Name: 軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイインビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ5-mCドットブロットアッセイによる軟骨細胞脱分化時のDNAメチル化レベル定量化法。軟骨欠損治療や自己軟骨細胞移植における細胞表現型評価に応用でき、再生医療研究の発展に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、以下のグラントによって支持された：中国の自然科学財団（No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460）;広東省自然科学財団、中国（No. 2015A030313772）;中国ポストドクター・サイエンス財団資金提供プロジェクト（No. 2013M530385）;中国広東省の医学研究財団（No. A2016314）;深セン科学技術プロジェクト（No.JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200）。

この研究は、深セン第二人民病院の人間倫理委員会によって承認された。 1.ヒト関節軟骨組織収集および軟骨細胞培養<ol><li> 材料の準備 <ol><li> 10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地を調製する。 1mg / mLコラゲナーゼII、0.25％トリプシン-EDTA、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）および細胞ストレーナー（40μmナイロン）を調製する。 </li></ol></li><li> ヒト関節軟骨組織収集 <ol><li>外傷後にドナー患者の膝関節から関節軟骨を隔離する。すべての参加者からインフォームドコンセントを得る。 </li><li>滅菌メスを使用して軟骨を1〜2mm 3個に切って、37℃で12〜16時間DMEM中の1mg / mLコラゲナーゼIIを含む軟骨軟骨から軟骨細胞を消化する。 </li><li>結果のセルをフィルタリングする細胞懸濁液（40μm）で懸濁し、PBSで2回洗浄する。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したDMEM中で、血球計算器および20,000〜30,000細胞/ cm 2の密度で細胞を計数する。 </li><li>インキュベーターで37℃で培養する。 </li></ol></li><li> 単層軟骨細胞増殖 <ol><li> 0.25％トリプシン-EDTAを用いてサブコンフルエントな細胞を採取し、6,600細胞/ cm 2の密度で再プレートする。 1週間に2回、培地を交換する。 </li><li>単層の軟骨細胞を6継代まで培養し、継代1,2,3,4および5で評価する。 </li></ol></li></ol>ゲノムDNA（gDNA）抽出<ol><li> 100万個の細胞あたり500μLの溶解バッファー（15mM Tris pH 8.0,10mM EDTA pH 8.0,0.5％SDS、200μg/ mL RNase A）で細胞を回収し、再懸濁する。ピペッティングと急速逆転により細胞を再懸濁し、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> AddプロテイナーゼKを160μg/ mLの細胞溶解液の濃度で添加し、混合物を激しく逆転させる。 55°Cで6時間インキュベートする。 </li><li>トリスpH 7.9飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）の1容量を試料に添加する。約20秒間手でボルテックスまたは振とうします。 </li><li>試料を13,000×gで5分間室温で遠心分離する。上部の水相を除去し、層を新しいチューブに移す。 </li><li>等量のクロロホルムで抽出してフェノールを除去し、上部の水相を新しいチューブに移す。 </li><li> 0.1Mサンプルの3M酢酸ナトリウムpH8.0および2倍量の100％エタノールを加えてDNAを沈殿させる。 </li><li>チューブを-20℃で一晩保存してgDNAを沈殿させます。 </li><li>サンプルを4℃で16,000 xgで10分間遠心分離してgDNAをペレットにします。 </li><li>サンプルを70％エタノールで3回洗浄し、4℃で2分間、13,000×gで遠心分離する。 </li><li>スーパーナタールを取り除く注意深く風乾してください。 DNAを10mMトリスpH8.0,0.1mM EDTAに再懸濁する。 </li></ol> DNAメチル化プロファイリング<ol><li> DNAメチル化キットを使用して、製造業者のプロトコールに従って、総500ngのゲノムDNAを使用して重亜硫酸塩変換反応を実施する。 10μLの溶出バッファー（50 ng /μL）で溶出する。 </li><li>市販のキットを製造業者のプロトコールに従って用いてDNAメチル化プロファイリングを行う。 </li></ol> 4.ドットブロット分析<ol><li>単離されたDNA（サンプルあたり1 mg）を0.1 M NaOHで95℃で10分間変性させます。氷上で1 M NH 4 OAcでDNAを中和し、次に2倍に希釈する。連続希釈されたゲノムDNA2μLをN +膜にスポットする。 </li><li>膜を80℃で30分間ブロッティングする。 </li><li> TBS-T中の5％BSAにN +膜を1時間浸漬することにより、非特異的な抗体結合部位をブロックする。反応として10cmのペトリ皿を使用するイオンチャンバー内に室温で置く。 </li><li> TBSTで5分間3回洗浄した後、膜をTBS-T中マウス抗5-メチルシトシン（5-mC）モノクローナル抗体（1：1,000）と4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>膜をTBS-Tで5分間3回洗浄し、次いでTBS-T中の二次抗体であるHRPコンジュゲートヒツジ抗マウス免疫グロブリン-G（IgG）（1：5,000）と共に室温で1時間インキュベートする。 </li><li>膜をTBS-T中で5分間3回洗浄する。 </li><li>酵素基質を膜に加え、5〜10分間インキュベートする。製造元の指示に従って、化学発光キットを使用して二次抗体シグナルを視覚化する。 </li></ol>

<ol><li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation%3A+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li>
<li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).</li>
<li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li>
<li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li>
<li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li>
<li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li>
<li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li>
<li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states%2C+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li>
<li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

インビトロでの軟骨細胞脱分化は、軟骨欠損修復の治療におけるACIの結果を著しく損なう11,12 。 ACI結果を最適化するためには、脱分化した軟骨細胞の使用を避けることが重要です13 。研究は、一般的なDNAメチル化レベルが軟骨細胞脱分化の程度に関連していることを示唆している4,6。したがって、臨床応用の前に軟骨細胞の一般的なDNAメチル化状態を検出するための信頼性の高い迅速な方法を確立することが不可欠である。 脱分化したヒト軟骨細胞における一般的なDNAメチル化レベルを検出するために、連続継代軟骨細胞における5-mCレベルを測定することができた。重亜硫酸塩処理により5mCは脱アミノ化に耐性があります。この性質を利用して、DNAシトシンメチル化パターンをt彼は重亜硫酸塩シーケンシングアプローチ14 。バイサルファイトゲノム配列決定およびメチル化感受性制限消化は、DNAメチル化の検出のための金標準技術とみなされている<su...

自己軟骨細胞移植（ACI）は、関節軟骨欠損を治療するための比較的新しい、最先端の方法である1,2 。 ACIの重要なステップの1つは、 インビトロでの単層培養による軟骨細胞の増幅である。増幅中、硝子軟骨細胞は容易にその表現型を失い、脱分化し、ACI処置3,4にとって望ましくない。 ACI治療の結果を最適化するために、軟骨細胞脱分化の程度は、再移植の前に決定されるべきである。軟骨細胞の状態を決定する経済的かつ迅速な方法を確立することが不可欠です。近年、DNAメチル化と軟骨細胞の脱分化との関連が注目されている4,5,6。 DNAメチル化は、whメチル基がDNAに付加され、シトシン残基が5-メチルシトシン（5-mC）に変換される。 軟骨細胞の脱分化におけるDNAメチル化の生物学を解明するために、第一段階は軟骨細胞のDNAメチル化レベルを評価することであり、これまで困難であった。バイサルファイトのゲノムシーケンシングは、DNAメチル化を解析するために最も広く使用されている手法です7,8 。このアッセイでは、重亜硫酸塩の変換はDNA分解を引き起こすため、アッセイのために相当量の試料を提供しなければならない。また、グローバルDNAメチル化レベル9,10を定量するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が使用されています。しかしながら、HPLC分析はゲノムDNA消化を必要とする。さらに、高度で高価な実験器具が必要である。したがって、高コストに加えて、これらの実験手順は、時間の短所uming。現在、抗5-mC抗体が市販されており、複合ゲノムからの5-mC含有ゲノムDNAの免疫ブロットの可能性が生じている。 この報告では、一連の単層培養で増殖した軟骨細胞からゲノムDNAを抽出した。本発明者らは、異なる数の継代を有するヒト軟骨細胞における5-mC含量を評価するために、ドットブロットアッセイを使用した。我々は、5-mC含量が、低分化脱分化を伴う軟骨細胞と比較して、高度に脱分化した軟骨細胞において増加することを見出した。さらに、脱分化状態と5-mCレベルとの間の関係を同定した。最後に、我々は、5-mC含量の変化が軟骨細胞の表現型と関連していることを報告した。したがって、5-mCドットブロットアッセイは、軟骨細胞におけるDNAメチル化レベルを検出するための信頼性が高く、簡単で迅速な方法である。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ギブコ株式会社</td><td>11965年&ndash;092</td><td>37°Cで暖かい。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td>使用前のCウォーターバス<td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>D-PBS、Ca2+/Mg2+</</td></tr><tr><td>sup>FBS</td><td>Gibco Inc.</td> 不使用<td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>ギブコ株式会社</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1% ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>マリンクロット</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>Sigma</td><td>I-3643</td><td></td></tr><tr><td>フェノール</td><td>Gibco BRL</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Gibco BRL</td><td>24568-2</td><td></td></tr><tr><td>TAE バッファー&nbsp;</td><td>バイオウィテ</td><td>カー16-011V</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Gibco BRL</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Biosharp Inc.</td><td>BL514A</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>(株)ビオトッピング</td><td></td><td></td>C58H114O26</tr><tr><td>BSA</td><td>プロリアント株式会社</td><td>68700</td><td></td></tr>コ<tr><td>ラゲナーゼ、II型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 100 mm ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>ガンマ滅菌高速</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>MIULAB</td><td>MTH-100</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素細胞インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>ケミイメージング解析システム</td><td>UVITEC Cambridge</td><td>ALLIANCE</td><td></td></tr></tbody></table>

軟骨細胞分化のdnaメチル化レベルを定量化する5-mcドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

硝子軟骨細胞の繊維芽細胞様軟骨細胞への脱分化は、しばしばインビトロでの軟骨細胞の単層拡大を伴う。軟骨細胞の全体的なDNAメチル化レベルは、軟骨細胞表現型の喪失に適したバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、異なる実験方法に基づく結果は矛盾することがある。したがって、軟骨細胞の脱分化の間の全体的なDNAメチル化レベルを定量化するための正確で単純で迅速な方法を確立することが重要である。 現在のゲノムワイドメチル化分析技術は、主にバイサルファイトゲノム配列決定に依存している。亜硫酸水素塩転換中のDNA分解のために、これらの方法は、典型的には、大きな試料量を必要とする。全体のDNAメチル化レベルを定量するために使用される他の方法には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。しかしながら、HPLCはゲノムDNAの完全消化を必要とする。さらに、HPLCのコストが非常に高くなります。HPLCの幅広い応用が制限されています。 この研究では、ゲノムDNA（gDNA）を、様々な継代数で培養したヒト軟骨細胞から抽出した。 gDNAメチル化レベルは、メチル化特異的ドットブロットアッセイを用いて検出した。このドットブロットアプローチでは、検出されるべきメチル化DNAを含むgDNA混合物を、先に描かれた円形鋳型パターン内のドットとしてN +膜上に直接スポットした。他のゲル電気泳動に基づくブロッティング法および他の複雑なブロッティング法と比較して、ドットブロット法はかなりの時間を節約する。加えて、ドットブロットは、市販の5-mC抗体を用いて全体のDNAメチル化レベルを検出することができる。本発明者らは、DNAメチル化レベルが単層継代培養の間で異なり、したがって軟骨細胞脱分化に重要な役割を果たすことができることを見出した。 5-mCドットブロットは、一般的なDNAメチル化レベルを検出して評価するための、信頼性の高い簡単で迅速な方法です軟骨細胞表現型。

軟骨細胞は継代6まで単層培養した（P6）。軟骨細胞は、単層培養の連続継代で進行性の表現型の変化を示した。 P0軟骨細胞形態は丸いが、細胞はP6までの連続継代で高度に挟み込まれ、平滑化された（ 図1 ）。この形態変化は、軟骨細胞脱分化プロセスの典型である。一方、ヒートマップの結果は、継代培養の延長によりCpG部位の一般的なメチル化レベルが増加することを示した。 5-mCドットブロット分析は、より高いCpGメチル化レベルが軟骨細胞増殖に付随することをさらに実証した（ 図2 ）。これらの結果は、一般に増加したメチル化レベルと軟骨細胞脱分化との間の関連を示唆した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55565/55565fig1.jpg" /> <strong&gt;図1：倒立顕微鏡を用いて観察されたヒト軟骨細胞形態。 <a href="htt...

本発明者らは、5-メチルシトシン（5-mC）ドットブロットに基づいてDNAメチル化を定量する方法を提示する。我々は、軟骨細胞脱分化の間の5-mCレベルを決定した。この単純な技術は、ACI治療における軟骨細胞の表現型を迅速に決定するために使用することができる。

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

本実験の目的は、軟骨細胞の脱分化における5-Methylcytosineレベルを測定することです。この手法は、自家軟骨細胞移植などの細胞を用いた軟骨欠損治療における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、軟骨細胞のフェノタイプを評価するための全般的DNAメチル化レベルを検出するための、信頼性が高く、簡便で迅速な方法であることです。この技術の意義は、我々が手がける自家軟骨細胞移植における標準的なアプローチにあります。なぜなら、軟骨細胞の脱分化過程におけるDNAメチル化が、軟骨欠損に対する自家軟骨細胞移植治療の大きな障害となっているからです。本手法は、軟骨細胞の脱分化におけるDNAメチル化レベルに関する知見を提供できるだけでなく、変形性関節症などの他の疾患研究にも応用可能です。我々は、ドットブロット法の参考文献にあるプロトコルを読んだ際に、本手法を着想しました。ドットブロットの状態を特定することは困難であるため、本手法のデモンストレーションを示すことは極めて重要です。ゲノムDNAを変性させた後、段階希釈します。その後、正電荷ナイロンメンブレン上に固定してください。手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の大学院生であるZhaofeng Jiaです。本研究で使用した関節軟骨組織は、外傷後のドナー患者の膝関節から採取したものです。滅菌メスを用いて、軟骨を1〜2立方ミリメートルの大きさに細切します。次に、細切した軟骨に1 mg/mLのcollagenase IIとDMEMを加えます。そして、軟骨細胞を消化させるため、37 °Cで12〜16時間インキュベートします。翌日、得られた細胞懸濁液を40 µmのセルストレーナーでろ過します。細胞を遠心分離して回収します。上清を捨て、PBSを加えて再度遠心分離します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。1 cm²あたり20,000〜30,000個の密度で細胞を播種し、10% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養します。37°Cのインキュベーター内で48時間培養した後、0.25% trypsin EDTAを用いてコンフルエント手前の細胞を回収します。そして、1 cm²あたり6,600個の密度で再播種します。軟骨細胞を単層で最大6代まで培養し、1、2、3、4、および5代目で評価します。この手順を開始するには、トリプシン処理および遠心分離によって細胞を回収します。次に、ピペッティングと迅速な転倒混和により、細胞10 million個あたり500 µLの溶解バッファーで細胞を再懸濁します。37 °Cで1時間インキュベートします。細胞溶解液に対して160 µg/mLの濃度になるようにプロテアーゼKを添加し、混合液を激しく転倒混和します。55°Cで6時間インキュベートします。各サンプルに、Tris pH 7.9飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを等量加えます。サンプルを手で約20秒間、十分に振盪します。室温にて 13,000 ×g で5分間、サンプルを遠心分離します。上層の水相を除去し、新しいチューブに移します。フェノールを除去するため、各チューブに等量のクロロホルムを加えます。手で振盪し、遠心分離して回収します。上清の水相を新しいチューブに移します。3 M 酢酸ナトリウム (pH 8) をサンプル量の0.1倍量、および100%エタノールを2倍量加えます。ゲノムDNAを沈殿させるため、チューブを-20 °Cで一晩保存します。翌日、サンプルを4 °C、16,000 ×gで10分間遠心分離し、ゲノムDNAをペレット化します。サンプルを70% ethanolで洗浄します。4°Cで2分間、13,000 ×gで遠心分離します。上清を慎重に取り除き、DNAペレットを風乾させます。DNAを10 mM Tris pH 8 0.1 mM EDTAに再懸濁します。分離したDNAを0.1 M 水酸化ナトリウム中で95°Cで10分間変性させることから、この手順を開始します。氷上で1 Mの酢酸アンモニウムを用いてDNAを中和します。その後、二回蒸留水で2倍に希釈します。ドットブロットアッセイにおいて最も重要な工程はサンプルのスポットであるため、ゆっくりと慎重に行ってください。各スポットアレイの直径が3～4 mmになるように調整してください。口径の狭いピペットチップを用い、段階希釈したゲノムDNA 2 µLを、グリッド中心の正電荷ナイロン膜上に慎重にスポットします。メンブレンを80 °Cで30分間ブロットします。次に、10 cmのペトリ皿内で、メンブレンを5% BSA含有TBSTに浸し、室温で緩やかに振盪しながら1時間置いて、非特異的な抗体結合部位をブロックします。1時間後、TBSTでメンブレンを5分間ずつ3回洗浄します。その後、マウス抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体を含有するTBST中で、メンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、メンブレンをTBSTで5分間ずつ3回洗浄します。次に、二次抗体である horseradish peroxidase 標識羊抗マウス immunoglobulin G を含むTBST中で、室温で1時間インキュベートします。前述と同様にメンブレンをTBSTで洗浄した後、酵素基質をメンブレンに加え、5～10分間インキュベートします。最後に、メーカーの指示に従って化学発光キットを用いて二次抗体のシグナルを可視化します。単層培養された継代6回目までの軟骨細胞では、継代を繰り返すごとに細胞が高度に収縮し、扁平化するという段階的な表現型の変化が認められました。この形態変化は、軟骨細胞の脱分化過程に典型的なものです。さまざまな継代数の軟骨細胞からゲノムDNAを抽出し、5-メチルシトシン特異的ドットブロットアッセイによってDNAメチル化レベルを評価した。ドットの強度はImage Jを用いて解析した。サブカルチャーの長期化に伴い、5-メチルシトシンのレベルが段階的に上昇することが観察され、全般的なメチル化レベルの上昇と軟骨細胞の脱分化との間に相関があることが示唆された。この手法に習熟し、適切に実施すれば、24時間以内に完了させることができる。この手順を試みる際は、ゲノムDNAの濃度と純度を最大限に高めることが重要です。本手順に続き、単一培養における軟骨細胞の脱分化などのさらなる疑問を解決するために、ゲノムDNAメチル化プロファイリングなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、自家軟骨細胞移植分野の研究者が軟骨細胞のDNAメチル化を評価し、軟骨欠損治療における軟骨細胞のフェノタイプを決定することが可能となりました。このビデオを視聴することで、軟骨細胞の表現型を評価するために、変性機械レバーを検出するための5-Methylcytosineドットブロットの使用方法について十分な理解が得られるはずです。フェノールを用いた操作は極めて危険であるため、この手順を行う際は常に手袋を着用することを忘れないでください。

a-5-mc-dot-blot-assay-quantifying-dna-methylation-level-chondrocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

EpiMark 5 - HMCおよび5 - MCの分析キットは、5 - メチルシトシンとSPE cific座内5 - hydroxymethylcytosineを分析し、定量するために使用することができます。キットには、（T4 - BGT）β-グルコシルトランスフェラーゼを利用した酵素反応を介して5 - HMCの水酸基にグルコースを添加することによって5 - HMCから5 - MCを区別します。 5 -...

のBalb / Cの脳組織の高感度5 hydroxymethylcytosine検出

このビデオでは、ナイロン膜上でのDNAサンプルのブロッティングとその後のモノクローナル抗体による可視化により、in...

DNAメチル化の程度を決定するための5-メチルシトシンドットブロット

我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。...

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。...

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs...

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

このレポートの目的は、エピジェネティックな遺伝子マーカーの堅牢な免疫組織化学的検出のためのプロトコルを記述するためです、5-メチルシトシン (5mC) および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)...

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

ここでは、細胞および脳組織中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示し、免疫蛍光染色およびDNAドットブロット法を利用する。...

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。...

フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

成熟した脂肪細胞は、脱分化を通じて幹細胞の豊富な供給源を表している可能性があり、これにより線維芽細胞様細胞の均一な集団が形成されます。コラゲナーゼ消化は、ヒトの脂肪から成熟脂肪細胞を分離するために使用されます。私たちのプロトコルの目標は、ヒトの成熟脂肪細胞から多能性で脱分化した脂肪細胞を取得することです。...

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

特定のDNA標識であるメチルグリーンで固定された生物学的物質を蛍光染色する方法が説明されています。メチルグリーンは希釈水溶液中で使用され、光退色に対して非常に耐性があります。その遠赤色発光により、深い標本イメージングが可能となり、特に全胚に適しています。...

胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

学ぶ5-mCドットブロットアッセイによる軟骨細胞脱分化時のDNAメチル化レベル定量化法。軟骨欠損治療や自己軟骨細胞移植における細胞表現型評価に応用でき、再生医療研究の発展に貢献します。

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ

さらに動画を探す