多層皮質Ca

本手順の全体的な目的は、カルシウム指示薬を用いることで、自由行動下のマウスにおける皮質ニューロンの複数層にわたる神経活動を同時に可視化し、小型ヘッドマウント蛍光顕微鏡を用いて神経回路の機能を理解することです。この手法は、「皮質の複数層間で情報はどのように伝播するのか」という、システム神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、自由行動下の動物において、遺伝的にコードされた多数のニューロンを複数の皮質層にわたって、長期間にわたり安定して可視化できる点にあります。

自由行動下の動物において、複数の皮質層から遺伝的にコードされたニューロンを可視化するためには、以下の手順を行う必要があります。本プロトコルでは、プリズムプローブの植え込み、ベースプレートの設置、および自由行動下のマウスにおけるin vivoイメージングに焦点を当てます。まず、ウイルス注入の1〜2週間後、動物を定位固定装置にセットし、70% ethanolで消毒しレンズペーパーで清掃して、プリズムプローブ植え込み手術の準備をします。次に、0.5 mmのバーを備えたマイクロドリルを用いて、円形の開頭処置を行います。

開頭部の直径がプリズムの直径よりわずかに大きくなるようにしてください。次に、プリズムを皮質に挿入した際、その平坦な面がウイルス注入部位に向き、かつ半径150〜200 µm以内に位置するように開頭位置を調整します。その後、微細鑷子を用いて硬膜を除去します。

脳組織が露出した後は、常に滅菌生理食塩水で組織を湿らせておいてください。これにより、組織への圧力が維持されます。プリズムプローブの挿入時に脳組織への圧力を軽減するため、脳定位固定装置の電極ホルダーアームに直線的な解剖ナイフを取り付け、挿入経路を作成します。

ナイフプレートが頭蓋骨の曲率に対して垂直になり、かつウイルス注入カラムと平行な平面になるように、角度をつけて固定します。ナイフを、開頭部位の内側縁に沿って、ウイルス注入部位から外側に約200 micronsの位置に、切削面を後方に向けて慎重に配置します。ナイフの先端が軟膜に触れた時点で、Z軸をゼロに設定します。

次に、プリズムプローブを挿入する深さまで徐々に下げます。続いて、プリズムの先端が入る経路を確保するため、ナイフを後方に1 mm移動させます。ステレオタキシスアームのマイクロマニピュレーターを用いて、10 µm/sの速度でゆっくりとナイフを後退させ、切開部位に滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームスポンジを置きます。

続いて、レンズホルダーを、前ステップのナイフと同じ角度で脳定位固定装置のマニピュレーターアームに取り付けます。プリズムを、その平坦な面が切開部の直上にあり、かつウイルス注入カラムと平行になるように配置します。プリズムが適切な角度になったら、このプローブの場合、脳表面から最終的なZレベルの1.1 millimeterに達するまで、10 micronずつ段階的に脳内へ降ろします。

25ゲージの針を用い、開頭部位のプリズム周囲の露出した組織を、極めて薄いエラストマー接着剤の保護層で覆います。レンズが開頭部内で動くのを防ぐため、エラストマー接着剤の硬化後、25ゲージの針でシアノアクリレート接着剤を塗布し、エラストマー接着剤の層を介してプリズムレンズのガラスを隣接する頭蓋骨に固定します。シアノアクリレート接着剤が硬化した後、レンズホルダーのネジを緩め、慎重に顕微鏡を取り除きます。

次に、ステレオタキシスマニピュレーターアームをゆっくりと後退させ、プリズムプローブが確実に留置された状態にします。露出した頭蓋骨表面を覆うように、インプラントの周囲に歯科用アクリル樹脂またはシアノアクリレート系接着剤を塗布します。この際、周囲の後退させた筋肉組織に触れないようにしてください。このように頭蓋骨の広い範囲を頭蓋キャップで覆うことで、後のベースプレートの取り付けが容易になります。

続いて、シリコーン接着剤シリンジの触媒剤と主剤を混合し、プリズムプローブのカフ内にエラストマーを1滴滴下してプローブレンズの上部を覆い、損傷やホコリの付着を防止します。プリズムプローブの植え込みから1週間から10日後、植え込んだプリズムプローブを介して組織内のウイルス発現を確認します。その際は、植え込んだプリズムプローブレンズ表面のシリコーン接着剤キャップを取り除いてください。

プローブレンズの表面を点検し、イメージング面が清潔であることを確認するため、レンズペーパーと70% ethanolを用いて汚れを優しく拭き取ります。次に、顕微鏡にベースプレートを取り付け、ベースプレートのセットスクリューを締めて固定します。その後、立体定位マイクロマニピュレーターアームの顕微鏡グリッパーに顕微鏡をしっかりと固定します。

グリッパーを、ステレオタキシス・マイクロマニピュレーターアームに取り付け可能なロッドに固定します。続いて、ステレオタキシス・マイクロマニピュレーターアームを用いて、プリズムプローブレンズの上に顕微鏡を配置します。動物ステージの側面および背面からプリズムレンズを観察し、向きを視覚的に確認してください。

顕微鏡対物レンズとプリズムプローブの両方の光軸を合わせる必要があります。その後、収集ソフトウェアを起動し、プロジェクトを選択して、ソフトウェア経由で顕微鏡LEDを点灯させます。ステレオタキシスのマニピュレーターアームを動かし、収集ソフトウェア上で植え込まれたプリズムプローブレンズの上端の位相に焦点を合わせることで、顕微鏡のアライメント品質を評価します。

適切に調整されると、プリズムプローブレンズの端が鮮明に見えます。定位固定操作アームを使用して、組織内の目的の焦点面を得るために、植え込まれたプリズムプローブ上の顕微鏡の物理的距離を調整してください。次に、歯科用アクリルまたはシアノアクリルを使用して、ベースプレートをアクリルキャップに永久的に固定し、隙間を埋めてください。

ベースプレートを動物の頭部に接着する際、顕微鏡の本体やセットスクリューのどの部分にも接着剤を塗布しないことが極めて重要です。ここで、グリッパーから顕微鏡を離し、顕微鏡からグリッパーを後退させます。シアノアクリレートやその他の透明な接着剤を使用した場合は、ヘッドキャップへの外光の漏れを防ぐため、黒色のマニキュアまたは黒色の歯科用セメントの層で覆ってください。光漏れが発生すると、その後の実験で取得する画像にノイズが入る可能性があります。

次に、ベースプレートカバーで埋め込み済みのプリズムプローブを保護します。この手順では、顕微鏡をコンピュータに接続されたデータ収集ボックスに接続し、収集ソフトウェアを起動します。その後、ベースプレートのセットネジを反時計回りに回してベースプレートカバーを持ち上げ、取り外します。

ベースプレート上の動物に顕微鏡をセットします。ベースプレートにあるマグネットの働きにより、顕微鏡が定位置に固定されます。次に、わずかな抵抗を感じるまでベースプレートのセットスクリューを締め込みます。

その後、データの取得に使用する設定を選択します。これには、データキャプチャ時のフレームレートが含まれます。設定を選択する際は、十分なSN比（信号対雑音比）が確保されているかを確認するために、画像のヒストグラムをチェックしてください。その後、データの取得を開始します。

録画が完了したら、ベースプレートのセットスクリューを緩め、顕微鏡をゆっくりと上に引き上げてベースプレートから取り外します。その後、ベースプレートカバーを戻し、セットプレートのセットスクリューを静かに締めます。ここでは、顕微鏡を装着した動物が行動アリーナ内の物体と自由に相互作用している様子を示します。

本システムを用いた覚醒状態での行動イメージングにおいて、マウスを3つの異なる環境に曝露させた際の体性感覚皮質ニューロンの活動を記録しました。1日目はオープンフィールド、2日から4日目は物体の慣らし、そして5日目は未知の物体への曝露を行いました。カルシウムイメージングデータ解析ソフトウェアを用いて細胞抽出を行った後、細胞の位置に対応する空間フィルタを、顕微鏡記録データの平均蛍光強度投影図上に重ね合わせました。

白い破線が、第2層、第3層、および第5層の細胞を区切っています。各層から5つの細胞の対応するカルシウムトレースは、2つの異なる行動文脈（物体慣化および新規物体への曝露）における細胞の活動パターンを示しています。マウスが新規物体に曝露された日には、第2層および第3層の細胞は第5層の細胞と比較して、より高い活性を示しました。

以下は、動物がオープンフィールド、物体慣らし、および新物体探索を行った際の、表層部のエンティティプレイヤーにおける細胞活動の残りのプロットです。習得すれば、適切に実施することで各手法を1時間以内に完了できます。この手法の開発により、システム神経科学の研究者が、ドローニングやその他の疾患の神経生理学モデルにおいて、さまざまな行動パラダイムを活用しながら、異なる脳領域の特定の細胞型を探索する道が開かれます。

このプロトコルにより、体性感覚皮質の複数層のラベル付け、プリズムプローブの埋め込み、および頭部装着型小型顕微鏡の取り付け方法について十分に理解することができます。