80℃に置きます。 </li><li>すべての細胞プレートでステップ2.3と2.4を繰り返します。 </li><li> 溶解液が融解したら、シングルパルスマイクロチューブホモジナイザーを用いて細胞を破壊する。ホモジナイザーを10秒間3-5回パルスし、パルスを30秒間氷上に戻します。 <ol><li>全細胞画分として20μLを集める。 </li></ol></li><li>残りのサンプルを1,000 xgおよび4℃で10分間遠心します。上清を回収し、氷上で新しい1.6mL微量遠心チューブに入れる。 </li><li> ペレットを100μLの緩衝液1に再懸濁し、乳棒で再ホモジナイズする。ホモを鼓動させるジェネライザを5秒間3-5回、パルスを30秒間氷上に戻す。 <ol><li>サンプルを1000 xgおよび4℃で10分間2回遠心分離します。上清とステップ2.7の上清を合わせる。 注：残りのペレットには、核および膜タンパク質が含まれています。 </li></ol></li><li>合わせた上清を11,000 xgおよび4℃で20分間遠心分離する。上清（細胞質画分）を新しい1.6mLマイクロ遠心チューブに分注する。 </li><li>ペレットを200μLのBuffer 2に再懸濁する。ペレットを3〜5回粉砕して均質化する。試料を21,100 xgおよび4℃で20分間遠心分離する。上清を吸引する。粗膜画分を含むペレットを50μLの緩衝液2に再懸濁する。 </li><li>直ちにGTPγS結合実験（セクション3）に進むか、または液体窒素中で急速に凍結し、-80℃で保存する。 </li></ol> 3. [ 35 S]GTPγS結合</p&gt; 注：[ 35 S]GTPγSを取り扱う場合および[ 35 S]GTPγS結合実験を行う場合は、標準的な放射化学的安全プロトコルを使用してください。常に保護手袋と実験室用コートを着用してください。梱包材に漏れや亀裂がないか点検してください。廃液と余分な試薬は、施設のプロトコールに従って廃棄してください。 <ol><li> 50mM HEPES（pH 7.4）を混合することにより不完全結合緩衝液（IBB）を調製する。 5mM MgCl 2; 100mM NaCl;蒸留水中の1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む。 </li><li>ストック[ 35 S]GTPγSを10 mM Tris-HCl、pH 7.6および10 mM DTT中で50 nMに希釈する。 500μLのアリコートを作り、-80°Cで保存する。実験を開始する直前に、新たに解凍したアリコートのみを使用する。アリコートを氷上で解凍する。 </li><li> 1mgのGTPγS粉末を177.62μLの純水に溶解して10mMのストック濃度にすることにより、非放射標識GTPγSを調製する。 10μLのアリコートを作成し、-20℃。 </li><li> 1mM DTT、0.1％（wt / vol）ウシ血清アルブミン（BSA）、10μMGDP、および0.1nM [ 35 S]GTPγSの最終濃度を含むようにIBBを補充することにより完全結合緩衝液（CBB）を調製する。 注：CBBには放射性標識されたGTPが含まれています。放射性物質を扱う際は、適切な安全対策を講じてください。 </li><li>氷上でステップ2.11からの膜画分を解凍する。 </li><li> 595 nmの分光光度計を使用してブラッドフォードタンパク質アッセイを介して膜画分のタンパク質濃度を定量する。 <ol><li> 0,250,500,750,1500,2,500,5,000μg/ mLの最終濃度で、Buffer 2を用いてBSAタンパク質標準の希釈シリーズを調製する。 </li><li>キュベット内のBradford試薬1 mLに各標準またはメンブレン2μLを加えます。ボルテックスで完全に混合する。 </li><li> 0μg/ mLのタンパク質を含むキュベットを使用して、分光光度計を波長595 nmに調整し、ブランクにします。 </li><li> 5分待ってからr595nmの波長で各標準試料および各試料を採取する。 </li><li>濃度に対する標準の吸光度をプロットする。 Beer-Lambert法（A =εcl、ε=吸光係数、l =キュベットの長さ、c =濃度）を用いて、膜試料の濃度を計算する。 </li></ol></li><li>膜画分をIBB中で100μgタンパク質/ mLの濃度に希釈する。 注：HEK293細胞の1つの10cmディッシュは、典型的には、1＆3mgタンパク質/ mLを生じる。 </li><li> リガンド希釈系列、基底GTP結合を測定するための基礎活性条件、および非特異的GTP結合を測定するための非特異的結合条件を、個々の1.6mLマイクロ遠心管で以下の実験条件で準備する。 <ol><li>リガンド希釈系列については、目的のリガンドの希釈系列を最終容量100μLのCBBに調製する。リガンドシリーズを所望の最終濃縮物の2倍で調製するons。リガンドの濃度を、ある範囲の応答を適切にカバーするように配置する。 <ol><li> MOR1を介したGTP結合に対するDAMGOの効果をアッセイするために、CBB（最終濃度2mM、200μM、20μM、2μM、200nM、20nM、2nM、200pM、20pMおよび2pM）容量：100μL）。 注：例えば、関心のあるリガンドが10μMの予想されるEC 50値を有する場合、200nM、2μM、20μM、200μMおよび2mMのリガンド希釈液を調製する。これらの5つの条件は、広範囲の濃度をカバーし、アッセイに望まれる濃度の2倍である。 </li></ol></li><li>基本的な結合のために、100μLのCBBのみを含むチューブを調製する。 </li><li>非特異的結合のために、1μLの2mM非放射標識GTPγSを添加した99μLのCBBを含むチューブを調製する。 </li></ol></li><li> 100μLの希釈膜溶液を各実験条件に添加する（工程3.7）。 </li><li>膜を様々な実験者とインキュベートするサーモミキサーまたはオービタルシェーカーで、25℃、30分間、1.6mLのマイクロ遠心チューブ中で培養した。 </li></ol> 4.膜ろ過<ol><li> 50mM Tris-HCl、pH7.4を合わせて洗浄バッファーを調製する。 5mM MgCl 2 ;蒸留水中の50mM NaClを含む。 </li><li>グラスファイバーフィルターを水中に10分間浸漬してください。 注：フィルターの孔径は1μm、直径は2.1cm、厚さは675μmです。 </li><li>サーモミキサーまたはオービタルシェーカーからサンプルを取り出します（ステップ3.10）。チューブの底に各サンプルを集めるために、サンプルを5秒間短時間パルス回転させます。 </li><li>真空濾過装置の蓋を取り外します。予備浸漬したフィルターを装置の真空ポート上に置く。装置の蓋を再度固定して真空シールを形成してください。真空をオンにします。 </li><li>チューブの壁および/またはピペットからの吸着による誤差を最小限に抑えるために、各200μLの実験条件の195μLをフィルターにピペットで入れる。ティン。 </li><li>氷冷した洗浄バッファー1 mLでフィルターを3回洗浄する。 </li></ol>液体シンチレーション計数<ol><li> 5mLのシンチレーションカウンターバイアルを計数棚に置きます。各バイアルに5 mLのシンチレーション液を加えます。 </li><li>真空をオフにする（ステップ4.4）。真空濾過装置の蓋を取り外します。ピンセットを使用して、濾過装置の真空ポートからフィルターをピックアップし、各フィルターを個々の5mLシンチレーションバイアルに落とします。 </li><li>最大シグナルを決定するために、195μLのCBBで1本のバイアルを準備します。 </li><li>各バイアルにしっかりとキャップをしてください。 25℃で10分間、オービタルシェーカー上でバイアルをインキュベートする。 </li><li>シンチレーションカウンターをオンにします。シンチレーションカウンターをプログラムして、標準的なシンチレーションプログラムを使用して、 35 S同位体発光を1サンプルあたり5分間測定します。 </li><li>カウントを取るために「スタート」を押してください。 </li><li>計数が終了したら、計数したバイアルを廃棄する有害廃棄物として使用します。 </li></ol>データ解析<ol><li> 統計および分析ソフトウェアにデータを入力します。 <ol><li>特異的結合を決定するために、他の測定の各々から非特異的結合を差し引く。 注：非特異的結合の程度は、非放射標識GTPγS（3.8.3ステップ）でインキュベートしたサンプルによって決定されます。 </li><li>統計および分析ソフトウェアを開き、XYデータセット項目を選択します。 </li><li> [ 35 S]GTPγS結合実験の特異的結合データを統計および分析ソフトウェアのデータテーブルに入力します。モル濃度としてアゴニスト濃度を「X」欄に入力する。関連する35 Sカウントを「Y」値として入力します。 </li></ol></li><li> データを変換します。 <ol><li> 「分析」をクリックして、X値をそれぞれの対数に変換します。組み込みのiから「変換」を選択します。n分析。 </li><li> [変換]ダイアログボックスで、[X値を変換する]を選択し、関数「X = log（X）」を選択します。結果の新しいグラフを作成することを選択します。 </li><li> [OK]をクリックします。 </li></ol></li><li> Y値を正規化する。 <ol><li>変換結果が表示されたら、[分析]をクリックします。ビルトイン解析から「Normalize」を選択します。 </li><li> [Normalize]ダイアログボックスで、ラジオボタンを選択して、0％を「各データセットの最小値」として定義し、100％を「各データセットの最大値」として定義します。ボックスを選択すると、結果がパーセンテージとして表示されます。ボックスを選択すると、結果の新しいグラフが作成されます。 </li><li> [OK]をクリックします。 </li></ol></li><li> プロットされたデータに非線形回帰曲線をフィットさせます。非線形回帰分析を行います。 <ol><li>正規化された結果が表示されたら、[分析]をクリックします。ビルトイン解析から「非線形回帰（カーブフィット）」を選択します。 </li><li>アゴニストを調べる場合は、ダイアログボックスで「log（アゴニスト）対正規化された応答 - 可変スロープ」を選択します。 </li><li>アンタゴニストを調べる場合は、ダイアログボックスから「ログ（アンタゴニスト）対正規化された応答 - 可変スロープを選択」を選択します。 </li><li> [OK]をクリックします。 </li></ol></li><li>グラフと結果を見直して、適合とデータが合理的に合致していることを確認します。回帰がプロットされたデータの一般的なパターンと一致し、残差が線量 - 反応曲線を平坦にするほど大きくないことを確認します。 注：ソフトウェアは、非線形回帰の結果を要約し、半最大応答（EC 50 ）、ヒル係数（n H ）、および最大最大阻害濃度（IC 50 ）を引き出す濃度を詳述する。 </li><li> アゴニスト/アンタゴニストパラメーター効力を誘導する。 <ol><li>アゴニストequを導き出す以下の実験16,17,18のいずれかからの解離定数（K b ） <ol><li>一定濃度のアンタゴニストとの競合におけるアゴニストの用量反応のシフトを評価する。ここで、EC 50 &#39;= EC 50 （1 + [アンタゴニスト] /アンタゴニストKb ）、ここで、EC 50 &#39;は右シフトEC 50である。 </li><li>一定濃度のアゴニストと競合して様々な濃度のアンタゴニストとの[ 35 S]GTPγS結合を評価する。ここで、K b = IC 50 /（2 +（アゴニスト/アゴニストEC 50 ） n ） 1 / n -1であり、nはアゴニストのヒル係数である。 </li></ol></li></ol></li><li>データの変動性に応じて、各リガンドについて実験（ステップ3.8〜5.6）を約3〜5回繰り返し、統計および分析ソフトウェアを用いて結果を平均するあります。 </li></ol>

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著者は競合する利益を宣言していない。

本プロトコルは、2つの別々ではあるが補完的な方法を記載する：細胞および組織を幅広く異なる区画に分ける単純なアプローチ、および[ 35 S]GTPγS結合を測定することによってGPCRシグナル伝達を調べる手段。 効率的な細胞分画は、タンパク質の抽出および富化から、タンパク質の細胞内局在の評価、受容体薬理学の研究に至るまで、幅広い用途を有する。細胞および組織を分画するための別のアプローチが存在するが、ここに提示されるプロトコールは、比較的安価で、迅速で、より簡単である。しかしながら、より確立された方法とは異なり、この方法は、細胞膜関連タンパク質をエンドソームまたはERのような他の膜性区画からきれいに分離することができない。上記のプロトコルは、GPCRを含む細胞膜を生成するために一時的な過剰発現系を使用するが、興味深いことに、このプロトコールは、動物またはヒトの組織と同様に、安定した過剰発現系と適合する。 分画の収率と純度を最大にするには、試料の調製が重要です。完全な均質化を保証し、遠心分離ステップ間の移行時間...

Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、鎮痛、嗅覚および行動を含む著しい一連の生理学的過程に関与する細胞表面受容体の大きなファミリーである1 。 GPCRは、特定の外部シグナルを感知し、続いて細胞内シグナル伝達を刺激することによって作用する。したがって、それらは、細胞の外部環境と内部環境との間の鍵となる接合点である。 GPCRが生物学において果たす重要な役割のために、それらは基礎研究と創薬の両方の主要標的となっている2,3 。 別個のリガンドに結合する他の受容体ファミリーとは異なり、GPCRは非常に異なるタイプの分子に結合することができる。 1つのGPCRがペプチドと相互作用することができる一方、別のGPCRは光子、小分子またはイオンを感知することがある1,4 。それらのリガンドは多様であるが、GPCRは全体的な建築家に統一されている機能と機能。個々のGPCRは、細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシル末端を有する7つのαヘリカル膜貫通タンパク質から構成される。 GPCRは、多様なシグナル伝達経路を媒介するα、β、およびγサブユニットからなる細胞内Gタンパク質 - ヘテロ三量体タンパク質複合体に結合する7 。 Gαサブユニットは、グアノシン二リン酸（GDP）に結合すると不活性であり、グアノシン三リン酸（GTP）に結合する場合に活性であるグアニンヌクレオチド結合タンパク質である（ 8,9） 。 GPCRがそれらのリガンドに結合するとき、GαがGβγから解離することを可能にする構造変化を受け、GαがGTPをGTPと交換することを可能にする。受容体自体は、種々のセリン/スレオンによってそのカルボキシル末端でリン酸化される受容体シグナル伝達を弱めるために内在化されている12,13,14。一方、活性化されたGαモノマーおよびGβγ二量体は、別個のシグナル伝達経路を活性化するように進行する7 。各Gタンパク質サブユニットにはいくつかのアイソフォームが存在し、各アイソフォームは特定の下流の経路および二次メッセンジャーシステムを標的とする。主要なGαアイソフォームには、G s 、G q 、G i / oおよびG 12-13が含まれる 。典型的には、個々のGPCRは特定のGαアイソフォームと会合し、それによって特定の細胞応答に外部刺激を結び付ける。 GPCR-リガンド相互作用を特徴付けることは、受容体の生物学を理解するために重要である。 GDP / GTP交換は最も初期の前夜の1つですリガンド結合に続くNts、GTP結合のモニタリングは、GPCR活性化または阻害を測定することができる。 GPCRシグナル伝達におけるより下流の事象をアッセイすることは、定量的または化学量論的ではないことが多く、完全なアゴニストを部分的なアゴニストと区別することができず、高価な試薬を必要とすることがある。さらに、Gαタンパク質へのGTP結合の増加は、GPCR活性化後のほぼ普遍的な事象であり、GTP結合の測定は、ほとんどのGPCRの活性をモニターするための広く適用可能なアッセイであることを意味する。 GTP結合の測定は、関心のある受容体または天然組織を過剰発現する細胞におけるGPCRシグナル伝達をモニターするための簡単で迅速なアプローチである。本プロトコールは、GPCRシグナル伝達に対するアゴニストおよびアンタゴニストの活性を定量的に決定するために、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）を用いた機能的GTP結合アッセイを詳述する。 このプロトコールはまず、粗膜をMOR1を過剰発現する細胞から単離する方法を概説する。注意してくださいこのプロトコールは、過剰発現系に限定されず、天然の組織または複数の受容体およびGタンパク質を発現する調製物を含む、多くの膜源に適用することができる。プロトコルは、様々な濃度の[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）またはナロキソン（MOR1アゴニストおよびアンタゴニスト）に応答して放射性GTP類似体のこれらの膜への結合を測定する方法を詳述し、それぞれ、 GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）は、加水分解しない。 Gαサブユニットは内因性GTPアーゼ活性を示し、加水分解可能なGTP放射化学物質上の標識されたγリン酸を除去するので、この性質は重要である。次いで膜をガラス繊維フィルター上に捕捉し、洗浄し、その後放射性標識したGTPを液体シンチレーション計数によって定量する。複数の薬理学的パラメーターを特徴づけることができるアンタゴニストのアゴニストについての半最大応答（EC 50 ）およびヒル係数（n H ）およびアンタゴニストについての半最大阻害濃度（IC 50 ）および平衡解離定数（K b ）を含む受容体 - リガンド相互作用16,17 、 18 。

<table><tbody><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10313021</td><td>37°Cで温かく;Cウォーターバス使用前に</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td>37°Cで温めます。C水浴 使用前に</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td>37°Cで温かく;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Warm in a 37°C;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000044</td><td>37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>細胞培養 10cmプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td>試薬 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>1.6mL 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Trizma塩基)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(&β;-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-1</td><td></td></tr><tr><td>ペレット乳棒モーター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359971</td><td></td></tr><tr><td>乳棒</td><td>Bel Art</td><td>F19923-0001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>[35S]グアノシン-5'-O-(3-チオ)三リン酸 ([35S]GTP&gamma;S)&nbsp;</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEG030H</td><td></td></tr><tr><td>非放射性標識グアノシン-5'-O-(3-チオ)三リン酸(GTP&γ;S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89378</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン二リン酸 (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51060</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS 分光光度計</td><td>ベックマン・コールター</td><td>DU640</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 キュベット</td><td>USA Scientific</td><td>9090-0460</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>サーモ</td><td>ミキサーEppendorf</td><td>535027903</td><td></td></tr><tr><td>ガラス繊維フィルター&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>1821-021</td><td></td></tr><tr><td>真空ろ過装置</td>ミリ<td>ポアコーポレーション</td><td>XX2702550</td><td></td></tr><tr><td>卓上微量遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>65717</td><td></td></tr>シン<tr><td>チレーションカウンター</td><td>ベックマンコールターLS6500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション液&nbsp;</td><td>Ecoscint A</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションカウンターバイアル</td><td>ベックマン・コールター</td><td>592690</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアルの蓋</td><td>ベックマン・コールター</td><td>592928</td><td></td></tr><tr><td>プリズム6</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td>プリズム6</td><td></td></tr><tr><td>ATP1A1</td>抗体 <td>開発研究 ハイブリドーマ</td><td>a6F</td><td>1:1000 3% BSA</td></tr><tr><td>GAPDH抗体</td><td>EMD ミリポア</td><td>CB1001</td><td>1:5000 in 3% BSA</td></tr><tr><td>H2B antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2934S</td><td>1:2500 in 3% BSA</td></tr><tr><td>PDI antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>3501S</td><td>1:1000 in 3% BSA</td></tr><tr><td>HA antibody</td><td>Roche</td><td></td><td>11867423001 1:2000 in 3% BSA</td></tr></tbody></table>

ラジオ標識gtp結合を介したgタンパク質共役型受容体シグナルの測定

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Gタンパク質共役受容体 （GPCR）は、正常な細胞生理学において重要な役割を果たす膜貫通受容体の大きなファミリーであり、鎮痛、血圧調節、および精神疾患の治療を含む複数の適応症の主要な薬理学的標的を構成する。リガンド結合に際して、GPCRは、グアノシン三リン酸（GTP）の取り込みを刺激することによって、細胞内Gタンパク質の活性化を触媒する。次いで、活性化されたGタンパク質は細胞応答を誘発するシグナル伝達経路を刺激する。 Gタンパク質の[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）の放射性標識および非加水分解性形態のG-タンパク質への取り込みを測定することによって、GPCRシグナル伝達をモニターすることができる。より下流のシグナル伝達プロセスを評価する他の方法とは異なり、[ 35 S]GTPγS結合は、GPCRシグナル伝達における近位事象を測定し、重要なことには、ts、アンタゴニスト、およびインバースアゴニストが含まれる。本プロトコールは、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）の粗膜調製物を用いて、GPCRシグナル伝達を研究するための高感度かつ特異的な方法を概説する。細胞および組織を分画する代替的なアプローチが存在するが、多くの場合、費用がかかり、退屈であり、および/または非標準的な実験装置を必要とする。本方法は、機能的な粗膜を濃縮する簡単な手順を提供する。 MOR1を単離した後、そのアゴニストである[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）、およびアンタゴニストであるナロキソンの様々な薬理学的特性を決定した。

細胞分画は、膜結合タンパク質を細胞質ゾルおよび核タンパク質から単離および濃縮するために使用することができる。 図1は、細胞下分画プロセスの間に収集され得る3つの主要な画分の内容を示すウェスタンブロットである。具体的には、 図1は、ヒストンH2Bおよびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、核タンパク質、および細胞質タンパク質から膜タンパク質（ すなわち Na + / K + ATPアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、およびHA-MOR1）それぞれ、さらに、 図1は、分画の結果としての、それぞれの亜細胞画分におけるタンパク質の富化（レーン4と比較したレーン1）を示す。代表的なポンソー（Ponceau）染色液は、各画分に等しいタンパク質負荷を示す。このフラクタルonationプロトコルは、異なる細胞膜を区別しない。 PDIは一般に小胞体（ER）...

グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

この手順の全般的な目的は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を含む細胞膜を単離し、機能的なGTP結合アッセイを用いてGPCRの薬理学を研究することです。この手法は、既知のまたは孤立したGタンパク質共役受容体の薬理学的特性に関する、生化学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。主な利点は、簡便かつ迅速であり、Gタンパク質共役受容体シグナル伝達における最も近位の事象を測定できる点にあります。まず、ヒト胚性腎細胞を10 cmの組織培養プレートに、10 mLの完全DMEMを用いて播種します。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で、コンフルエンシーが70%から80%に達するまでインキュベートします。インキュベート後、メーカーのガイドラインに従い、適切なトランスフェクション試薬を用いてHAMOR1を細胞にトランスフェクトします。その後、前述した方法で細胞を36〜48時間インキュベートします。トランスフェクションした細胞をインキュベーターから取り出し、培地を吸引して、5 mLの氷冷PBSで細胞を洗浄します。次に、プレートからPBSおよび余剰な液体を吸引します。次に、600 µLのバッファー1を細胞に加えます。セルスクレイパーを用いて細胞をプレート表面から剥離させ、細胞懸濁液を1.6 mLマイクロ遠心チューブにピペットで移します。直ちにマイクロ遠心チューブを液体窒素で急速凍結させます。サンプルが凍結したら、ライセートを氷上で解凍します。解凍後、シングルパルス式マイクロチューブホモジナイザーを用いて細胞を破砕します。ホモジナイザーを10秒間、3〜5回パルス作動させてください。パルス操作の間に、チューブを30秒間氷上に置きます。その後、サンプルを 1,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。次に、上清を氷上の新しい1.6 mLマイクロ遠心チューブに移します。口蓋を100 µLのバッファー1に再懸濁します。サンプルを再度ホモジナイズし、ホモジナイザーを5秒間、3〜5回パルス動作させます。パルスの間は、チューブを30秒間氷上に置いてください。サンプルを2回目に遠心分離した後、上清を合わせ、11,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を新しい1.6 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。200 microlitersのバッファー2で再懸濁します。次に、3〜5回トリチュレーション（ピペッティング）して口蓋を均質化します。サンプルの遠心後、上清を吸引し、粗膜画分を含むペレットを50 µLのバッファー2で再懸濁します。ストックのS35GTP gamma Sを、50 nMのtrace HClおよび10 mM DTTで希釈します。結合実験用に250 µLずつの分注を行い、必要に応じて保存のために急冷凍結します。次に、不完全結合バッファーに、最終濃度が

measuring-g-protein-coupled-receptor-signaling-via-radio-labeled-gtp

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。...

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

アクティブ状態のためのアゴニストの親和定数を推定する方法（...

Gタンパク質共役受容体でアゴニスト活性を定量化

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

ここで説明する蛍光に基づくカルシウム動員アッセイは、オーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の機能的に活性化するリガンド（単数または複数）の同定のための培地スループット逆薬理スクリーニングシステムである。...

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

Gタンパク質共役受容体によるGタンパク質の選択的活性化を検出する簡単な方法は、細胞シグナル伝達における未解決の課題です。ここでは、GPCRとGタンパク質ペプチドをペアワイズテザリングして、生細胞の制御された濃度でのコンフォメーション変化を調べることにより、Fӧrster共鳴エネルギー移動(FRET)バイオセンサーを開発しました。...

ライブ細胞懸濁液の蛍光光度アッセイでFRETセンサーを用いて測定したGタンパク質選択的なGPCRの立体配座

説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2...

キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

ここでプレニル化とグアノシン 5'-三リン酸 (GTP) を調査するためのプロトコルを説明-GTPase の読み込み。このプロトコルは、2 つの詳細なメソッドで構成されています、すなわち膜分画と gtp アーゼ抗体アッセイします。プレニル化と GTP を測定するプロトコルを使用することができます別の他の低分子量 g...

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

GPCRは、魅力的な薬剤の標的であることを考えると、GPCRリガンドスクリーニングは、リード化合物の同定や脱孤児化研究に不可欠です。これらの取り組みに向けて、TEVベースのレポーターアッセイを用いて約300...

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

S1Pは、S1P受容体(S1PR)サブファミリーを介して多様な生理効果を発揮する。ここでは、S1PR...

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

このプロトコルは、Gタンパク質共役型受容体リガンド刺激による生HEK293細胞におけるGタンパク質活性化のリアルタイム測定のためのBRITベースのバイオセンサーの使用について説明しています。ここでは、β2-アドレナリン受容体とカンナビノイド1型受容体を例として、いくつかのGタンパク質サブタイプおよびさまざまなGPCRにわたるセンサーの効率を実証します。...

生細胞におけるGタンパク質共役受容体活性を測定するためのBRITベースのGタンパク質バイオセンサー

学ぶGPCR薬理学的特性評価法。ヒト胚性腎細胞を用いて[35S]GTPγS標識GTP結合を測定し、Gタンパク質共役型受容体シグナリングの初期イベントを解析する。創薬研究に有用な機能アッセイです。

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

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