Name: 脳膜分画： Ex Vivo Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ脳膜分画法でマウス海馬からシナプス小胞・前シナプス・後シナプスタンパク質を分離し、正常および病理状態におけるシナプス機能の機構解明に役立てる方法です。

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この研究は、サンパウロ・カルロス3世大臣（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03およびPIE14 / 00034）、カタリナ・デ・レクレッサー・エスティス・アバナッツ（ICREA Academia-2010）また、X. M、VF-D。、およびFCは、「神経薬理学および疼痛」認定研究グループ（Catalunya Generaletat de Catalunya、2014 SGR 1251）に属しています。 。この作品はまた、CAPES（ブラジル）からFCへの &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciênciasem Fronteiras&quot;

全ての動物実験手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドライン11および欧州共同体に従ったガイドライン86/609/5に記載されているガイドラインに従って、バルセロナ大学動物実験委員会（CEEA） CCE、FELASA、およびARRIVEのガイドライン。したがって、マウスを標準的なケージに入れ、食物および水を自由に摂取させ、制御された標準条件下（7時間30分、22℃の温度および66％の湿度から始まる12時間の暗/明サイクル）で維持する。 1.不連続なスクロース勾配を用いたマウス脳シナプトソームの取得注：この方法は以前に報告された10 。 <ol><li>新鮮な分離バッファー（IB）、pH 7.4を調製する。 2Mスクロース; 1Mショ糖/0.1mM CaCl 2 ; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 </li><li> Sa子宮頸管脱臼により5匹のマウスを裂く。各動物の脳を断ち切って迅速に除去する。目的の脳領域（すなわち、海馬、新鮮な組織0.25~0.35g）を摘出し、1mLのIBを含む氷上の5mL Potter-Elvehjemガラス管に入れる。 </li><li>ホモジナイジングスターラー（1分間に700〜900回転で10ストローク）を使用して、好ましくは氷浴中で組織をホモジナイズし、サンプルの加温を防止する。 </li><li> 4℃で2Mスクロース6 mLと0.1 mM CaCl 2 2.5 mLを含む15 mLチューブにホモジナイズした組織（1 mL）を入れます。チューブを逆さにしてゆっくりと混合する。 注：カルシウムの添加は、オルガネラ間の接着相互作用を維持し、それによって異なる「密度」の構造を維持するために不可欠です。 </li><li>溶液を12mLの遠心チューブに入れ、スクロースグラジエントを形成するために各チューブの上に2.5mLの1Mショ糖/0.1mMのCaCl 2をゆっくり加える。 注：ラベルの位置o恒久的なマーカーを用いて遠心チューブ上の勾配界面。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを100,000× gおよび4℃で3時間遠心分離する。すべてのスチールサポート（必要に応じて空の場合もあります）でロータを完全に充填します。 </li><li>ミエリンを含む最上層を捨てる。パスツールピペットで、シナプトソーム画分に対応する1.25-Mと1-Mスクロース間期の間に白いリングを集める。 </li><li>遠心管内でIBを用いてシナプソームを9倍に希釈する。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して15,000 x g 、4℃で30分間チューブを遠心分離する。 </li><li>上清を捨てて再懸濁する1.1mLのIB溶液を添加した。このシナプトソーム溶液100μLを集め、11,000 x gと4°Cで5分間遠心します。 </li><li>シナプトソームペレットを5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に再懸濁し、-20℃で保存します。 注：このサンプルは、さらなるウェスタンブロット解析のための総シナプトソーム画分に対応します。残りのシナプトソーム画分（〜1 mL）は、使用するまで-20℃で凍結するか、その後のシナプス後分画のために処理することができます。シナプトソームまたは精製されたシナプスは、総海馬体積の1〜2％を占める。 </li></ol> 2.前シナプス後シナプスおよび後シナプス間の分離<ol><li>新鮮な可溶化緩衝液（pH6.0）を2倍調製する; 1×可溶化緩衝液、pH6.0;可溶化緩衝液、pH8.0; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 注：これらの溶液のpHは正確でなければならない良好な亜シナプス分画を達成するように調整した。 </li><li> 1mLの再懸濁したシナプトソーム画分（ステップ1.12参照）を5mLの0.1mM CaCl 2でゆっくり希釈する。 </li><li>同じ容量（5mL）の氷冷2倍可溶化緩衝液（pH6.0）を添加し、氷上でビーカー内で高攪拌しながら氷上で50分間インキュベートする。 注意：pH6.0のTriton X-100の1％はすべての原形質膜タンパク質を可溶化しますが、シナプスの接点または接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス後）にタンパク質を保存します4 。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じたふたの中で、0.1mMのCaCl 2および2倍の可溶化緩衝液pH6.0の等容量の試験管を秤量し、平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000 x gで4℃で30分間遠心します。得られた上清は、シナプス外画分を表し、ペレットはシナプス接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス分画）に対応する。 </li><li> 4000 xgと4℃で遠心分離した15 mL 10Kフィルターチューブを使用して、シナプス外分画を含む上清を最終200μL容量に濃縮する。 </li><li>得られた濃縮シナプス外画分（200μL）を予冷（-20℃）アセトン5倍量（1mL）で-20℃で一晩沈殿させる。 </li><li>翌日、シナプス外画分を18,000× gおよび-15℃で30分間遠心する。遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを乾燥させてアセトンの痕跡を除去する。 </li><li>最後に、シナプス外タンパク質を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。必要であればペレットを超音波処理する。 </li><li>それを混乱させることなく、前及びシナプス後画分を含むペレットを2mLの1×可溶化緩衝液、pH6.0で注意深く洗う。バッファを破棄します。 </li><li> Resuspendガラス製パスツールピペットを用いて、10mLの1×可溶化緩衝液（pH8.0）でペレットを洗浄する。 注：pH 8.0のTriton X-100の1％はシナプス前特殊化を可溶化しますが、不溶性のシナプス密度4を維持します。 </li><li>氷上でビーカー内で高攪拌下、懸濁液を氷上で50分間インキュベートする。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じた蓋で、チューブを1x可溶化緩衝液（pH8.0）で計量して平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000× gおよび4℃で30分間遠心分離する。得られた上清はシナプス前分画に対応し、ペレットはシナプス後分画に対応する。 </li><li>ステップ2.6-2.9で説明したように、シナプス前分画を含む上清を処理する。 </li><li>シナプス後画分を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。ペレットを超音波処理する、私はfが必要です。 </li></ol> 3.膜の分画を確認するためにイムノブロットでサンプルを分析する。 <ol><li>ビシンコニン酸タンパク質アッセイを用いて、各画分中のタンパク質の量（ すなわち、全シナプス、シナプス前およびシナプスの画分）を決定する。 </li><li>各画分から20μgのタンパク質を取り、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファーで50μLの最終容量に希釈します。 100℃で5分間沸騰させる。 </li><li>還元条件下で4％濃縮ゲルを用いてSDS-PAGE電気泳動により10％のタンパク質を分離する。色素が下部ゲルに入り、電圧を120Vに上昇させるまで、80Vの定電圧で電気泳動する。 </li><li>タンパク質をPVDFメンブレンに移し、IBブロッキング溶液で45分間、室温で連続的に振盪しながらブロックする。 </li><li>示された一次抗体（ すなわち、抗SNAP-25、抗PSD-95、抗シナプトフィジン、または抗GPR37）を、IBブロッキング溶液中で希釈して、連続的に振とうする。 </li><li>結合していない一次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>示された二次抗体と一緒に、連続的に振とうしながら暗所で室温で90分間インキュベートする。 </li><li>結合していない二次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>メンブレンを化学発光基質とインキュベートする（暗条件下で、溶液Aと溶液Bの1：1の割合でメーカーが提供する）。 </li><li>化学発光検出装置で膜を分析する。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

ここで提示されたプロトコルは、任意の脳領域内の特定のタンパク質のシナプス下分布を研究するための強力な生化学的ツールを構成します。ただし、この手法には、ここで強調する価値のあるいくつかの欠点があります。例えば、主な制限の1つは、すべてのシナプス下画分のイムノブロット分析を行うために、適度な量のタンパク質を精製するために必要な組織の量が比較的多いことです。この問題は、シナプス(すなわち、 シナプトソーム)が海馬全体の体積の1〜2%しか占めていないという事実に関連している可能性があります12。実際、分割を成功させるには、1〜1.5 gの新鮮な組織(すなわち、 海馬)が必要です。そうしないと、収量が低すぎて、研究対象のタンパク質の同一性と局在性を評価することができません。 
逆に、過剰な脳組織を使用すると、分離手順は最適ではありません。最適なシナプス下分画を確保するには、溶液の pH を慎重に調整することも重要です。したがって、脳膜分割が行われるたびに、さらなる研究の前に各分割の効率を検証することが必須です...

シナプス伝達はシナプスの物理的完全性に依存しており、これはフォスターとシェリントンによって1897年に早期に構想された概念である。したがって、重要な神経伝達成分（ 例えば、イオンチャネル、受容体など ）の分布を理解することは、正常状態および病理学的状態の両方におけるシナプス機能を解明するために不可欠である。電子顕微鏡（EM）は、プロトタイプの中枢神経系（CNS）シナプスの現在の超微細構造の概念に非常に貢献している。そのようなやり方で、EMは、プレ・シナプス密度とシナプス後密度との間の差異を細かく確立しており、これはかなり均一な距離（約25nm）の裂け目で分けられている。興味深いことに、シナプス後の装置は、その原形質膜の下に比較的連続した電子密度の高い肥厚、いわゆるシナプス後密度、すなわちPSD2を示す 。逆に、シナプス前の装置では、不連続細胞マトリックスネットワークは原形質膜のすぐ下に配置され、シナプス小胞の細胞膜活性ゾーン3への整列およびドッキングに必須である。したがって、EMは、構造的に保存されたCNSシナプス内のタンパク質の分布を調査するための黄金実験アプローチを構成する。しかしながら、電子顕微鏡写真によって提供される情報は静的である。事実、蓄積する証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であることを示し、したがって、持続的なシナプス伝達に劇的な構造変化を経験する。さらに、シナプスの形態および組成は、様々なCNS領域の全体にわたって、ならびに発達、成熟、老化および神経病理学的状態の発生によって変化し得る。全体として、生理学的条件における異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することに焦点を当てたプロトコルは、シナプス機能のより包括的な研究のための貴重なツールである。 らによって最初に記載されたこの膜分画法は、 （2001） 4は、シナプス前およびシナプス後の装置内で生じる接着相互作用を弱めるpHシフトに基づいている。第1に、pH6.0の中性洗剤を用いることにより、シナプス前および後シナプスの装置を保持し、可溶化されてシナプス接触から抽出されるシナプス外膜ドメインから維持される付着接合を識別することが可能である。続いて、中性洗剤の存在下でpHを6.0から8.0に上げると接着結合の強度が弱まり、シナプス前活性領域がシナプス密度に強く結合した状態に保たれる。したがって、シナプス前区画は、潤滑され、シナプス密度から分離することができ、これは使用される界面活性剤の濃度がその可溶化を促進しないためにほとんど保存される4 。興味深いことに、最終的に90％より高い分画効率は、異なるシナプス後マーカーによって確認することができる： i ）シナプス前活性ゾーンからのシナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25）; ii ）シナプス間隙画分（ すなわち、活性領域の外側およびミクロソームを含む）からのシナプトフィジン。およびiii ）シナプス密度からのシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）。特に、この脳膜分画法はうまく使用されています。したがって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体5 、アデノシンA 1受容体（A 1 R） 6 （AMPA）受容体などの様々な受容体の副シナプスの局在を正確に決定することが可能であった。 、アデノシンA 2A受容体（A 2A R） 7 、アデノシン三リン酸（ATP）P2受容体8 、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット9 、およびパーキンソン病関連受容体GPR37 10 。しかしながら、多くの制限が、特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の適切な評価を妨げる可能性がある。したがって、この手順では、プロトコール全体を完全に記述するだけでなく、必要とされる組織の量が多量であること、タンパク質の収量が低いこと、およびタンパク質の効率を検証するための必須要件など、明確な実験を行う前にそれぞれの分離。

<table><tbody><tr><td>ショ糖</td><td>膵臓 Qu&iacute;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>膵臓クイアキュート;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテルセット III</td><td>Millipore、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>膵臓 Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルー</td><td>膵臓 Qu&iacute;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪粉ミルク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>膵臓 Qu&iacute;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>膵臓 Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL、バルセロナ、スペイン</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>基本 20 pH</td><td>Crison、アレラ、スペイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 適応型ホモジナイザー</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルバニア州、米国。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超透明チューブ(14x89mm)</td><td>ベックマン・コールター、ホスピタレット・デ・リョブレガット、バルセロナ</td><td>344059</td><td>チューブは、超遠心分離による崩壊を防ぐために、使用時にほぼ完全に充填する必要があります。</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15遠心フィルター ウルトラセル-10K</td><td>メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機5430R</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オプティマL-90K超遠心分離機</td><td>ベックマンコールター、ホスピタレットデリロブレガット、バルセロナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソニファイア 250</td>ブラン<td>ソン、ダンベリー、コネチカット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アマシャムイメージャー600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH、バルセロナ、スペイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てガラス パスツール Pippetes 230 mm</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルバニア州</td><td>、米国 612-1702</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトバランス EK-610</td><td>A&D、東京、日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピアス&トレード;BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Francisco Ciruela Laboratoryで製造および検証された自家製抗体抗GPR37。</td><td></td><td>最終濃度0.250 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>一次抗体希釈 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>二次抗体希釈 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>二次抗体を1:30,000に希釈</td></tr></tbody></table>

脳膜分画：<em&gt; ex vivo</em&gt; subsynaptic protein localizationを評価するアプローチ

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

シナプスタンパク質の組成および機能を評価することは、神経科学において重要な課題である。しかし、シナプス内で起こる神経伝達を動的タンパク質 - タンパク質相互作用およびリン酸化事象によって高度に制御されるので評価することは容易ではない。したがって、シナプス伝達を研究するためにいずれかの方法が使用される場合、主要な目標は、これらの一時的な生理学的修飾を保存することである。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。換言すれば、プロトコールは、シナプス前、シナプス後およびシナプス外区画からタンパク質濃縮を行うための生化学的方法論を記載している。第1に、シナプトソームまたはシナプス末端は、不連続なスクロース勾配を用いてすべてのシナプスコンパートメントを含むニューロンから得られる。注目すべきは、この初期シナプス膜調製物の品質はc儀式的。続いて、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いて軽度の可溶化を行うことにより、種々の副シナプスコンパートメントの単離が達成される。これにより、勾配遠心分離および等密度遠心分離による分離が可能になる。最後に、様々なシナプスタンパク質マーカー（ すなわち、 SNAP-25、PSD-95、およびシナプトフィジン）を用いたイムノブロット分析により、異なるシナプス後区画（ すなわち、シナプス前およびシナプス後の膜画分）任意の特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の直接評価を可能にする。

記載された方法論は、一般に、ニューロンタンパク質の潜在的なシナプス分析、および特にシナプス受容体の単離および生化学的特徴づけのために、主に使用されてきた5,6,7,8,9。興味深いことに、ここに表示された代表的な結果は、オーファンGタンパク質共役受容体、すなわちパーキンソン病関連受容体GPR37 10のシナプス下海馬分布の解析に対するこの実験手順の有用性を示している。 GPR37は、エンドセリンまたはボンベシンレセプター13の相同体の検索によってもともと同定されたが、エンドセリンまたは関連ペプチドに結合しないことが判明した。その代わりに、GPR37は、頭部活性化剤pによって活性化されることが提案されたこれらの関連はまだ普遍的に受け入れられているが、最近では、ニューロペプチドであるプロサポシンとプロスタプチド17によって 、 GPR37は、パーキンソン病との関連性が最も注目されている18</sup...

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

本手順の全体的な目的は、マウス脳から異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することです。キネティック伝達成分の分布を記述することは、正常および病理学的条件の両方におけるシナプス機能を理解する上で不可欠です。生体内のシナプスは極めてダイナミックであり、シナプス伝達を維持しながら劇的な構造変化を起こし得ることが、蓄積されたエビデンスによって示されています。シナプスは、伝統的に電子顕微鏡を用いて研究されてきました。この膜分画法は、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いたレーザー消去と、それに続く極短時間の遠心分離の組み合わせに基づいています。簡潔に述べると、マウスの脳を取り出し、砕氷の上に置いた冷却ディッシュ内で海馬を慎重に摘出します。海馬を、氷冷した単離バッファーを含むPotter-Elvehjemガラスチューブに回収します。続いて、回収した組織をホモジナイザーで均質化します。次に、均質化された組織をショ糖カルシウム溶液と混合します。次に、組織抽出液の上に高濃度ショ糖カルシウム溶液を重層させます。その後、サンプルを遠心分離します。シナプトソームを含む膜画分は、ショ糖溶液の界面に浮遊する濃密なリングとして容易に識別できます。続いて、緩やかな界面活性剤を用い、pH条件を分画させることで緩やかな可溶化を行い、異なるサブシナプスコンパートメント、すなわちシナプス外、シナプス前、およびシナプス後分画を単離します。最後に、各コンパートメントにおけるタンパク質の濃縮を免疫ブロット分析により検証します。実験当日に新鮮な溶液を調製し、氷上で冷却しておきます。砕氷上のシャーレに配置し、10 mLの氷冷分離バッファーを入れた中に脳を置きます。ピンセットを用いて、海馬を慎重に切り出します。切り出した海馬を、1 mLの氷冷分離バッファーを含む5 mLのPotter-Elvehjemガラスチューブに移します。その後、ホモジナイザを用いて均質化します。均質化した組織を、スクロースおよびカルシウム溶液を含む15 millilitersのFalconチューブに移し、チューブを反転させてゆっくりと混合します。溶液を超透明遠心チューブに移し、各チューブの上層に塩化カルシウムを含むスクロースを2.5 milliliters加えます。次に、分離バッファー溶液を用いてチューブを調整し、超遠心機を用いて4°C、100,000 Gで3時間遠心分離します。遠心機のスチールサポートからチューブを慎重に取り出し、シナプトソームを含むショ糖界面内の高密度リングを確認してください。ブルーチップを用いて、上部の浮遊層を除去します。パステュールピペットを用いて、シナプトソーム画分を含む濃厚なリングを回収し、超透明遠心チューブに移して砕氷上に保持します。シナプトソームを氷冷した単離バッファー9倍量で希釈し

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

顕微鏡のカバーグラス上に、哺乳動物細胞の in...

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。...

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。...

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。...

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

ここでは、末梢関連タンパク質の蛍光タグ付きのプラズマ膜協会のレベルの定量的分析を実行するためのプロトコルを提案する.メソッドは、膜の計算の分解、細胞膜蛍光マーカーの付いた信号の細胞質成分に基づいています。...

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。...

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。...

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。...

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

学ぶ脳膜分画法でマウス海馬からシナプス小胞・前シナプス・後シナプスタンパク質を分離し、正常および病理状態におけるシナプス機能の機構解明に役立てる方法です。

脳膜分画：

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