軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイインビトロ

この実験の全体的な目標は、軟骨細胞脱分化中の 5-メチルシトシンレベルを決定することです。この方法は、自家軟骨細胞移植などの細胞ベースの軟骨欠損治療における重要な質問に答えるのに役立つことを示しています。この技術の主な利点は、軟骨細胞の表現型を評価するための一般的なDNAメチル化レベルを検出するための信頼性が高く、シンプルで迅速な方法であることです。

軟骨細胞脱分化中のDNAメチル化は、軟骨欠損に対する自家軟骨細胞移植治療の主要な障害であるため、この技術の意味は自家軟骨細胞移植のシェアに標準的です。この方法は、軟骨細胞の脱分化におけるDNAメチル化レベルに関する洞察を得ることができますが、変形性関節症などの他の疾患の研究にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ドットブロット法の参考文献でプロトコルを読んだときでした。

この方法のデモンストレーションは、ドットブロットの状態を命名するのが難しいため、重要であることを示してください。ゲノムDNAは変性させた後、段階希釈する必要があります。次に、正に帯電したナイロンメンブレンで支持されます。

手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるZhaofengJiaです。この研究で使用された関節軟骨組織は、外傷後のドナー患者の膝関節から分離されました。滅菌メスを使用して、軟骨を1〜2立方ミリメートルの小片にさいの目に切ります。

次に、コラゲナーゼIIとDMEMの1ミリリットルあたり1ミリグラムをミンチ軟骨に加えます。そして、摂氏37度で12〜16時間インキュベートして軟骨細胞を消化します。翌日、得られた細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーでろ過します。

セルをスピンダウンします。上清を捨て、PBSを加えて、再度スピンダウンします。血球計算盤で細胞を数えます。

そして、センチメートル二乗あたり20、000〜30、000細胞の密度で種子をまき、DMEMに10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補充しました。インキュベーターで摂氏37度のインキュベーターで48時間培養します。0.25%トリプシンEDTAを使用してサブコンフルエント細胞を回収します。

そして、6, 600セル/センチメートルの二乗の密度で再播種します。軟骨細胞を最大6継代まで単層で培養し、1、2、3、4、5継で評価します。この手順を開始するには、トリプシン処理と遠心分離によって細胞を採取します。

次に、ピペッティングと迅速な反転により、細胞1,000万個あたり500マイクロリットルの溶解バッファーに細胞を再懸濁します。摂氏37度で1時間インキュベートします。プロテイナーゼKを細胞溶解物1ミリリットルあたり160マイクログラムの濃度で添加し、混合物を激しく反転させます。

摂氏55度で6時間インキュベートします。各サンプルに 1 容量の Tris pH 7.9 飽和フェノール to クロロホルム to イソアミルアルコールを加えます。サンプルを手で約20秒間十分に振とうします。

サンプルを室温で 13, 000 回 G で 5 分間遠心分離します。上部の水相を取り外し、新しいチューブに移します。フェノールを除去するには、各チューブに等量のクロロホルムを追加します。

手で振って、スピンダウンします。上部の水相を新しいチューブに移します。0.1 サンプル容量の 3 モル酢酸ナトリウム pH 8 と 2 容量の 100%エタノールを添加します。

チューブをマイナス20°Cで一晩保存し、ゲノムDNAを沈殿させます。翌日、ゲノムDNAをペレット化するために、16,000倍Gで摂氏4度で10分間サンプルを遠心分離します。サンプルを70%エタノールで洗浄します。

そして、摂氏4度で2分間、13,000回G.上清を慎重に取り除き、DNAペレットを風乾させます。DNAを10ミリモルトリスpH 8 0.1ミリモルEDTAに再懸濁します。この手順を開始するには、単離したDNAを0.1モルの水酸化ナトリウムで95°Cで10分間変性させます。

氷上の1モル酢酸アンモニウムでDNAを中和します。次に、二重蒸留水で2倍に希釈します。ドットブロットアッセイの最も重要なステップは、サンプルのスポッティングであり、ゆっくりと慎重に行うことを忘れないでください。

各スポッティングアレイを直径3〜4ミリメートルに最小化してみてください。細い口のピペットチップを使用して、グリッドの中央にある正に帯電したナイロンメンブレン上に、2マイクロリットルの連続希釈ゲノムDNAを慎重に見つけます。メンブレンを摂氏80度で30分間ブロットします。

次に、メンブレンをTBST中の5%BSAにTBST中の10cmシャーレに1時間浸し、室温で穏やかに振とうしながら、非特異的抗体結合部位をブロックします。1時間後、メンブレンをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。メンブレンをマウス抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体とTBSTで4°Cで一晩インキュベートします。

翌日、メンブレンをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。次に、二次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス免疫グロブリンGとTBSTで室温で1時間インキュベートします。前回と同様にTBSTでメンブレンを洗浄した後、メンブレンに酵素基質を添加し、5〜10分間インキュベー

最後に、メーカーの指示に従って、化学発光キットを使用して二次抗体シグナルを可視化します。継代6までの単層で培養された軟骨細胞は、進行性の表現型の変化を示し、継代が進むにつれて高度につままれ、平らになります。この形態変化は、軟骨細胞の脱分化プロセスの典型です。

ゲノムDNAは、さまざまな数の継代後に軟骨細胞から単離され、DNAメチル化レベルは5-メチルシトシン特異的ドットブロットアッセイによって評価されました。その後、ドットの強度を画像J.Decreasing Elevated 5 methylcytosine level with extended subculture.が観察され、一般的に増加したメチル化レベルと軟骨細胞の脱分化との間に関連性があることが示唆されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば24時間で実行できます。

この手順を試みる際には、ゲノムDNAの濃度と純度を最大化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ゲノムDNAマシネーションプロファイリングなどの他の方法を実行して、モノカルチャーにおける軟骨細胞の脱分化などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、自家軟骨細胞移植の分野の研究者が軟骨細胞のDNA機構を評価し、軟骨欠損治療における軟骨細胞の表現型を決定するための道を開きました。

このビデオを見た後、5-メチルシトシンドットブロットを使用して縮退したマシネーションレバーを検出し、軟骨細胞の表現型を評価する方法を十分に理解できるはずです。フェノールの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋を着用する必要があることを忘れないでください。