Name: 昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ昆虫細胞を用いた組換えmCD1dタンパク質の製造法。バキュロウイルス感染によりHigh Five細胞でマウスCD1dタンパク質を効率的に産生し、NKT細胞認識に必要なmCD1dテトラマーを生成する手法を解説します。

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I.は、セルを融解 TN5細胞の凍結バイアルを取る、そして37℃の水浴中で解凍します。 25センチメートル2 TCフラスコ内の昆虫エクスプレス培地（Invitrogen、カタログ番号- 10486）5mlを追加します。エクスプレス5人がグルタミンなしで来ることに注意してください。100Xグルタミンペンの連鎖球菌または1 LTのメディアに単独でグルタミン10mlのを追加する必要があります。それにTN5細胞を追加し、27℃インキュベーターで30分間インキュベートする。その後、フラスコの底に付着した細胞を乱すことなく静かにDMSOと培地を吸引除去する。新鮮培地5mlを追加します。 II。細胞の成長と拡大毎日のセルを監視する。フラスコを約70％コンフルエントになると、両側にフラスコを叩いにより懸濁液中の細胞をもたらすと昆虫エクスプレス培地と細胞培養5mlの21 mlを加え175センチメートル2フラスコに細胞を移す。各T175フラスコは、最終的なボリュームとして25〜30ミリリットル培地で入力してください。コンフルエントフラスコを（約1万/ミリリットル濃）1 / 4、1 / 5必要に応じて分割する。細胞の生い茂るをさせてください。セルを分割している通路の数を数えます。それは細胞溶解を生じる細胞の老化を引き起こす可能性があるため、継代数30の上に成長しない。あなたは100万/ mlの濃度で目的のボリュームに達すると、細胞に感染。 私は一般的に通常seventy 175センチメートル2フラスコと約にのぼる2〜2.5リットル、最大成長する。 25 / 30ミリリットルフラスコ、または5つの1リットルの三角フラスコと約へ。各フラスコに400ミリリットルに500ミリリットル 注：どちらのT - 175プラグシールフラスコまたはコーニング三角フラスコで細胞を成長させることができる。三角フラスコで増殖する細胞は、速くて簡単です。 III。エンドポイント希釈法によるウイルスの力価測定<ol><li>エクスプレスfive SFM培地の200ulで平底96ウェルプレートにウェル当たりプレート3000から5000までの細胞。細胞は27℃で少なくとも30分間静しましょう​​。 </li><li>バキュロウイルスストックの連続希釈を行う。一つは、ウェル当たり250ulを使用して、96ウェルU底プレートの1行に1 / 10に希釈を行う必要があります。希釈液は、エクスプレスファイブSFM培地で作られています。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、細胞に様々な希釈の一定量（通常は20μlのを）転送する。 </li><li> 27 7日間° Cで培養。エッジの行からの蒸発を避けるために、パラフィルムでプレートの端を包む。 </li><li> 7日後、プレートをチェックし、ウイルスのどの希釈は50％の感染を与える決定する - このウイルスの濃度の半分の井戸が感染している）。その後pfu / mlの（PFU -プラーク形成単位）で表現される力価を、計算には次の式を使用してください。式は、ほとんどのバキュロウイルスのマニュアルに含まれています。 </li></ol> IV。細胞に感染それは、ウイルスの正確な力価を知ることが非常に重要です。ウイルスの必要な量を追加。ウイルスストックの調製のために細胞は、ウイルスの変異の生産に1（ファイブ細胞を1Highする1pfu）高MOIリード以上ではないの感染多重度（MOI）で感染されるべきである。タンパク質生産のため、通常の量はMO1 50から10までです。 例： mCD1dバキュロウイルスの力価= 1X108 pfu / mlの追加MOI = 1（ウイルスを増幅する）= 20X10 ^ 6細胞/フラスコ/ 1X10 ^ 8 pfu / mlの= 200 UL /フラスコ MOI = 5〜10（タンパク質の生産のための）20x10の場合= 1ミリリットルに2ミリリットル^ 6細胞/フラスコ感染後4日目に、感染細胞を見てください。彼らは、切り離されたフローティング、腫れや成形ソーセージでなければなりません。 上清を回復V. 感染フラスコから培地を取る、と250ミリリットル青色キャップファルコンスピニングボトルに移す。彼らはオートクレーブして再利用することができます。 200rpm、20分間、4℃で均一にボトルを記入し、ソーバルGSAローターで細胞を遠心分離上清を収集し、さらに精製するために進んでください。 VI。組換えmCD1dの精製<ol><li> 150mmのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で透析し、濃度</li><li> Ni - NTAアガロースクロマトグラフィーにより、150​​mmのナトリウムリン酸200 mMのImmidazoleと+ B2MをmCD1dタンパク質を溶出させる</li><li> Immidazoleを取り除くために20mMのトリスHCl PH8緩衝液を用いて脱塩カラムを実行します。 </li><li>残りの汚染物質を除去するためにMonoQカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを実行します。 </li><li> YM 30コンセントレータ（Millipore）を用いて1mg/mlに集中する </li><li>製造業者のプロトコル（アビディティ）によるとmCD1dのBirAを酵素biotynlation </li><li>遊離ビオチンは、生理食塩水（PBS）、pH7.4の緩衝化リン酸を用いてS200カラム（サイズ排除Chromatograpy）によって除去される。 biotynlated蛋白質の2〜3 MGSの平均は、上清2リットルから得ることができた</li><li> - GalCerをCD1d四量体の製造。 </li></ol> 、- GalCerをして​​水溶性biotynlated CD1d - B2をCD1d分子をロードするためにmは、PBS中の0.5％ツイーン-20、O.9％塩化ナトリウムに溶解- GalCerを三倍モル過剰、室温で一晩インキュベートする。ストレプトアビジンと室温で4時間インキュベート - 四量体はPEの4倍モル過剰の- GalCerをロードしたCD1dモノマーを混合することにより生成されます。 48℃で保存する

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

この手順では、それは、開始の成長、昆虫細胞に感染し、これらの細胞を用いてバキュロウイルスの力価方法をする方法を示されています。この手順の最も重要な側面は、細胞の維持であり、バキュロウイルスの正確な力価を知ることができます。一度CD1四量体を生成して、それらが糖脂質反応性T細胞の解析のための強力なツールとして使用することができます。バキュロウイルスシステムは、この手順では、はるかに広い適用性を持つように、MHCクラスIIテトラマーを含む組換えタンパク質を生成するために広く使用されています。

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>無血清培地</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>昆虫細胞</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>抗生物質</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC Flask</td><td>プラスチック</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC Flask</td><td>プラグシールフラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask</td><td>細胞培養フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Concenterator</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC装置</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA酵素およびバッファー</td><td>ビオチン化キット</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAアガロースカラム</td><td>Hisタグタンパク質精製カラム</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>タンパク質からの塩の除去用</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQカラム</td><td>陰イオン交換クロマトグラフィー</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200カラム</td><td>サイズ排除クロマトグラフィー</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>糖脂質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-Streptavidin</td><td>タンパク質接合用</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

昆虫細胞における組換えmcd1dタンパク質の製造方法。

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1タンパク質は、抗原提示分子の第3のクラスを構成する。彼らは、非共有結合β2-ミクログロブリンに関連付けられている約50 - kDaのグリコシル化重鎖として表現さ​​れる細胞表面の糖タンパク質です。彼らは脂質ではなく、ペプチドを結合する。それらの構造がMHCクラスIとクラスIIの抗原提示分子にCD1タンパク質の類似性を確認するものの、mCD1d溝は相対的に、狭く深く、そして非常に疎水性であり、それは古典的で説明したいくつかの浅いポケットの代わりに二つの結合ポケットを有するMHC -エンコードされた抗原提示分子。それらのアミノ酸配列に基づいて、そのようなhydrobphobic溝は脂質抗原の結合のための理想的な環境を提供します。 ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、CD1dによってバインドされるか提示糖脂質を認識するために彼らのTCRを使用してください。 CD1から提示された脂質に反応性T細胞は自己免疫と感染症予防にと腫瘍拒絶に関与してきた。したがって、識別、浄化とcd1 -反応性NKT細胞の応答を追跡する機能は非常に重要です。 CD1dによるアルファガラクトシルセラミド（α- GalCerを）の四量体の生成は、NKT細胞の生物学の重要な洞察を持っています。他のCD1分子から構成された四量体も生成されており、これらの新しい試薬を大幅に脂質反応性T細胞の機能の知識を拡大し、脂質ベースのワクチンに対する応答を監視することで、自己免疫疾患やその他の診断に利用できる可能性を治療法。

昆虫細胞を調製し、mCD1d四量体を生成する組換えmCD1d proteinandの生産を目的とバキュロウイルスとそれらを感染させる方法。

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

CD1タンパク質は、第3のクラスの抗原提示分子を構成している。これらは細胞表面糖タンパク質であり、約50-kDaの糖鎖付加された状態で発現している...

こんにちは、La Jolla Institute for Allergy and Immunologyの発生免疫学部、Mitch Kronenberg博士の研究室のAshra Coronaです。今日は、MA CD 1D tetramerを作製するために、High Five昆虫細胞を調製し、それにVIRを感染させる方法について説明します。CD 1D tetramerは、当研究室や他の研究室でNKT細胞の認識に使用されています。VIRシステムは、MS Cクラス2 TEトレモアを含む組換えタンパク質の作製に広く利用されています。したがって、これから示す手順は非常に幅広い適用性を備えています。本手順には、High Five昆虫細胞の誘導および増殖、CD1D cDNAを搭載したレオウイルスの細胞への感染、感染から4日後の遠心分離による上清の回収、150 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）中でのタンパク質濃度の溶解、Ni-NTAアガロースおよびイオン交換クロマトグラフィー法によるマウスCD1Dタンパク質の精製、YM-30コンセントレーターを用いたマウスCD1Dタンパク質の1 mg/mLへの濃縮、Avid-DプロトコルによるマウスCD1Dの酵素的バイオチニル化、およびS-200カラムによる遊離ビオチンの除去が含まれます。最後に、alpha gel CD 1D Tetの作製について説明します。全工程にはこれらすべてのステップが含まれますが、本日はCD 1D tremorsをより多く生成することを目的として、これらの細胞の取り扱い方法およびウイルス感染の方法のみを実演します。それでは始めましょう。まず最初に、TN5昆虫細胞について説明します。High Five細胞株は、モンシロチョウ（cabbage looper）の卵巣細胞に由来しています。このプロトコルでこれらの細胞を使用するのは、無血清培地で増殖し、浮遊培養に適応しており、25 cm²の組織培養Tフラスコ内で5 mLのInsect Express培地を用いて高レベルの組換えタンパク質を産生するためです。なお、Express Five培地にはグルタミンが含まれていません。したがって、1Lの培地に100倍濃度のグルタミンのペン・ストリップ（pen strip）、またはグルタミンのみを10 ml添加する必要があります。次に、凍結保存されたHigh Five昆虫細胞のバイアルを取り出し、37 °Cのウォーターバスで解凍した後、直ちにHigh Five昆虫細胞をフラスコに加えます。その後、27 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。次に、フラスコの底に付着している細胞を乱さないように注意しながら、DMSOを含む培地を穏やかに吸引して除去します。解凍後、フラスコに5 mlの新鮮な培地を加えます。次に、ウイルス

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生物学

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。...

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Kindlinsは、インテグリンを介して細胞間接着の基本であるが、それらの研究では、細菌宿主において組換えそれらを発現で遭遇する困難によって妨げられてきた。ここでは、バキュロウイルス感染昆虫細胞での効率的な生産のための方法を記載している。...

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。...

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Nonlytic昆虫細胞発現系は、生産、細胞輸送/ローカリゼーション、および組換えタンパク質機能解析のために十分に活用されています。ここでは、市販の鱗翅目の細胞株で発現ベクターおよびそれに続く一過性のタンパク質発現を生成する方法について説明します。細胞内蛍光マーカータンパク質とタバココナジラミのアクアポリンの共局在も提示されています。...

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV...

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

このプロトコルを記述する外国蛋白質を表現するまたは潜在的な外国蛋白質とその切り捨てられたのアミノ酸の抗アポトーシス活性を評価に使用することができます熱衝撃によるタンパク質発現システム (pDHsp/V5-彼/sf9...

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT...

殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン...

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生化学的、生物物理学的、および構造研究に使用されるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼ(PRMT)の発現スクリーニングおよび生産のための堅牢なプラットフォームです。物質のミリグラム量は、真核生物発現プラットフォームを必要とする関心のあるPRMTおよび他のタンパク質の大部分のために製造することができる。...

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

学ぶ昆虫細胞を用いた組換えmCD1dタンパク質の製造法。バキュロウイルス感染によりHigh Five細胞でマウスCD1dタンパク質を効率的に産生し、NKT細胞認識に必要なmCD1dテトラマーを生成する手法を解説します。

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

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