多層皮質Ca 2+プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング
June 13th, 2017
ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。
この手順の全体的な目標は、自由に行動するマウスのカルシウムインジケーターを使用して、皮質ニューロンの複数の層にわたるニューロン活動の同時視覚化を可能にし、小型のヘッドマウント蛍光顕微鏡を使用して神経回路の機能を理解することです。この方法は、皮質の複数の層にわたる情報伝播因子がどのように行われるかなど、システム神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、自由に行動する動物の複数の皮質層にわたる遺伝的にコードされたニューロンの大規模な集団を、時間の経過とともに確実に視覚化できることです。
自由に行動する動物の複数の皮質層から遺伝的にコードされたニューロンを視覚化するためには、以下の手順を実行する必要があり、このプロトコルは、自由に行動するマウスにおけるプリズムプローブの埋め込み、ベースプレートの取り付け、およびin vivoイメージングを強調しています。この手順を開始するには、ウイルス注射後1〜2週間で、動物を定位固定装置に入れ、70%エタノールで消毒し、レンズペーパーで洗浄することにより、プリズムプローブインプラント手術の準備をします。次に、0.5ミリメートルのバリが付いたマイクロドリルを使用して、円形開頭術を開きます。
開頭術の直径がプリズムの直径よりもちょうど大きいことを確認してください。次に、プリズムを皮質に挿入したときに、その平らなエッジがウイルス注入部位に面し、半径150〜200ミクロン以内になるように開頭術を配置します。その後、細い鉗子で硬膜を切除します。
脳組織が露出したら、常に滅菌生理食塩水で組織を湿らせてください。これにより、組織への圧力も維持されます。プリズムプローブ挿入時の脳組織への圧力を軽減するために、脳定位固定装置の電極ホルダーアームに直角解剖ナイフを取り付けて挿入管を作成します。
ナイフプレートが頭蓋骨の湾曲に対して垂直で、ウイルス注入カラムに平行な平面になるように、斜めに取り付けます。ナイフを開頭術の上、内側のメディアエッジに沿って、刃先を後ろに向けてウイルス注入部位の外側に約200ミクロン慎重に配置します。ナイフの先端がピアに触れたときにZ軸をゼロにします。
次に、プリズムプローブが挿入される深さまで徐々に下げます。その後、ナイフを1mm後方に動かして、プリズムの前縁の経路を作成します。定位固定装置アームマイクロマニピュレーターを使用してナイフを毎秒10ミクロン刻みでゆっくりと引っ込め、滅菌生理食塩水を染み込ませたジェルフォームスポンジを切開部の上に置きます。
その後、レンズホルダーを脳定位固定装置のアームに、前の手順のナイフと同じ角度で取り付けます。プリズムの平らな面が切開部より上にあり、ウイルス注入カラムと平行になるようにプリズムを位置合わせします。プリズムが正しい角度になったら、このプローブについて、プリズムを脳の表面から1.1ミリメートルの最終的なZレベルまで10ミクロン刻みで脳内に徐々に下げます。
開頭術のプリズムの周りの露出した組織を、25ゲージの針を使用して、非常に薄い保護レベルのエラストマー接着剤で覆います。レンズが開頭術内を移動するのを防ぐために、エラストマー接着剤が硬化した後、25ゲージの針を使用してシアノアクリレート接着剤を塗布し、プリズムレンズのガラスをエラストマー接着剤の層上の隣接する頭蓋骨に取り付けます。シアノアクリレート接着剤が硬化したら、レンズホルダーのネジを緩め、顕微鏡を慎重に取り外します。
次に、定位固定装置マニピュレーターアームをゆっくりと引っ込めて、プリズムプローブをしっかりと埋め込みます。インプラントの周囲に歯科用アクリルまたはシアノアクリレート接着剤の層を塗布して、周囲の収縮した筋肉組織に触れることなく露出した頭蓋骨表面を覆います。この頭蓋キャップで頭蓋骨の広い領域を覆うことは、後でベースプレートの取り付けに役立ちます。
その後、シリコーン接着剤シリンジから触媒エンドベースを混合し、エラストマーをプリズムプローブカフ内に一滴入れてプローブレンズの上部を覆い、損傷やほこりが沈殿するのを防ぎます。プリズムプローブを埋め込んでから1週間から10日後に、埋め込んだプリズムプローブを通じて組織内でウイルスが発現しているかどうかを確認します。このためには、埋め込まれたプリズムプローブレンズの表面を覆っているシリコン接着剤キャップを取り外します。
プローブのレンズ表面を調べ、レンズペーパーと70%エタノールで破片をやさしく取り除き、イメージング表面がきれいであることを確認します。次に、ベースプレートを顕微鏡に取り付け、ベースプレートの止めネジを固定して所定の位置に保持します。次に、顕微鏡を脳定位固定装置マイクロマニピュレーターアームの顕微鏡グリッパーに固定します。
グリッパーを固定装置用マイクロマニピュレーターアームに取り付け可能なロッドに取り付けます。次に、定位固定装置マイクロマニピュレーターアームを使用して、顕微鏡をプリズムプローブレンズの上に置きます。動物ステージの側面と背面からプリズムレンズを見て、向きを目視で確認します。
顕微鏡対物レンズとプリズムプローブの両方の光軸を位置合わせする必要があります。その後、取得ソフトウェアを起動し、プロジェクトを選択して、ソフトウェアを介して顕微鏡のLEDをオンにします。顕微鏡のアライメントの品質を評価するには、アクイジションソフトウェアで埋め込みプリズムプローブレンズの最上面に焦点を当て、ステレオタックスのマニピュレーターアームを動かします。
適切に位置合わせされると、プリズムプローブレンズのエッジがシャープに見えるはずです。定位固定装置アームを使用して、埋め込まれたプリズムプローブより上の顕微鏡の物理的距離を調整し、組織内の目的の焦点面を取得します。次に、歯科用アクリルまたはシアノアクリルを使用して、ベースプレートをアクリルキャップに恒久的に取り付け、ギャップを埋めます。
顕微鏡の本体や止めネジのどの部分にも接着剤を塗布しないことが重要です。また、ベースプレートを動物の頭部に接着する際には、接着剤を塗布しないことが重要です。次に、顕微鏡をグリッパーから外し、グリッパーを顕微鏡から引っ込めます。シアノアクリル絵の具などの透明接着剤を使用した場合は、実験中に取得した将来の画像を汚染する可能性のあるヘッドキャップへの周囲光の漏れを防ぐために、黒のマニキュアまたは黒の歯科用セメントの層で覆います。
次に、埋め込まれたプリズムプローブをベースプレートカバーで保護します。この手順では、顕微鏡をコンピューターに接続されているデータ収集ボックスに接続し、取得ソフトウェアを起動します。次に、ベースプレートの止めネジを反時計回りに回してベースプレートカバーを持ち上げて、ベースプレートカバーを取り外します。
動物のベースプレートに顕微鏡を播種します。顕微鏡は、ベースプレート上の磁石の助けを借りて所定の位置にカチッとはまります。次に、わずかな抵抗が感じられるまでベースプレートの止めネジを進めます。
その後、データの収集に使用する取得設定(データキャプチャのフレームレートを含む)を選択します。設定を選択するときは、画像のヒストグラムをチェックして、良好な信号対雑音比を確認してください。次に、データの集録を開始します。
記録が完了したら、ベースプレートの止めネジを緩め、顕微鏡をそっと引き上げて、顕微鏡をベースプレートから取り外します。その後、ベースプレートカバーを元に戻し、ベースプレートの止めネジをそっと締めます。これは、顕微鏡に取り付けられた動物が、行動領域内のオブジェクトと自由に相互作用するデモンストレーションです。
覚醒状態でのイメージング中、マウスを3つの異なる環境に曝露したとき、体性感覚皮質ニューロンの活動が記録されました。1日目はオープンフィールド、2日目から4日目はオブジェクトの習熟、5日目は新しいオブジェクトです。カルシウム画像データ解析ソフトウェアを用いて細胞を抽出した後、顕微鏡記録データの平均蛍光強度投影に、細胞位置に対応した空間フィルターを重ね合わせました。
白い破線は、レイヤー 2、3、および 5 つのセルを区切ります。各層の5つの細胞からの対応するカルシウムの痕跡は、物体の習熟と新規物体の曝露という2つの異なる行動状況における細胞の農業パターンを示しています。レイヤー2、3の細胞は、マウスが新しい物体に曝露された日に、レイヤー5の細胞と比較してより活性が高かった。
これは、動物がオープンフィールドにいたとき、物体の習熟、および新しい物体の探索における表面的なエンティティプレーヤーからの細胞活動の残りのプロットです。一度習得すると、各テクニックは適切に実行すれば1時間以内に完了することができます。その開発後、この技術は、システム神経科学の研究者が、ドローニングにおけるさまざまな行動パラダイムや疾患における神経生理学の他のモデルを活用しながら、さまざまな脳領域で特定の細胞タイプを探索する道を開きます。
このプロトコルから、体性感覚皮質の複数の層を標識する方法、プリズムプローブを埋め込む方法、およびヘッドマウント小型顕微鏡を取り付ける方法について十分に理解する必要があります。
概要
この記事では、自由に動くマウスの複数の皮質層全体で細胞分解能を持つ大規模なCa2+イメージングの手順を紹介します。この方法により、頭部に取り付けられた小型の顕微鏡と埋め込まれたプリズムプローブを組み合わせて、数百の活動細胞を同時に観察することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- イメージング技術
- 神経回路の機能
背景
- 皮質層全体での神経活動を理解することは、システム神経科学にとって重要です。
- カルシウム指標は、自由に行動する動物の神経活動を視覚化するために使用されます。
- この技術は、皮質における情報伝播の研究を可能にします。
- 小型化されたイメージングツールは、多数のニューロンをモニタリングする能力を向上させます。
研究の目的
- 自由に行動するマウスの複数の皮質層全体での神経活動を視覚化する。
- 高度なイメージング技術を用いて神経回路の機能を理解する。
- 遺伝的にエンコードされたニューロンの長期観察のための信頼性の高い方法を提供する。
使用された方法
- プリズムプローブの埋め込みとベースプレートの取り付け。
- 自由に行動するマウスの神経活動の生体内イメージング。
- 精密な外科手術のためのステレオタキシック装置の使用。
- 埋め込まれたプリズムプローブを通じたウイルス発現の評価。
主要な結果
- 皮質層全体での多数のニューロンの成功した視覚化。
- 時間の経過における方法の信頼性の実証。
- 神経回路機能のダイナミクスに関する洞察の提供。
- システム神経科学の将来の研究のためのプロトコルを確立。
結論
- この技術は、自由に動くマウスの神経活動の包括的な分析を可能にします。
- 皮質情報処理の理解における新しい研究の道を開きます。
- この方法は、システム神経科学の分野を大きく前進させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This technique enables longitudinal, cellular-resolution imaging of neuronal activity across cortical layers in freely behaving animals, addressing a critical gap in systems neuroscience for studying neural circuit dynamics under naturalistic conditions. By overcoming the behavioral constraints of head-fixed preparations, it supports target validation and mechanistic de-risking in neuropsychiatric drug discovery where circuit-level phenotypes are increasingly prioritized. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular activity patterns to complex behaviors, thereby improving translational relevance for CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by monitoring cell-type-specific activity across cortical layers during behaviorally relevant tasks.
- Operational Value: Provides reproducible, longitudinal readouts of neural circuit engagement to support target de-risking and phenotypic screening campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved calcium dynamics readouts that can serve as functional biomarkers for compound effects on cortical processing.
- Operational Value: Establishes a standardized platform for assay readiness, enabling scalable screening of pharmacological agents across multiple cortical layers and behavioral paradigms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by capturing layer-specific neuronal dynamics during novel object exploration, a proxy for cognitive and sensory processing domains.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by allowing repeated imaging sessions over days to assess chronic drug effects or genetic manipulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights into cortical information processing that inform go/no-go decisions in CNS drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous visualization of hundreds of neurons across layers during behavior.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high signal-to-noise ratio, facilitating reliable compound evaluation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Enables extraction of spatial filters and calcium traces for comparative analysis of neuronal activity patterns across behavioral contexts and experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker development by linking cellular activity patterns to ethologically relevant behaviors, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for chronic imaging across studies, reducing redundant surgical preparation and enhancing cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cortical circuit function and enabling cell-type-specific interrogation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through chronic implant design and magnetic baseplate system for consistent daily imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing circuit-level phenotypic data that reduces late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in behaving animals, improving capital efficiency in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, viral vector handling, and in vivo microscopy for successful probe implantation and imaging.
- Depends on miniaturized fluorescence microscopy systems, stereotaxic manipulators, and acquisition software for optical alignment and data collection.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, imaging, and behavioral science groups to ensure reproducible preparation and handling.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, animal species, and behavioral paradigms beyond somatosensory cortex and object exploration.
- Includes practical limitations such as surgical recovery time, potential tissue response to chronic implants, and the need for daily calibration to maintain imaging quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Prism Probe Implant Surgery
9:52
Conclusion
8:33
Results: Calcium Dynamics from Superficial and Deep Layers of Somatosensory Cortex of a Representative Mouse Imaged with the Microscope
4:52
Baseplate Attachment for Miniature Microscope Installation
7:22
Imaging Multiple Cortical Layers in a Freely Moving Mouse
