フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

この手順の全体的な目標は、光遺伝学を使用してニューロン活動を誘導した後、電子顕微鏡で膜ダイナミクスを捉え、刺激後に定義された時点で細胞を凍結することです。この方法は、シナプス小胞のリサイクルのメカニズムに関する神経科学や細胞生物学の重要な質問に答えるのに役立ちます。また、非常に速い時間スケールでのモデリングも可能になるかもしれません。この手法の主な利点は、電子顕微鏡を使用して細胞内の形態学的変化をミリ秒の時間スケールで視覚化できることです。

この手順は、大学院生のShuo Liと研究員のSumana Raychaudhuriによって実演されます。どちらも私の研究室から来ています。固定液を調製する前に、2ミリリットルの極低温ヤスリを、標本番号に応じて鉛筆で標識します。

次に、すべての固定剤試薬を組み合わせ、各バイアルに1ミリリットルの固定剤を分注します。チューブをキャッピングした後、すぐに固定剤を液体窒素に浸し、バイアルを密閉した発泡スチロールボックスに保管します。次に、自動自由置換ユニットと高圧冷凍庫に液体窒素を充填します。

次に、アセトンの小さな容器を自由置換ユニットの試料チャンバーに入れ、置換ユニットの温度が摂氏マイナス90度に達するまで待ちます。光刺激プロトコルをプログラムするには、タッチスクリーンモニターの光刺激ウィンドウで編集をクリックします。別のウィンドウが開きます。

暗期の場合は 15 秒、周期の場合は 100 ミリ秒、パルスの場合は 10 ミリ秒、10 ミリ秒の 1 回の刺激の周期数の場合は 1 を入力します。

メイン画面で、光刺激のボックスがオンになっていることを確認し、標本の保存をクリックしてから編集をクリックします。新しいウィンドウで、プラスまたはマイナスボタンを使用して2つを選択し、各チャネルに2つの検体を保存し、保存液体窒素有効が選択されていることを確認します。実体顕微鏡で、サファイアディスクセルを上にして、中央の黒いプレートのウェルに置きます。

その後に100ミクロンのスペーサーリングが続きます。ブランクサファイアディスクの片面を温めた生理食塩水に浸し、生理食塩水を下にしてスペーサーリングの上に置きます。別の100ミクロンのスペーサーリングを配置します。

そして、最後のサファイアディスクの上に400ミクロンのスペーサーリングを取り付け、濾紙を使用して余分な液体を取り除きます。サンプルを保持している間は、サファイアディスクの間に気泡を閉じ込めないように注意してください。次に、アセンブリ全体を2つの透明な半円筒の間に置き、上部の赤いカバーを閉じて凍結プロセスを開始します。

凍結プロセスが完了すると、赤いカバーが自動的にポップアップします。すべてのサンプルが凍結したら、保管デュワーのドアを開き、デュワーをベンチトップに移します。試料チャンバーを貯蔵デュワーから液体窒素で満たされた特殊なサンプルトレイに移します。

そして、ノブのロックを解除して試料カップを解放します。次に、液体窒素冷却チップ付きのピンセットを使用して、透明な半円筒を試料カップから取り外します。そして、真ん中の黒いプレートを液体窒素の入った小さなカップに慎重に移します。

凍結したサンプルは常に液体窒素の下に保管し、常に予冷したピンセットでサンプルを取り扱うように注意してください。ピンセットを再度予冷し、最初の中央プレートを予冷したアセトンにすばやく移します。プレートを軽く振って軽くたたいて、サファイアディスクをプレートから分離します。

次に、固定剤のオープン極低温ファイルを置換ユニットの試料チャンバーに入れます。サファイアディスクをバイアルに移します。そしてすぐにバイアルをキャップします。

すべてのサンプルが転送されたら、適切なフリー置換プログラムパラメータを設定し、プログラムを開始します。無料置換プログラムの最後に、手袋を使用して極低温ファイルを試料チャンバーから化学フードに移し、ピペットを使用して室温のアセトンを各バイアルに加えます。各バイアルの洗浄液を新鮮なアセトンと1〜2時間で4〜6回交換します。.

次に、新たに調製した30%エポキシ樹脂を各バイアルに加え、室温で120rpmのオービタルシェーカーで2〜3時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、30%エポキシ樹脂を70%エポキシ樹脂に交換し、オービタルシェーカーで3〜4時間のインキュベーションを行います。次に、ピンセットを使用して、各ディスクを細胞側を上にして包埋カプセルのキャップに移し、ディスクに90%エポキシ樹脂を加えて、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌朝、各サファイアディスクを新しい埋め込みカプセルのキャップに移し、新たに準備した100%エポキシ樹脂をキャップに充填します。最後の100%エポキシ樹脂インキュベーション後、サンプルを摂氏60度のオーブンで48時間重合します。サンプルが重合したら、最初のサンプルを実体顕微鏡に逆さまにして置き、サファイアディスクがレジンブロックの上部に位置するようにし、カミソリの刃を使用してサンプルの上部からレジンの薄い層を取り除きます。

次に、かみそりの刃を使用してディスクの端に沿って浅い線を切り取り、サファイアディスクをエポキシ樹脂から分離します。そして、ディスクを液体窒素に約10秒間浸して、ディスクを樹脂の残りの部分から分離します。解剖顕微鏡で樹脂を移し、サンプルを顕微鏡ステージにテープで貼り付けます。

4倍から10倍の倍率でセルのある領域を見つけ、両刃のカミソリの刃を使用して、関心のある領域の周囲に2×2ミリメートルの領域を切り取ります。次に、瞬間接着剤を使用して細胞をエポキシ樹脂製の円筒形のダミーブロックに取り付け、ブロックを摂氏60度で1時間インキュベートします。超マイクロトームで切片化した後、サンプルを透過型電子顕微鏡に移し、930, 000倍の倍率でイメージングします。

この画像では、マウス海馬ニューロンのシナプス前膜の活性ゾーン内で、光の開始から15ミリ秒後に記録されたエキソサイトーシスを介したシナプス小胞融合が示されています。光の開始から100ミリ秒後には、活性ゾーンに隣接するエンドサイトーシスピットが観察でき、神経細胞による超高速のエンドサイトーシスを示しています。このビデオを見れば、フラッシュ実験とフリーズ実験でサンプルを処理する方法について十分に理解できるはずです。

グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、液体窒素の取り扱いは非常に危険であるため、防護服を着用してください。一度習得すれば、この手順の凍結部分は12個のサンプルで数時間で完了しますが、イメージングや画像分析を含む残りの手順は、数日、数週間、さらには数か月かかる可能性があるため、非常に長い手順になる可能性があります。タンパク質を局在化したり、そのダイナミクスを可視化したりする場合は、抗原性やパールレッセンスタンパク質のパーセッセンスを保持するために、さまざまなプロトコルを使用し、これらの手法を使用してそのダイナミクスを視覚化することもできます。