脳膜分画： Ex Vivo Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

この手順の全体的な目標は、マウスの脳から異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することです。運動伝達成分の分布を記述することは、正常な状態と病的な状態の両方でシナプス機能を理解するために不可欠です。蓄積された証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であり、シナプス伝達を維持する劇的な構造変化を経験する可能性があることを示しています。

シナプスは、従来、電子顕微鏡法によって研究されてきました。この膜分画法は、異なるpH条件下で中性界面活性剤を使用したレーザー抹消と、それに続くスプリットセカンド遠心分離の組み合わせに基づいています。簡単に言うと、マウスの脳を取り出し、その海馬を砕いた氷の上に座った冷たい皿で慎重に解剖します。

海馬は、氷冷分離バッファーを含むPotter-Elvehjemガラス管に収集されます。続いて、収集された組織は、均質化攪拌機を使用して均質化されます。次に、均質化された組織をショ糖カルシウム溶液と混合します。

次に、組織抽出物を濃縮ショ糖カルシウム溶液で覆います。その後、サンプルを遠心分離します。シナプトソームを含む膜画分は、ショ糖溶液の界面内に浮かぶ緻密なリングとして容易に認識されます。

続いて、異なるシナプス下コンパートメント、すなわち、シナプス分画、プレシナプス画分、およびシナプス画分画の単離は、分化pH条件で中性洗剤を用いた光可溶化を組み合わせることによって達成される。最後に、異なるコンパートメントでのタンパク質濃縮をイムノブロット分析によって検証します。実験の日は、新鮮な溶液を準備し、氷の上で冷やします。

砕いた氷の上に座り、10ミリリットルの氷冷分離バッファーを含むシャーレに脳を置きます。一対の鉗子の助けを借りて海馬を慎重に解剖します。海馬を、1ミリリットルの氷冷分離バッファーを含む5ミリリットルのポッターエルヴェイェムガラス管に移します。

その後、均質化攪拌機を使用して均質化します。均質化された組織を、ショ糖とカルシウム溶液を含む15ミリリットルのファルコンチューブに移し、チューブを反転させてゆっくりと混合します。溶液を超透明の遠心分離チューブに入れ、各チューブの上に塩化カルシウムを含むスクロース2.5ミリリットルを追加します。

そして、分離緩衝液でチューブを校正し、超遠心分離機で4度で100、000Gで3時間遠心分離します。遠心分離機のスチール製サポートからチューブを慎重に取り外し、シナプトソームを含むショ糖界面内の密なリングを特定します。青い先端の助けを借りて、一番上のメーリングレイヤーを捨てます。

パスツールピペットで、シナプトソーム画分が入った密なリングを採取し、超透明の遠心チューブに移し、砕いた氷の上に保ちます。シナプトソームを9容量の氷冷分離バッファーで希釈し、4度で15, 000Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを取り外します。

上清を捨てます。シナプトソームを含むペレットが見えるはずです。ペレットを1.1ミリリットルの分離バッファーで再懸濁し、次のステップのために砕いた氷の上に保ちます。

対応するpHを4度に調整した新鮮な溶液を作ります。再懸濁したシナプトソームペレット1ミリリットルを、連続攪拌下の氷上のビーカーで5ミリリットルの塩化カルシウムにゆっくりと加えます。続いて、5ミリリットルの濃縮可溶化緩衝液pH 6で。

氷上で50分後、溶液を超透明遠心分離管に移し、40,000Gで4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを取り外します。シナプス前画分とシナプス後画分を含むペレットを観察する必要があります。

余分なシナプス画分を含む上清は、15ミリリットルの濃縮チューブに集められます。ペレットを2ミリリットルの可溶化緩衝液pH 6で慎重に洗浄します。ペレットを乱さないようにし、バッファーを廃棄してください。

ペレットにpH 8の可溶化緩衝液の10ミリリットルで、パスツールピペットの助けを借りて滴定します。ビーカーを氷上で50分間連続的に攪拌しながらインキュベートします。溶液を超透明遠心チューブに移し、40, 000 Gで4度で30分間遠心分離します。

遠心分離後、チューブを取り外します。シナプス後画分を含むペレットを観察する必要があります。シナプス前画分を含む上清を15ミリリットルの濃縮チューブに集める。

シナプス後画分を含むペレットを200マイクロリットルのSTS溶液で再懸濁します。再懸濁したペレットを超音波処理します。タンパク質測定アッセイにより、各画分中のタンパク質量を評価します。

各画分から20 μgのタンパク質を採取し、STSポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファーで処理します。STSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、イムノブロットで解析します。GPR37は、主にげっ歯類の脳にある別の素晴らしいタンパク質グローバル受容体です。

パーキンソン病や大うつ病などのさまざまな病状に関与しており、その機能は異常なままです。シナプスにおけるこの受容体の存在を研究することは、中枢神経系におけるその役割を解読するのに役立ちます。野生型およびGPR37ノックアウトマウス由来のシナプトソームを単離し、続いて分画した。

各シナプス下コンパートメントの純度は、それぞれのシナプスマーカーの分離によって保証されました。余分なシナプス小胞マーカーであるシナプトフィジンは、この余分なシナプス画分で濃縮されました。古典的なシナプス後密度マーカーであるBSD 95タンパク質は、対応するシナプス後画分に濃縮されました。

最後に、シナプス前画分の純度は、シナプス前活性ゾーンマーカーであるSNAP25の存在によって検証されました。興味深いことに、GPR 37の免疫反応性は余分なシナプス画分でより豊富でしたが、シナプス前画分よりもシナプス後画分の方が有意に好まれることも示されました。シナプス下タンパク質の組成を評価することは、神経科学における重要な課題です。

しかし、これはタンパク質相互作用リボンによって高度に制御されているため、簡単な作業ではありません。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を選択するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを紹介します。言い換えれば、シナプス前、シナプス後、およびシナプス余のコンパートメントからタンパク質の濃縮を行うための化学技術について説明されています。

ようなら、そしてあなたの分画実験に幸運を祈ります。