Name: 全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法ショウジョウバエ感光体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶ全細胞電圧クランプ記録法を用いたショウジョウバエ感光体の電気生理学的解析。光誘導電流測定と光伝達機構の研究に活用でき、膜電位制御と高いS/N比を実現する。

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この研究の実験部分は、米国 - イスラエル国家科学財団（BM＆IL）、イスラエル科学財団（ISF）、ドイツ - イスラエル教プロジェクトプロジェクト（DIP）（BMへ）、およびバイオテクノロジー（BBSRCグラント番号：BB / M007006 / 1およびBB / D007585 / 1）からRCH

<ol><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/245/1314/203">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calphotin%3A+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+and+Ca2%2B+buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15694324">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li>
<li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Lond%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li>
<li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li>
<li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li>
<li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li>
<li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/252/1335/223">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li>
<li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li>
<li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10747191">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li>
<li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li>
<li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://elsc.huji.ac.il/minke/publications/excess-g%16betae%13-over-g%16qalphae%13-%10-vivo%11-prevents-dark-spontaneous-activity-%10droso">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li>
<li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein%2C+phospholipase+C%2C+and+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li>
<li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels%2C+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234592">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li>
<li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18786361">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li>
<li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23066080">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00709805">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9003779">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li>
<li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li>
<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+transform+glucose+to+alanine%2C+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
<li>Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+block+by+Ca2%2B+underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

D. melanogaster光受容体への全細胞記録の適用は、TRPチャネル27,28,29およびINAD30,31,32スカフォールドタンパク質のような新規シグナル伝達タンパク質の発見および機能解明を可能にした。この技術の最初の導入以来、イオンのメカニズムと光応答の電圧依存性に関する長期的な基本的な問題を解決することができました。これは、膜電圧および細胞外および細胞内イオン組成を正確に制御する能力が付与されているために生じた19,28。 D. melanogasterにおけるパッチクランプ法の主な障害は、単離された眼球プリペアの脆弱性であった配給詳細な研究により、光伝達機構の完全性は、特に光暴露中のATPの連続的な供給に決定的に依存し、これがATPの大量消費をもたらすことが明らかにされている。残念なことに、パッチピペットで光受容体膜に到達するために必要な色素（ すなわち、グリア）細胞の機械的ストライピングは、ATP産生に必要な代謝産物の主要な供給源を排除する33 。記録用ピペットへの外因性ATPの適用は、大量のATPの必要性を部分的に満たすに過ぎない。 ATPの供給が不十分であれば、TRPチャネルの自発的活性化と、光活性化チャネルからの光伝達機構の解離が起こり、細胞のCa 2+が大幅に増加し、正常な光応答34,35が失われます。この一連の出来事は、解剖処置によってではなく、むしろATPの細胞枯渇による。この一連の事象の発生を防止し、正常な光応答を維持するために、光受容体は強烈な光に曝されるべきではなく、大量のATPを消費する。また、おそらくミトコンドリアのATP産生を促進するために、記録ピペットにNADを含める必要があります（18,36）。自発的および量子的なバンプの測定の場合、薄暗い光のみが使用されるので、上記の難点は最小限である。実際には、安定した全細胞記録を約20〜25分間維持することができるが、応答速度がこの期間に亘って低下する傾向がある。解離した個眼症の単一の調製物は、2時間まで生存し続けることができる。 単離された個体化調製物のさらなる欠点は、TRPの接近不可能性につながる微絨毛の接近不可能性であり、TRPLチャンネルを録音ピペットに接続し、シングルチャンネル録音を防止します。彼らが開発した方法を用いて、Bacigalupoらは、横紋筋からの単一チャネル活動を直接記録することに成功した37 。しかしながら、このチャネル活性は、組織培養細胞38で異種的に発現されたTRPLチャネルのものとは異なり、孤立した口角炎34から得られたショットノイズ分析に由来するTRPチャネル活性とは異なる。おそらく、解剖手順は、この方法を使用する際に光受容細胞を大きく損傷した。

100年以上前に開始されたショウジョウバエDrosophila melanogaster（ D. melanogaster）の広範な遺伝子研究は、複雑な生物学的プロセスの遺伝子解剖のための非常に有用な実験モデルとして、 D. melanogaster flyを確立した。以下に記載される方法論は、全細胞パッチクランプ記録の高いシグナル対ノイズ比とD.メラノガスター分子遺伝学の蓄積されたパワーとを組み合わせる。この組み合わせは、ネイティブ環境および単一分子の最高分解能の両方におけるイノシトール - 脂質シグナル伝達およびTRPチャネル調節および活性化のモデルとしてのD. melanogaster光形質導入の研究を可能にする。 D. melanogaster光受容体への全細胞記録法の適用は、無脊椎光伝達の研究に革命をもたらした。この方法はHardie 1によって開発されたもので、2 〜26年前にRanganathanらによって永久に命名され、 D. melanogasterの広範な遺伝子操作ツールを利用して、光伝達およびイノシトール - 脂質シグナル伝達のメカニズムを解明するためにそれらを使用するように設計された。最初に、この技法は、解剖プロセス中の光感受性の急速な低下および眼球の収量の低下が原因で、詳細な定量的研究が妨げられた。その後、パッチピペットにATPおよびNADを添加することにより、長期間の定量的記録のための調製の適合性が劇的に向上した。その後、分子レベルでのシグナル伝達機構の広範な特徴付けが実現された。 現在、 D.メラノガスターの光形質導入は、ホスホイノシチドシグナル伝達およびTRPチャネルを1分子分解能で生体外で研究することができるいくつかのシステムの1つである。これはD.メラノガスターの光伝達と私を作るこのメカニズムを非常に敏感なモデルシステムを研究するために開発した。このプロトコルは、 D. melanogaster網膜を解剖し、周囲の色素（グリア）細胞から単離された眼瞼を機械的に剥がす方法を記載する。これにより、光受容体細胞本体上にギガシールおよび全細胞パッチクランプを形成することが可能になる。幸いにも、ほとんどのシグナル伝達タンパク質は横紋筋に限定され、拡散しません。さらに、シグナルコンパートメントと細胞体3,4の間に位置するcalphotinと呼ばれる不動のCa 2+緩衝液と、微絨毛5の Na + / Ca 2+交換体（CalX）の高発現レベルがあります。一緒に、横紋筋肉へのタンパク質閉じ込め、カルホチン緩衝液、およびCalXの高発現は、必須成分の損失なしに、比較的長期間（ すなわち、 〜20分まで）の全細胞記録を可能にする光に対する高い感度を維持しながら、以下のプロトコルは、孤立した眼軟骨を得て、光伝達カスケードの本来の性質を保存するように見える全細胞記録を行う方法を記載する。解離したゴキブリ（ Periplaneta americana ） 6およびクリケット（ Gryllus bimaculatus ） 7眼瞼の全細胞パッチクランプ実験を、 D. melanogasterについて記載したのと同様に行った 。さらに、ファイルクラム（ Lima scabra ）およびスカラップ（ Pecten照射器 ）の解離した光受容体に対するパッチクランプ実験は、D。メラノガスター（ melanogaster ）で行われたものとはわずかに異なる方法で行われ、全細胞8および単一チャネル測定9 。ここでは、この技術を用いたD. melanogasterで得られた主な成果について述べる。ディスカッションiいくつかの落とし穴の説明とこの技法の限界点については触れていない。

<table><tbody><tr><td>10 mLシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mLシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr> 1 <tr><td>mLシリンジ(細長い先端</td><td></td><td></td><td></td>付き</tr>) <tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Millex</td><td></td><td>22 & micro;m PVDFフィルター&nbsp;</td></tr><tr><td>キャピラリー(オマチディア分離用)</td><td></td><td></td><td>ガラス、1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm各</td></tr>)<tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&nbsp;小型ビーカー</td><td></td><td></td><td>2個 50mL以下</td></tr><tr><td>パラフィンフィルムシート 2</td>枚 <td>パラフィルム M</td><td></td><td>~5×5cm</td></tr><tr>ホーム<td>メイド</td><td></td><td></td><td>バスチャンバー</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td></td><td></td><td>22×22mm 0</td></tr>号 <tr><td>パラプラスプラス</td><td>プラス シグマ</td><td>パラフィン&ndash;ポリイソブチレン混合物</td><td>カバースリップをバスチャンバーの底に接着するには</td></tr><tr><td>地面</td><td>ワーナー・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td>64-1288</td><td>ハイブリッドアセンブリ Ag-AgCl ワイヤーアセンブリ</td></tr><tr><td>ヘッドレスマイクロ解剖針</td><td></td><td></td><td>昆虫学、12 mm</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ニードルホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 本のピンセット + 1 本の粗いピンセット</td><td></td><td>デュモン #5、生物学&nbsp;</td><td>0.05 x 0.02 mm、長さ110 mm、イノックス</td></tr><tr><td>立体ズーム顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>ショット</td><td>KL1500 液晶</td><td></td></tr><tr><td>フィルター(カラー) 冷光源用</td><td>ショット</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>デリケートワイパー</td><td>キムテック</td><td></td><td>キムワイプ</td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>QSW-T10P</td><td>Q series 軸索アンプ対応ホルダー ストレートボディスタイル</td></tr><tr><td>シルバーワイヤー</td><td>ワーナーインスツルメンツ0.25ミリメートル</td><td></td><td>直径、塩素化する必要があります</td></tr><tr>マイクロ<td>マニピュレーター</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>MP85</td><td>ハクスリーウォールスタイルマイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>ホームメイド</td><td></td><td>電磁ノイズシールドと黒いフロントカーテン</td></tr><tr><td>防振テーブルニュー</td><td>ポート</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>VC-8P</td><td>ピンチバルブ制御システム</td></tr><tr><td>灌流バルブコントローラー</td><td>サイエンティフィック・インスツルメン</td>ツ <td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>吸引システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>分子デバイス</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>分子デバイス</td><td>CV-4</td><td>ゲイン:×1/100</td></tr><tr><td>A/Dコンバータ</td><td>分子デバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>分子デバイス</td><td>10</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>分子デバイス</td><td>10</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>光源(キセノンアークランプ)</td><td>サッター機器</td><td>ラムダLS</td><td></td></tr><tr><td>光検出器</td><td>自家製</td><td></td><td>フォトトランジスタ</td></tr><tr><td>フィルターホイールとシャッターコントローラー</td><td>サッター楽器</td><td>ラムダ10-2 Uniblitzシャッター</td><td></td></tr>付き <tr><td>フィルター(自然密度フィルター)</td><td>クロマ</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>フィルター(カラー)</td><td>ショット</td><td>OG590、エッジフィルター</td><td></td></tr><tr><td>キセノンフラッシュランプシステム</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>ライトガイド</td><td></td><td></td><td>クォーツ&nbsp;</td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>AMPI</td><td>マスター8</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71、逆</td><td></td></tr><tr><td>赤色照明フィルター(顕微鏡)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645&oslash;45mm</td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS Element&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>AR</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Ca+2 インジケーター</td><td>Invitrogen</td><td>カルシウムグリーン 5N</td><td></td></tr><tr><td>励起・発光フィルターとダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td><td></td></tr><tr><td>縦型ピペットプーラー</td><td>なりしげ&nbsp;</td><td>モデルPP83</td><td>必要に応じて、垂直または水平のプーラーを使用します。</td></tr><tr><td>ホリゾンタルピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>モデルP-1000フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ラメント</td><td>サッター機器</td><td></td><td>3mmトラフまたはスクエアボックス</td></tr><tr><td>キャピラリー</td><td>ハーバード装置</td><td>ホウケイ酸ガラスキャピ</td><td>ラリー1 x 0.58 mm</td></tr></tbody></table>

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞電圧クランプ記録は、 無細胞視覚伝達の分野に革命をもたらし、イノシトール - 脂質シグナル伝達および一過性受容体電位（TRP）チャネルを単一分子レベルで研究するためのD.メラノガスター分子遺伝学の使用を可能にした。少数の研究室がこの強力な技術を習得し、高度に制御された条件下での光に対する生理学的反応の分析を可能にする。この技術により、細胞内および細胞外の培地を制御することができます。膜電圧;ならびに種々のイオン性またはpH指示薬などの薬理学的化合物の細胞内および細胞外媒体への迅速な適用が含まれる。例外的に高い信号対雑音比で、この方法は、暗い自発的および光誘起単位電流（ すなわち、自発的および量子的バンプ）および巨視的光誘起電流（LIC）を罪から測定することを可能にするgle D. melanogaster光受容体。このプロトコルは、電気生理学的および光学的記録の両方を含むこの技術を実行するために必要なすべての重要なステップを詳細に概説している。浴室内のインタクトで生存可能なエクスビボで隔離された眼軟化の達成のためのハエの網膜切開術が記載されている。全細胞および蛍光イメージング測定を行うために必要な装置もまた詳細に記載されている。最後に、拡張された実験中にこの繊細な調製物を使用する際の落とし穴について説明する。

記載された方法は、定義された条件下で、光に対する巨視的応答を生成するために合計される自発的および光誘発量子隆起を生成する基本単位電流の正確な記録を可能にした。また、重要なシグナル伝達分子（ 図3および5 ）14,15,16,17,18に欠損を有する野生型および突然変異体ハエの比較も可能にした。さらに、二イオン条件下で逆電位を測定する能力は、TRPおよびTRP様（TRPL）チャネルの基本的な生物物理学的特性を明らかにした18,19。 TRPの細孔領域におけるアミノ酸置換の影響を測定し、そのCa 2+を修飾した透磁率20 。 パッチクランプ全細胞記録によって得られる光応答は、少なくとも4桁の光強度に直線的に依存する。これは、ERGおよび細胞内記録方法を用いて解決することはできなかった。したがって、増加する強度の簡単なフラッシュに対する一連の応答および強度応答関数のプロットは、光度の増加に伴うフラッシュ応答の厳密な直線性を明らかにした。厳密な直線性は少なくとも数百pAまで保持されますが、その後はリニアリティであるのか、またはブレークダウンするクランプ制御であるのかは議論の余地があります（ 図6 ）。これらの結果は、光に対する巨視的応答が、光（ すなわち、量子隆起）に対する単一応答の線形合計であることを示唆している。 光刺激indを薄暗くする電圧記録を用いてよく確立されている大部分の無脊椎動物種では個別の電圧変動（ すなわち量子隆起）が生じる。 D.メラノガスターの量子バンプは、バンプ18の頂点に〜15個のTRPチャネルと〜2個のTRPLチャネルが協調して開かれた結果生じる。それぞれのバンプは単一光子の吸収によって生成されるが、より強い光に対する巨視的応答はこれらの基本応答の合計である14,21。バンプは、刺激条件が同一であっても、待ち時間、時間経過および振幅において著しく変化する。バンプ生成はポアソン統計によって記述される確率論的プロセスであり、それによってそれぞれが効果的に吸収される光子は1つのバンプのみを引き出す。シングルフォトン - シングルバンプ関係では、カスケードの各ステップに効率的な「ターンオン」メカニズムだけでなく、同様に効果的な「ターンオフ」メカニズムも含まれている必要があります。機能上の利点は、非常に敏感な光子計数器であり、視覚系によって要求される感度および時間分解能の両方に非常によく適した高速過渡応答を有する。効率的なターンオフメカニズムの必要性は、活性フォトピグメント（ すなわち、メタロドプシン、M）またはそのターゲットである Gqαが不活性化に失敗し、光がオフになった後も継続してバンプが連続的に生じる場合に明らかになる3 ） 15,22,23,24 。 バンプは、微絨毛におけるTRP / TRPLチャネルの協同的活性を表す。このように、チャネル活性化の仮説は、協調チャネル活性化も説明すべきである。最近Hardieらは、光が光受容体の急速な収縮を誘発することを実証しており、光感受性eチャネル（TRP / TRPL）は機械的にゲートされていてもよい25 。この機械的活性化は、PLC媒介PIP 2加水分解によって放出される観測されたプロトンと一緒に、TRP / TRPLチャネルの開口を促進し、バンプ生成の協同的性質を説明する。現在、 D. melanogaster光受容体は、ホスホイノシチドシグナル伝達およびTRPチャネルをインビボで研究することができるいくつかのシステムの1つであり、 D. melanogaster光形質導入を作成し、このメカニズムを研究する方法論が非常に貴重なモデルシステムである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> 図3：inaC P209およびinaD P215突然変異体は、光および単一量子隆起の巨視的応答の遅い応答終結を明らかにする。 （ A ）単離したオマチジウムプレパ全細胞記録の間に、蛍光Lucifer Yellow CH色素（励起：430nm;発光：540nm）で満たされたパッチピペットを用いて定量する。蛍光色素は単一の光受容体細胞体を拡散して標識し、光受容体細胞体はそれらの細長い軸索から引き離されるが生存能力を維持することに留意されたい。この調製は、全細胞同時記録および画像化実験に適している。 （ BD ）上部パネル：WT、 inaC P209 、およびinaD P215突然変異体ハエにおける連続的な薄暗い光（オープンバー）に対する全細胞電圧クランプ量子塊応答 。バンプのゆっくりとした終結が、WTハエと比較してinaC P209およびinaD P215突然変異体で観察される。以下の挿入図は、単一のバンプの拡大された形状を示しています。下部パネル：上記野生型の500ms光パルス（1.5×10 5光子/秒）に対する標準化全細胞応答の巨視的応答を記録した<html>突然変異体ハエ。 （EG）上のパネル：野生型、 arr2 3 、およびninaC P235突然変異体ハエの単一光子応答を誘発する短時間（1ms）の薄暗い光に対する全細胞電圧クランプされた量子バンプ応答。単一の光子吸収に応答して、 arr2 3およびninaC P235突然変異体ハエで観察されるバンプの列に注目されたい。ボトムパネル：対応する突然変異体の500ms光パルス（1.5×10 4光子/秒）に対する全細胞電圧クランプ正規化応答。 arr2 3で観察された巨視的応答の緩慢な終結に注意してください ninaC P235突然変異体はWTと比較して飛ぶ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> d / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：信号誘発Ca 2+流入後の細胞内Ca 2+ダイナミクスは、カルホチンによって影響を受ける。野生型およびCpn 1％の光受容体画像の時系列は、光刺激中のCa 2+指示薬の蛍光を示す。生強度画像は、偽色コーディング（棒=10μm;矢印はピペットを示す）を用いてプロットされる。 Weiss らの許可を得て再版された図。 4 。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> 図5：WT、trp、およびtrpl変異体の電気生理学的性質。 （ A ）全セル電圧クランプ・リコWT、 trp302 、およびtrp P343ヌル突然変異体ハエにおける連続的な薄暗い光（オープンバー）に応答する量子隆起の範囲。 trp P34 3バンプの振幅が大きく減少しています。挿入：野生型およびtrp P343ヌル突然変異体ハエの拡大単一量子隆起が示される。 （ B ）野生型および対応する突然変異体の3秒の光パルスに応答する全細胞電圧クランプ記録。 trp P343変異体の一過性定常状態応答が観察される。挿入：WTおよびtrp P343突然変異体の拡大された光応答が示される。 （ C ）逆電位（E rev ）付近で測定した、3mVの電圧ステップで、20msの光パルスに応答して誘発された、上記フライひずみの重畳された光誘起電流のファミリー。 （ D ） 野生型の平均E revおよび種々のムタンをプロットするヒストグラムts。エラーバーはSEMである.WTの逆転電位（E rev ）は、TRPのみを発現するtrp302の正のE revと、TRPLのみを発現するtrp P343ヌル変異体のE revとの間にある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> 図6：フラッシュレスポンスは、光強度が増加するにつれて厳密に線形です。 増加する光強度の簡単なフラッシュに対する即時の一連の応答と、短い光フラッシュの増加する強度に対する光応答のピーク振幅の依存性のプロット。この関係は、フラッシュ応答と光度の増加との間の厳密な直線性を明らかにする。この厳しい直線性光強度が4桁以上に及ぶ、少なくとも数百pAを保持するが、それが直線性であるかそれ以降に分解するクランプ制御であるかは議論の余地がある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（NaOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td>プロリン</td><td> 25 </td></tr><tr><td>アラニン</td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt;注：この溶液は、名目上はCa 2+を含まないが、Ca 2+緩衝液を添加していないため、約5〜10μMのCa 2+トレースを有するであろう。細胞外溶液（ES）= 0.5mMまたは1Mストック溶液からCaClをES-0Ca 2+に添加して調製した1.5mM CaCl 2を含むES-0Ca 2+ 。 </td></tr></tbody></table> 表1：Ca +2を含まない細胞外溶液（ES）。化学物質の説明およびCa +2を含まないESの製造に必要な特定の量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15mL </td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 1.5g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5mLバイアルで150μLアリコートに分け、-20℃で保存する 76; C。 </td></tr><tr><td>粉砕溶液（TS） </td><td>解剖中に使用された溶液と一致するように、ストック溶液150mLの1バイアルにESまたはES-0Ca 2+ 1350mLを充填する。 </td></tr></tbody></table> 表2：胎児ウシ血清（FBS）+ショ糖ストック溶液。胎児ウシ血清（FBS）+ショ糖ストック溶液の製造に必要な化学的説明および特定量。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（KOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム（Kglu） </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATPマグネシウム塩（MgATP） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTPナトリウム塩（Na 2 GTP） </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（NAD） </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr></tbody></table> 表3：細胞内溶液（IS1）。 IS1の製造に必要な化学的説明と特定量。これは主に強度応答と量子バンプ測定に使用されます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15（CsOHで調整） </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM） </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATPマグネシウム塩（MgATP） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTPナトリウム塩（Na 2 GTP） </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（NAD） </td><td> 1 </td></tr><tr><td>テトラエチル - 塩化アンモニウム（TAE） </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> -20℃で保存する。 </td></tr></tbody></table> 表4：細胞内溶液（IS2）。光誘起電流の逆電位測定に主に使用される細胞内溶液IS2を生成するために必要な化学的記述および特定量。

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

本手順の全体的な目的は、単一の光受容細胞からホールセル電位固定記録を行い、単一光子吸収による光誘起電流および強光に対する反復応答を測定することです。この手法は、光転換の基礎となる物理的およびイオン的メカニズム、およびTRPチャネルの特性など、感覚伝達分野の重要な課題を解決するのに役立ちます。この技術を用いる利点として、膜電位を完全に制御でき、信号対雑音比が極めて高く、また光学測定のための特異的な指標を導入できることが挙げられます。一般的に、この方法に不慣れな方は、作製物の極小サイズや、代謝上の脆弱性から解剖を迅速に行う必要がある点に苦労するでしょう。本手順では、1バイアルあたり約20匹の密度でハエを飼育してください。実験時には、蛹化がほぼ完了し、少なくとも24時間以上完全な暗所に置かれていた蛹を含むバイアルを数本用意してください。成虫を回収する2時間前に、すでに羽化した成虫を取り除きます。暗順応させたハエを組織内で扱う際は、常に赤色光の下で操作してください。羽化したばかりのハエを待つ間に、記録チャンバーを準備します。溶かしたパラフィンまたは高真空シリコングリースを使用してカバーガラスをチャンバーの底に固定し、バスを完成させます。次に、バスを倒立顕微鏡のステージに設置します。バスの中に、灌流システムのチューブ、吸引システムのチューブ、および電気生理学セットアップ用の接地線を配置します。解剖を始める前に、60 mmのペトリ皿の裏側にいくつかの溶液を準備します。カルシウムフリーESを4滴、TSを1滴、それぞれ離して滴下します。次に、粗いピンセットを用いて、羽化したばかりのハエの翅または体をつかみます。その後、精細ピンセットを用いて頭部を切り離し、速やかにカルシウムフリーESの1滴目に移します。実体顕微鏡下で、もう1本の精細ピンセットを使用し、正中面（矢状面）に沿って頭部を半分に解剖します。両眼とも損傷がないことを確認します。次に、頭部の半分を2番目のカルシウムフリーES液滴に、もう半分を3番目のカルシウムフリーES液滴に転移させます。その後、2つの眼のうち一方の解剖に進みます。精密ピンセットを用いて、網膜に損傷を与えないよう、眼周囲の組織を可能な限り除去します。次に、精密ピンセットで角膜の端をしっかりと掴み、網膜を掻き出します。これにより、損傷のない角膜と網膜がそれぞれ分離した状態で得られます。ピペットはエタノールに保存されているため、新しいトリチュレーションピペットを使用する場合は、必ず最初に水で洗浄してください。次に、洗浄したピペットに、4滴目以降のカルシウムフリーESを少量満たします。その後、口で緩やかに吸引し、単離した網膜をピペット内に吸い込みます。気泡が混入しないよう細心の注意を払ってください。次に、網膜をTS液の滴の中に置きます。続いて、もう一方の眼でも同様に網膜の分離を行い、両方の網膜がTS液の滴の中にある状態にします。その後、ペトリ皿からカルシウムフリーES液のみを慎重に拭き取り、皿の表面にさらに6滴のTS液を加えます。両方の網膜を新しいTSの液滴に転移させます。次に、トリチュレーションピペットを口径の小さいものに交換します。ピペットを洗浄した後、TSを1滴満たします。このピペットを用いて、両方の網膜を急速かつ繰り返し吸引および排出することで、色素細胞から一部の個眼を分離させます。この操作に伴い、TSが白濁します。次に、両方の網膜の残渣を別のTS液の滴に移します。続いて、単離された個眼を含む濁ったTS液の滴をピペットで吸い込みます。この溶液をバスチャンバー内に排出してください。網膜が完全に溶解するまで、より直径の小さいトリチュレーションピペットを用いてこの操作を繰り返します。ここで、1分間待機します。この待機時間中に、単離した個眼がチャンバーの底に接着します。1分後、灌流システムを用いて 1.5 millimolar のカルシウムを含む ES の注入を開始してください。チャンバーに液を満たす際、接地線と吸引チューブが浸っていることを確認してください。次へ進む前に、溶液を60〜90秒間流します。まず、40倍対物レンズを使用して、バス内の個眼を慎重に観察します。個眼を形成する伸長した光受容細胞体が、軸索から切り離されているものの、生存していることに注目してください。次に、実験に適した個眼を選択します。以下の基準を満たしている場合に選択してください。外膜は滑らかで完全である必要があります。長軸は、遠位側からアプローチする電極に対してほぼ直角である必要があります。また、個眼は過剰な組織に囲まれていない状態である必要があります。個眼を選択したら、それを視野の中心に合わせます。次に、実験に適した細胞内液をピペットに満たします。そして、ピペットを電極ホルダーに固定します。次に、ピペットのチューブに息を吹き込んで正圧を作り、チューブバルブを閉じて圧力を保持します。続いて、ピペットをバスチャンバーに挿入し、個眼の遠位部に近づけます。パッチしたピペットからの正圧により、膜に小さななくぼみ（ディンプル）が観察されるまで誘導します。ここで、記録ソフトウェアのメンブレンテストモジュールを開き、2 mVの連続矩形電圧パルスを100 Hzの頻度で印加します。次に、パッチクランプアンプのコントロールを使用して、接合電位をゼロに設定し、矩形パルスのベースをゼロ電流にします。その後、バルブを開いてピペット内の圧力を開放し、緩やかに吸引して陰圧をかけます。これにより、ピペットが細胞膜に密着します。これが完了したら、バルブを閉じて圧力を保持します。次に、電極の抵抗値を確認してください。抵抗値は100から150 megaohmsまで上昇しているはずです。次に、バルブを再び開いてピペット内の陰圧を解除します。このとき、抵抗値が1〜2 GΩまで急上昇し、ピペットと細胞の間でギガシール（GΩシール）が形成されたことが示されます。続いて、パッチクランプアンプを用いて、ピペットの容量性電流をオフセットします。ホールセル構成を作成するために、口による吸引で細胞膜を破裂させます。電極内に、短時間で強力な負圧を急速に繰り返しかけます。ホールセル構成が得られると、容量が急激に増加します。次に、パッチクランプアンプを用いて、保持電位を必要な電圧に設定し、直列抵抗における容量電流をオフセットします。ここで、ファラデーケージの黒い遮光カーテンを閉め、実験を開始します。蛍光染料であるLucifer yellowを含むパッチピペットでホールセル構成を得ると、個眼を形成する光受容体の一つだけに染料が導入されていることが確認できます。この光受容体は、個眼内の隣接する受容体からも電気的に隔離されます。野生型ショウジョウバエおよびInaCまたはInaD遺伝子に変異を持つショウジョウバエの個眼を用いたホールセル電位クランプ法において、持続的な弱光に対する応答として量子バンプが認められました。野生型と比較して、両変異体ではバンプの消失が緩やかであることが観察されました。150,000 photons/sの強度で照射した500ミリ秒間の光パルスに対する標準化された応答により、生理学的変化が明確に示されています。本標本を用いることで、1ミリ秒の短時間弱光刺激に対する、ホールセル電位固定法によるクォンタムバンプ応答の測定さえ可能となりました。このような単一光子応答を、野生型、アレスチン変異体、およびninaC変異体のショウジョウバエで比較しました。どちらの変異体においても、一連のバンプ（ bumps）を伴う応答が認められました。15,000 photons/secondで照射した500ミリ秒の光パルスに対する正規化応答を示します。したがって、マクロな応答の緩やかな終結は、arrestin-2およびninaC変異体において観察されます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエの光受容細胞からホールセル記録を行う方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に実施することで1時間で完了させることができます。この技術は、TRPチャネルやイノシトール脂質シグナル伝達への理解を深めただけでなく、非画像形成的な光依存性活動に関与する哺乳類の固有光感受性網膜神経節細胞の役割を解明するための道を開きました。

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テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネルを用いたショウジョウバエのシナプス接続を調べる

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ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

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全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法

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