全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法

本手順の全体的な目的は、単一の光受容細胞からホールセル電位固定記録を行い、単一光子吸収による光誘起電流および強光に対する反復応答を測定することです。この手法は、光転換の基礎となる物理的およびイオン的メカニズム、およびTRPチャネルの特性など、感覚伝達分野の重要な課題を解決するのに役立ちます。この技術を用いる利点として、膜電位を完全に制御でき、信号対雑音比が極めて高く、また光学測定のための特異的な指標を導入できることが挙げられます。

一般的に、この方法に不慣れな方は、作製物の極小サイズや、代謝上の脆弱性から解剖を迅速に行う必要がある点に苦労するでしょう。本手順では、1バイアルあたり約20匹の密度でハエを飼育してください。実験時には、蛹化がほぼ完了し、少なくとも24時間以上完全な暗所に置かれていた蛹を含むバイアルを数本用意してください。

成虫を回収する2時間前に、すでに羽化した成虫を取り除きます。暗順応させたハエを組織内で扱う際は、常に赤色光の下で操作してください。羽化したばかりのハエを待つ間に、記録チャンバーを準備します。

溶かしたパラフィンまたは高真空シリコングリースを使用してカバーガラスをチャンバーの底に固定し、バスを完成させます。次に、バスを倒立顕微鏡のステージに設置します。バスの中に、灌流システムのチューブ、吸引システムのチューブ、および電気生理学セットアップ用の接地線を配置します。

解剖を始める前に、60 mmのペトリ皿の裏側にいくつかの溶液を準備します。カルシウムフリーESを4滴、TSを1滴、それぞれ離して滴下します。次に、粗いピンセットを用いて、羽化したばかりのハエの翅または体をつかみます。その後、精細ピンセットを用いて頭部を切り離し、速やかにカルシウムフリーESの1滴目に移します。実体顕微鏡下で、もう1本の精細ピンセットを使用し、正中面（矢状面）に沿って頭部を半分に解剖します。

両眼とも損傷がないことを確認します。次に、頭部の半分を2番目のカルシウムフリーES液滴に、もう半分を3番目のカルシウムフリーES液滴に転移させます。その後、2つの眼のうち一方の解剖に進みます。

精密ピンセットを用いて、網膜に損傷を与えないよう、眼周囲の組織を可能な限り除去します。次に、精密ピンセットで角膜の端をしっかりと掴み、網膜を掻き出します。これにより、損傷のない角膜と網膜がそれぞれ分離した状態で得られます。

ピペットはエタノールに保存されているため、新しいトリチュレーションピペットを使用する場合は、必ず最初に水で洗浄してください。次に、洗浄したピペットに、4滴目以降のカルシウムフリーESを少量満たします。その後、口で緩やかに吸引し、単離した網膜をピペット内に吸い込みます。

気泡が混入しないよう細心の注意を払ってください。次に、網膜をTS液の滴の中に置きます。続いて、もう一方の眼でも同様に網膜の分離を行い、両方の網膜がTS液の滴の中にある状態にします。その後、ペトリ皿からカルシウムフリーES液のみを慎重に拭き取り、皿の表面にさらに6滴のTS液を加えます。

両方の網膜を新しいTSの液滴に転移させます。次に、トリチュレーションピペットを口径の小さいものに交換します。ピペットを洗浄した後、TSを1滴満たします。このピペットを用いて、両方の網膜を急速かつ繰り返し吸引および排出することで、色素細胞から一部の個眼を分離させます。この操作に伴い、TSが白濁します。

次に、両方の網膜の残渣を別のTS液の滴に移します。続いて、単離された個眼を含む濁ったTS液の滴をピペットで吸い込みます。この溶液をバスチャンバー内に排出してください。網膜が完全に溶解するまで、より直径の小さいトリチュレーションピペットを用いてこの操作を繰り返します。

ここで、1分間待機します。この待機時間中に、単離した個眼がチャンバーの底に接着します。1分後、灌流システムを用いて 1.5 millimolar のカルシウムを含む ES の注入を開始してください。

チャンバーに液を満たす際、接地線と吸引チューブが浸っていることを確認してください。次へ進む前に、溶液を60〜90秒間流します。まず、40倍対物レンズを使用して、バス内の個眼を慎重に観察します。

個眼を形成する伸長した光受容細胞体が、軸索から切り離されているものの、生存していることに注目してください。次に、実験に適した個眼を選択します。以下の基準を満たしている場合に選択してください。

外膜は滑らかで完全である必要があります。長軸は、遠位側からアプローチする電極に対してほぼ直角である必要があります。また、個眼は過剰な組織に囲まれていない状態である必要があります。

個眼を選択したら、それを視野の中心に合わせます。次に、実験に適した細胞内液をピペットに満たします。そして、ピペットを電極ホルダーに固定します。

次に、ピペットのチューブに息を吹き込んで正圧を作り、チューブバルブを閉じて圧力を保持します。続いて、ピペットをバスチャンバーに挿入し、個眼の遠位部に近づけます。パッチしたピペットからの正圧により、膜に小さななくぼみ（ディンプル）が観察されるまで誘導します。ここで、記録ソフトウェアのメンブレンテストモジュールを開き、2 mVの連続矩形電圧パルスを100 Hzの頻度で印加します。

次に、パッチクランプアンプのコントロールを使用して、接合電位をゼロに設定し、矩形パルスのベースをゼロ電流にします。その後、バルブを開いてピペット内の圧力を開放し、緩やかに吸引して陰圧をかけます。これにより、ピペットが細胞膜に密着します。

これが完了したら、バルブを閉じて圧力を保持します。次に、電極の抵抗値を確認してください。抵抗値は100から150 megaohmsまで上昇しているはずです。

次に、バルブを再び開いてピペット内の陰圧を解除します。このとき、抵抗値が1〜2 GΩまで急上昇し、ピペットと細胞の間でギガシール（GΩシール）が形成されたことが示されます。続いて、パッチクランプアンプを用いて、ピペットの容量性電流をオフセットします。

ホールセル構成を作成するために、口による吸引で細胞膜を破裂させます。電極内に、短時間で強力な負圧を急速に繰り返しかけます。ホールセル構成が得られると、容量が急激に増加します。

次に、パッチクランプアンプを用いて、保持電位を必要な電圧に設定し、直列抵抗における容量電流をオフセットします。ここで、ファラデーケージの黒い遮光カーテンを閉め、実験を開始します。蛍光染料であるLucifer yellowを含むパッチピペットでホールセル構成を得ると、個眼を形成する光受容体の一つだけに染料が導入されていることが確認できます。

この光受容体は、個眼内の隣接する受容体からも電気的に隔離されます。野生型ショウジョウバエおよびInaCまたはInaD遺伝子に変異を持つショウジョウバエの個眼を用いたホールセル電位クランプ法において、持続的な弱光に対する応答として量子バンプが認められました。野生型と比較して、両変異体ではバンプの消失が緩やかであることが観察されました。

150,000 photons/sの強度で照射した500ミリ秒間の光パルスに対する標準化された応答により、生理学的変化が明確に示されています。本標本を用いることで、1ミリ秒の短時間弱光刺激に対する、ホールセル電位固定法によるクォンタムバンプ応答の測定さえ可能となりました。このような単一光子応答を、野生型、アレスチン変異体、およびninaC変異体のショウジョウバエで比較しました。

どちらの変異体においても、一連のバンプ（ bumps）を伴う応答が認められました。15,000 photons/secondで照射した500ミリ秒の光パルスに対する正規化応答を示します。したがって、マクロな応答の緩やかな終結は、arrestin-2およびninaC変異体において観察されます。

このビデオを視聴することで、ショウジョウバエの光受容細胞からホールセル記録を行う方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に実施することで1時間で完了させることができます。この技術は、TRPチャネルやイノシトール脂質シグナル伝達への理解を深めただけでなく、非画像形成的な光依存性活動に関与する哺乳類の固有光感受性網膜神経節細胞の役割を解明するための道を開きました。