Name: 多層皮質Ca 2+プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ多層皮質Ca²⁺イメージング法。自由に動くマウスの複数の大脳皮質層における遺伝子導入ニューロンの活動を可視化し、神経回路の機能を解析する。小型蛍光顕微鏡とプリズムプローブを使用する。

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著者らは、AAV1-GCaMP6fの寛大な寄贈について、Howard Hughes Medical InstituteのJanelia Research CampusのGenetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector（GENIE）プロジェクトのV. Jayaraman、DS Kim、LL LoogerおよびK. Svobodaに感謝したい。ペンシルバニア大学のVector Coreに彼らはまた、共焦点顕微鏡検査サービスのためのNIH NS069375助成金によって支えられているスタンフォード大学のA.オルソンと神経科学顕微鏡コアに感謝したいと思います。

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<li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li>
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<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells%2C+including+respective+grid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li>
<li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li>
<li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763(2016).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Rowland, D. C., Moser, M. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cortical+modules+to+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
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<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li>
<li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma.+Rev%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li>
<li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice%3A+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068(2014).</li>
</ol>

著者はジャーナルの方針を読み、以下の競合する利益を持っています：SG、SO、VCはInscopixの従業員です。

覚醒行動中の神経回路活動を理解することは、健康および疾患における脳機能を効果的に解剖するために必要な神経科学的調査の極めて重要なレベルである。皮質は、多くの重要な感覚、認知および執行機能において重要な役割を果たすので、目覚め行動の文脈において研究するために特に重要な領域である 28,29 。 皮質柱は皮質の基本機能単位であると考えられ、皮質細胞の集団レベルの活動は柱内の物理的位置に基づいて異なることが知られている。例えば、体性感覚皮質の層2/3の興奮性ニューロンは、主に他の新皮質領域に投射し、他の皮質網30を変調するが、深層の細胞は主に視床31のような皮質下領域に投射する。百の活動を記録する自由行動する被験者の異なる薄層を経て、時間と共に同時に予め指定された皮質細胞の塊状構造が、皮質情報フローの我々の理解を大きく促進し、リアルタイムの行動情報およびタスク関連の時間依存性の情報によって知らされる皮質柱の、スケール。 このレベルの神経回路データを収集することは、自由に行動する被験者（または頭に固定された被験者）における大規模なCa 2+イメージングを行うための、効率的かつ合理化された小型化された顕微鏡プラットホームの使用によって可能となる。このプロトコルは、細胞型特異的標的化を可能にする遺伝的にコード化されたカルシウムインジケータとともに使用され、慢性的に移植されたプリズムプローブによって提供される多層視野を画像化する、このプロトコルは、多くの可能な用途の1つのケースを探究した：マウスの体性感覚皮質処理物理的に新しい物体と噛み合っていた（ 図5 ）。これは、起きて自由に行動する動物において複数の皮質層を研究するためのこの種の細胞型特異的インビボアプローチの最初の手順図であり、能動的な脳の層状構造を理解するのに利用可能な実験方法のスペクトルを広げる。 関心領域に直接背側の組織の保存が望まれる場合、この技術におけるプリズムプローブによって有効にされる展望視野は、他の脳構造に適用可能である。例えば、CA3画像化は、海馬の機能を中断させることなく達成することができた。 Ca 2+活性をイメージングするためのプリズムプローブベースのアプローチは、皮質へのマイクロプリズムの物理的挿入および永久移植を必要とし、これはレンズプローブが挿入される皮質病変の生成に相当する。これは、頂端の樹状突起およびプロセスの切断を含む、局所的な神経回路への混乱をもたらす可能性がある。 T彼の手順はまた、領域内のグリア細胞の初期活性化を引き起こすが、これは、プリズム表面から約150μmの組織に局在し、脳が治癒した後に鎮静すると予想される。実験を計画するとき、この技法が動物の正常な回路解剖学および/または行動に影響するかどうかを検討することは非常に重要である。行動対照群は、交絡実験結果を生み出すベースライン行動に重大な変化がないことを確実にするために常に実施すべきである。 神経薬理学的操作、様々な認知的、社会的、運動的または内的行動学的パラダイムを用いたこの小型化された移動性Ca 2+イメージング技術を使用し、それを他の生理学的測定基準と組み合わせることにより、行動および信号における神経回路の機能的役割処理32 。抑制または活動薬物によって調節される特定の経路の作用は、この技術を用いて容易に研究することができる関連する行動に影響し得る33 。カルシウムインジケータのターゲッティングを変更することによって異なる細胞型に分岐することは、他の強力かつ有用な応用であり、様々な神経回路の問題に対処するための実験ツールの多くの独創的な組み合わせを可能にする。

皮質は、注意、知覚、トップダウンの認知制御1,2,3から動機づけ、報酬、中毒経路まで、多くの複雑な精神的および行動的機能における必須の要素である 4,5 。その機能の基礎となる計算プロセスを理解することは、多くの精神的および行動的障害のより良い臨床的理解を促進する重要な目標である。 皮質神経回路の機能不全または不調和が、精神分裂病6 、自閉症7または強迫性障害8のような状態の特徴である認知および行動異常の基礎をなす可能性があるという考えのまわりの精神医学的疾患センターの多くの現在の理論が中心である。したがって、共同体からの集団レベルの神経活動データを得ること同時行動情報の適切な文脈内の回路は非常に重要であり、理想的には、より細かい神経回路解剖のための特定の細胞型を標的とすることができる。 埋め込み型勾配屈折率（GRIN）マイクロレンズと組み合わせた小型化された顕微鏡は、皮質14,15,16を含む多様な可能な脳領域9,10,11,12,13から自由に動く条件下でニューロンアンサンブルへの光学的アクセスを可能にする。遺伝的にコード化されたカルシウムインジケータと結合した移動式顕微鏡検査システムを使用することにより、多くの脳領域9において数日から数週間にわたる何百ものニューロンを包含する同じ細胞集団の一貫したイメージングが可能になり、ウイルスベクターまたはトランスジェニック技術を用いて特定の細胞型に遺伝的に標的化される。 皮質が異なる機能をサポートし、皮質薄層17,18,19内の細胞の位置に依存して異なる脳領域に接続することが知られているので、我々は目覚める行動する被験者において同時多層神経活動を得ることに興味がある。ここでは、小型蛍光顕微鏡20を皮質の多層ビュー（ 図1 ）を提供する移植されたプリズムプローブと組み合わせて使用​​して、自由に行動するマウスにおいて何百もの蛍光標識されたニューロンを画像化する方法を示す 。 ここで使用されているプリズムプローブは、2つの別々のGRINレンズで構成されています：プリズムとシリンドリカルリレーレンズ（ 図1 ）。顕微鏡からの光は、蛍光標識されたプローブのプリズム部分の斜辺から反射された後に、プリズムプローブの撮像面に沿って配置される。細胞から放出された光は、プリズムの斜辺から反射し、顕微鏡の対物レンズを通して集められ、顕微鏡内のセンサーに到達する。この手順で使用されるプリズムプローブは、標準の定位固定装置で簡単に使用できるようになっています。 小型蛍光顕微鏡20は、Ca 2+感受性遺伝的にコードされた蛍光インジケータで特異的に標識された後、単一細胞分解能を有するニューロン集団における活動電位誘発性のCa 2+トランジェントを検出する。このプロトコールでは、ウイルスベクター（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）にコードされたCa 2+インジケーターを注入し、プリズムプローブを移植し、顕微鏡を設置し、次に体性感覚（S1後肢）神経活動データ動物からの暴露dを自由探査中の新規物体表面に適用する（ 図2 ）。

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized 超精密小動物固定装置</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ステレオスコープ</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>手術およびイメージング</td></tr><tr><td>ミニ直腸サーミスタプローブ (.062インチ/1.6 mm 直径) - 1/4" ジャック</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>手術</td></tr><tr><td>用加熱パッド 5 X 12.5 cm&nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>手術</td></tr><tr><td>DC 温度コントローラー</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>手術</td></tr><tr><td>用マイクロシリンジポンプ</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 モデル; シリアル 155788 F110</td><td>手術</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &mu;L シリンジ</td><td>ワールド精密機器</td><td>NANOFIL</td><td>手術</td></tr><tr><td>35 G 開先 ナノフィル NDL 2PK</td><td>ワールド精密機器</td><td>NF35BV-2</td><td>手術</td></tr><tr><td>オムニドリル35, 115 - 230 V</td><td>ワールド精密機器</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>手術用バー マイクロドリル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-05</td><td>手術</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>AAV1です。CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&nbsp;</td><td>手術</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ビクターメディカル</td><td>1001054</td><td>サージェ</td></tr>リー<tr><td>ゲルフォーム(パターソン獣医供給株式会社ゲルフォームスポンジ12 cm x 7 mm)</td><td>ファイザー(フィッシャーサイエンティフィック)</td><td>NC9841478</td><td>外科</td></tr><tr><td>デュモン#5/45鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr>外科<tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td>外科</td></tr><tr><td>解剖ナイフ</td><td>ファインScience Tools</td><td>10055-12</td><td>手術</td></tr><tr><td>用 ProView インプラントキット</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>手術およびイメージング</td></tr><tr><td>ProView プリズムプローブ 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm 長さ</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>手術およびイメージング</td></tr><tr><td>Kwik-Sil 粘着剤 2 個入り</td><td>ワールド精密機器</td><td>KWIK-SIL</td><td>手術</td></tr><tr><td>用 Kwik-Cast シーラント</td><td>ワールド精密機器</td><td>KWIK-CAST</td><td>手術とイメージング</td></tr><tr><td>ミニチュア光学マウントポスト</td><td>ニューポート</td><td>M-TSP-3</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>顕微鏡ベースプレート</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td></td></tr>イメージング<tr><td>顕微鏡ベースプレートカバー</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td></td></tr></tbody></table>イメージング

多層皮質ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

インビボでの回路および細胞レベルの機能イメージングは​​、脳を実際に理解するための重要なツールです。 2光子顕微鏡法を用いたマウス大脳皮質ニューロンの高解像度イメージングは​​、皮質構造、機能および可塑性についてのユニークな洞察を提供している。しかし、これらの研究は頭部固定動物に限られており、研究に利用可能な行動の複雑さを大幅に低減する。この論文では、自由に行動するマウスの複数の皮質層にわたる細胞解像度で慢性蛍光顕微鏡検査を行うための手順を説明する。本発明者らは、移植されたプリズムプローブと組合わされた小型の蛍光顕微鏡を使用して、数日間に亘って新しい物体探査課題に関与するマウスとして、体性感覚皮質の複数の層にわたって数百のニューロンのカルシウム動態を同時に視覚化し記録した。この技術は、異なる動物種の他の脳領域に、他の行動paradigms。

ここに概説されたプロトコルは、プリズムプローブ（ 図1 ）を用いて自由に行動するマウスにおいて、何百もの皮質ニューロンから縦多層のCa 2+イメージングを行う効果的かつ効率的な方法を説明している。多層皮質画像化への以前のアプローチは、主に固定動物22,23,24,25,26,27に限定されていた。自由に行動する状況でこのレベルのデータを取得するために、小型化された顕微鏡プラットフォームを行動の柔軟性のために使用した。遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（GCaMP6f）を用いて特定の細胞集団（CAMKII +細胞の皮質）を標的化した。慢性の多層視野を提供するためにプリズムプローブを選択した。 図2 、ステップ1）。イメージングセッション中に顕微鏡を配置するための安全な一時的ドックとして機能するベースプレートを動物頭部に設置し（ 図2 、ステップ3）、覚醒している実験的実験で複数の細胞層にわたる皮質活動の可視化を可能にしたセットアップ（ 図2 、ステップ4）。 所望の細胞集団を確実に標的とするために、代表的なマウス由来の死後の冠状脳切片を図3に示し、プリズムプローブ領域および視野をGCaMP6fラボに関連してマークした身体感覚皮質の2/3および5層における神経細胞の脱出。 Open Field（1日目）、Object Familiarization（2日目〜4日目）、およびNovel Object（5日目）の3つの異なる環境にマウスを曝露したとき、体感感覚皮質ニューロンの活動が記録された。 図4 ）。 1日目に、マウスは何の物体も欠いている行動アリーナに置かれた。 2〜4日目に、同じ2つのテクスチャ的に異なるオブジェクト（ゲルパッドと木ブロック）を用いてマウスをアリーナに配置した。 5日目に、オブジェクトの1つが新しいオブジェクトに置き換えられました。動物を毎日20分間5日間にわたって撮像した。 Ca 2+画像データ分析ソフトウェアを用いた細胞抽出後、細胞位置に対応する空間フィルタを、顕微鏡記録データの平均蛍光強度投影上に重ねた（ 図5） 。白い破線は、層2/3および5のセルを分離する。各層からの5つの細胞からの対応するCa 2+トレースは、2つの異なる行動状況、すなわち、オブジェクトのファミリアリゼーションおよび新規のオブジェクト曝露における細胞の発火パターンを示す。層2/3細胞は、マウスを新規対象に曝露した日に層5細胞と比較してより活性であった。これは、1日目、4日目および5日目に撮像されたすべての細胞の閾値化された発火活性を示すラスタプロットからも明らかである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> 図1：自由に動くマウスにおける複数の皮質層にわたるインビボ Ca 2+イメージング。 （ A ）プリズムプローブの仕様とイメージング面の描写。斜辺の内側の反射コーティングは、プリズムプローブの挿入面から90°の結像を可能にする。レンズcuffはレンズホルダーと一体化し、移植手順を合理化し、移植中の周辺組織の蛍光を潜在的に見ることができる（ B ）（i）。 （ii）ナイフ切開およびウイルス注射部位に対するプリズムプローブの平らな側面の位置の図解である。 （ C ）マウス大脳皮質に移植されたプリズムプローブを介して全視野内の小さな領域の光路を示すインビボ Ca 2+イメージング設定の図。 （ D ）プリズムプローブ設置中の視野の例。ミニチュア顕微鏡はプリズムプローブを保持するレンズホルダーに取り付けられており、プリズムプローブの設置中にウイルスの発現を確認することができます。 （ E ）GCaMP6f標識S1細胞の多層皮質画像化のためのプリズムプローブと顕微鏡の統合。 F視野の例ベースプレートの取り付け時。生の画像にいくつかの細胞を入れたベースプレートの設置時に、明確な血管パターンが見えます。取得ソフトウェアウィンドウでDF / Fをオンにすると、より多くのセルがはっきりと見えます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> 図2：Prism Probe ImplantationとMicroscope Installationのワークフローイベントのタイムラインを示す図。週数は、Y軸に沿ったプロシージャのX軸とワークフローのステップで表されます。 （ A ）マウス体性感覚皮質の複数の層を標識するために、同じ背側腹軸に沿ったウイルス注射（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）を示す図。 （ B ）ウイルス注射の2週間後、プリズム・プローブeは、ウイルス注入部位に平行な軸に移植される。 （ C ）プリズムプローブ移植のおよそ1週間後、動物の顕微鏡での発現をチェックし、細胞集団が見える場合には、ベースプレートを頭部に装着する。 （ D ）その後、動物は、関連する行動課題（マウスクリップアートは、UW-Madison Biochemistry MediaLabから許可を得て変更された）の間、慢性画像化の準備が整う。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> 図3：プリズムプローブの位置およびGCaMP発現の死後の組織学的検証。 （ A ）プリズムプローブ領域を示し、そのイメージング側が向いている代表的なマウスの脳からの冠状切片GCaMP6f発現細胞（AAV1.CaMKII.GCaMP6fは、層2/3および5のニューロンにおいて発現される）。 （ B ）DAPIに対する染色後の同じ冠状脳切片。スケールバー=250μm（ C ）体性感覚皮質におけるGCaMP6f発現細胞の視野を拡大。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> 図4：慣れている間のマウスの活動、ファミリアリゼーション、および新規オブジェクトの露出テストはビデオソフトウェアを使用してビデオトラッキングされました。 （ A ）1日目に、動物は何の物体も欠いている行動場に置かれた（オープンフィールド）。 （ B ）2〜4日目に、同じ2つのテクスチャ的に異なるオブジェクト（ゲルパッドと木ブロック）をアリーナに置いた（Object Fami嘘つき）。 （ C ）5日目に、物体の1つを新しい物体（砂の木を有する木ブロック）（新規物体曝露）に置き換えた。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> 図5：顕微鏡で撮影された代表的なマウスの体性感覚皮質の表層および深層からのカルシウム動態。 （ A ）ニューロンの空間フィルタ（緑色の斑点）と、プリズムプローブ視野を通した顕微鏡記録の平均蛍光強度投影の合成画像。白い破線で示される顆粒層と顆粒層の間の境界。スケールバー=100μm。 （ B ）5つの例示的な表層細胞および深層細胞からのカルシウムトレース（青色および赤色のcパネルAのells）、主成分分析および独立成分分析後の蛍光の標準偏差の単位を示す。水平スケールバー50sおよび垂直スケールバー10SD（ C ）オープンフィールド、オブジェクトファミリアリゼーションおよびノベルオブジェクトの探索で示された表面（レイヤ2/3）および深層（レイヤ5）からのセルのラスタプロット。スケールバー= 100秒。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

本手順の全体的な目的は、カルシウム指示薬を用いることで、自由行動下のマウスにおける皮質ニューロンの複数層にわたる神経活動を同時に可視化し、小型ヘッドマウント蛍光顕微鏡を用いて神経回路の機能を理解することです。この手法は、「皮質の複数層間で情報はどのように伝播するのか」という、システム神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、自由行動下の動物において、遺伝的にコードされた多数のニューロンを複数の皮質層にわたって、長期間にわたり安定して可視化できる点にあります。自由行動下の動物において、複数の皮質層から遺伝的にコードされたニューロンを可視化するためには、以下の手順を行う必要があります。本プロトコルでは、プリズムプローブの植え込み、ベースプレートの設置、および自由行動下のマウスにおけるin vivoイメージングに焦点を当てます。まず、ウイルス注入の1〜2週間後、動物を定位固定装置にセットし、70% ethanolで消毒しレンズペーパーで清掃して、プリズムプローブ植え込み手術の準備をします。次に、0.5 mmのバーを備えたマイクロドリルを用いて、円形の開頭処置を行います。開頭部の直径がプリズムの直径よりわずかに大きくなるようにしてください。次に、プリズムを皮質に挿入した際、その平坦な面がウイルス注入部位に向き、かつ半径150〜200 µm以内に位置するように開頭位置を調整します。その後、微細鑷子を用いて硬膜を除去します。脳組織が露出した後は、常に滅菌生理食塩水で組織を湿らせておいてください。これにより、組織への圧力が維持されます。プリズムプローブの挿入時に脳組織への圧力を軽減するため、脳定位固定装置の電極ホルダーアームに直線的な解剖ナイフを取り付け、挿入経路を作成します。ナイフプレートが頭蓋骨の曲率に対して垂直になり、かつウイルス注入カラムと平行な平面になるように、角度をつけて固定します。ナイフを、開頭部位の内側縁に沿って、ウイルス注入部位から外側に約200 micronsの位置に、切削面を後方に向けて慎重に配置します。ナイフの先端が軟膜に触れた時点で、Z軸をゼロに設定します。次に、プリズムプローブを挿入する深さまで徐々に下げます。続いて、プリズムの先端が入る経路を確保するため、ナイフを後方に1 mm移動させます。ステレオタキシスアームのマイクロマニピュレーターを用いて、10 µm/sの速度でゆっくりとナイフを後退させ、切開部位に滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームスポンジを置きます。続いて、レンズホルダーを、前ステップのナイフと同じ角度で脳定位固定装置のマニピュレーターアームに取り付けます。プリズムを、その平坦な面が切開部の直上にあり、かつウイルス注入カラムと平行になるように配置します。プリズムが適切な角度になったら、このプローブの場合、脳表面から最終的なZレベルの1.1 millimeterに達するまで、10 micronずつ段階的に脳内へ降ろします。25ゲージの針を用い、開頭部位のプリズム周囲の露出した組織を、極めて薄いエラストマー接着剤の保護層で覆います。レンズが開頭部内で動くのを防ぐため、エラストマー接着剤の硬化後、25ゲージの針でシアノアクリレート接着剤を塗布し、エラストマー接着剤の層を介してプリズムレンズのガラスを隣接する頭蓋骨に固定します。シアノアクリレート接着剤が硬化した後、レンズホルダーのネジを緩め、慎重に顕微鏡を取り除きます。次に、ステレオタキシスマニピュレーターアームをゆっくりと後退させ、プリズムプローブが確実に留置された状態にします。露出した頭蓋骨表面を覆うように、インプラントの周囲に歯科用アクリル樹脂またはシアノアクリレート系接着剤を塗布します。この際、周囲の後退させた筋肉組織に触れないようにしてください。このように頭蓋骨の広い範囲を頭蓋キャップで覆うことで、後のベースプレートの取り付けが容易になります。続いて、シリコーン接着剤シリンジの触媒剤と主剤を混合し、プリズムプローブのカフ内にエラストマーを1滴滴下してプローブレンズの上部を覆い、損傷やホコリの付着を防止します。プリズムプローブの植え込みから1週間から10日後、植え込んだプリズムプローブを介して組織内のウイルス発現を確認します。その際は、植え込んだプリズムプローブレンズ表面のシリコーン接着剤キャップを取り除いてください。プローブレンズの表面を点検し、イメージング面が清潔であることを確認するため、レンズペーパーと70% ethanolを用いて汚れを優しく拭き取ります。次に、顕微鏡にベースプレートを取り付け、ベースプレートのセットスクリューを締めて固定します。その後、立体定位マイクロマニピュレーターアームの顕微鏡グリッパーに顕微鏡をしっかりと固定します。グリッパーを、ステレオタキシス・マイクロマニピュレーターアームに取り付け可能なロッドに固定します。続いて、ステレオタキシス・マイクロマニピュレーターアームを用いて、プリズムプローブレンズの上に顕微鏡を配置します。動物ステージの側面および背面からプリズムレンズを観察し、向きを視覚的に確認してください。顕微鏡対物レンズとプリズムプローブの両方の光軸を合わせる必要があります。その後、収集ソフトウェアを起動し、プロジェクトを選択して、ソフトウェア経由で顕微鏡LEDを点灯させます。ステレオタキシスのマニピュレーターアームを動かし、収集ソフトウェア上で植え込まれたプリズムプローブレンズの上端の位相に焦点を合わせることで、顕微鏡のアライメント品質を評価します。適切に調整されると、プリズムプローブレンズの端が鮮明に見えます。定位固定操作アームを使用して、組織内の目的の焦点面を得るために、植え込まれたプリズムプローブ上の顕微鏡の物理的距離を調整してください。次に、歯科用アクリルまたはシアノアクリルを使用して、ベースプレートをアクリルキャップに永久的に固定し、隙間を埋めてください。ベースプレートを動物の頭部に接着する際、顕微鏡の本体やセットスクリューのどの部分にも接着剤を塗布しないことが極めて重要です。ここで、グリッパーから顕微鏡を離し、顕微鏡からグリッパーを後退させます。シアノアクリレートやその他の透明な接着剤を使用した場合は、ヘッドキャップへの外光の漏れを防ぐため、黒色のマニキュアまたは黒色の歯科用セメントの層で覆ってください。光漏れが発生すると、その後の実験で取得する画像にノイズが入る可能性があります。次に、ベースプレートカバーで埋め込み済みのプリズムプローブを保護します。この手順では、顕微鏡をコンピュータに接続されたデータ収集ボックスに接続し、収集ソフトウェアを起動します。その後、ベースプレートのセットネジを反時計回りに回してベースプレートカバーを持ち上げ、取り外します。ベースプレート上の動物に顕微鏡をセットします。ベースプレートにあるマグネットの働きにより、顕微鏡が定位置に固定されます。次に、わずかな抵抗を感じるまでベースプレートのセットスクリューを締め込みます。その後、データの取得に使用する設定を選択します。これには、データキャプチャ時のフレームレートが含まれます。設定を選択する際は、十分なSN比（信号対雑音比）が確保されているかを確認するために、画像のヒストグラムをチェックしてください。その後、データの取得を開始します。録画が完了したら、ベースプレートのセットスクリューを緩め、顕微鏡をゆっくりと上に引き上げてベースプレートから取り外します。その後、ベースプレートカバーを戻し、セットプレートのセットスクリューを静かに締めます。ここでは、顕微鏡を装着した動物が行動アリーナ内の物体と自由に相互作用している様子を示します。本システムを用いた覚醒状態での行動イメージングにおいて、マウスを3つの異なる環境に曝露させた際の体性感覚皮質ニューロンの活動を記録しました。1日目はオープンフィールド、2日から4日目は物体の慣らし、そして5日目は未知の物体への曝露を行いました。カルシウムイメージングデータ解析ソフトウェアを用いて細胞抽出を行った後、細胞の位置に対応する空間フィルタを、顕微鏡記録データの平均蛍光強度投影図上に重ね合わせました。白い破線が、第2層、第3層、および第5層の細胞を区切っています。各層から5つの細胞の対応するカルシウムトレースは、2つの異なる行動文脈（物体慣化および新規物体への曝露）における細胞の活動パターンを示しています。マウスが新規物体に曝露された日には、第2層および第3層の細胞は第5層の細胞と比較して、より高い活性を示しました。以下は、動物がオープンフィールド、物体慣らし、および新物体探索を行った際の、表層部のエンティティプレイヤーにおける細胞活動の残りのプロットです。習得すれば、適切に実施することで各手法を1時間以内に完了できます。この手法の開発により、システム神経科学の研究者が、ドローニングやその他の疾患の神経生理学モデルにおいて、さまざまな行動パラダイムを活用しながら、異なる脳領域の特定の細胞型を探索する道が開かれます。このプロトコルにより、体性感覚皮質の複数層のラベル付け、プリズムプローブの埋め込み、および頭部装着型小型顕微鏡の取り付け方法について十分に理解することができます。

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Research

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