Name: フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶフラッシュ・フリーズ法を用いた電子顕微鏡による神経細胞の膜ダイナミクス可視化。オプトジェネティクス刺激後のミリ秒分解能でシナプス小胞融合とエンドサイトーシスを観察する革新的な手法です。

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この作品は、ジョンズホプキンス大学（SW）からの資金によってサポートされていました。私たちは、彼らの技術支援のための医学顕微鏡施設のジョンズホプキンス大学に感謝します。私たちは、エリックヨルゲンセンとクリスチャン・ローズンマンドと技術の発展のために自分の研究室のメンバーに感謝します。私たちは、最初のデバイスの設計のためのM. ウェイン・デイビス感謝します。私たちは、彼らの技術支援のためにポール・ワージンガー、クベータ・トモバ、およびDelgermaa Luvsanjavに感謝します。また、原稿の彼らの重要な読書のためにナタリー・R.ハミルトンとグラント・F・クジック感謝します。

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この記事のオープンアクセス出版は、ライカMikrosysteme社が主催ました。

「フラッシュおよび凍結」のアプローチは、光遺伝学で、特定の細胞事象を誘導することにより刺激19の後に定義された時点で細胞を凍結することにより、膜のダイナミクスを可視化します。このデモでは、我々は、神経細胞を刺激するために、チャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを使用し、シナプス末端で融合し、シナプス小胞の回復を捕獲しました。近年では、多くの光遺伝学的ツールは、フラッシュおよび凍結と互換性があるすべては、23、22を開発されています。例えば、オルガネラ輸送はクリプトとCIB1 24の光誘起ヘテロを用いて誘導することができます。同様に、原形質膜の脂質組成は、原形質膜25ホスホイノシチドホスファターゼの光誘起転座によって変化させることができます。また、アゾベンゼンCHような小さな、光感受性化合物照明波長に応じアンジュコンホメーション。このコンホメーション変化は、リガンド依存性チャネルを活性化するか、または膜26,27における脂質組成を変更するために使用することができます。ケージド化合物はまた、細胞活性を誘導するために使用することができます。しかし、現在のセットアップに使用されるLEDはアンケージングのために十分なエネルギーを生成しないことができます。このように、システムのさらなる最適化はおそらく必要です。それにもかかわらず、これらの光活性化ツールの用途は柔軟-多くの細胞事象は、光のフラッシュによって誘導することができるしています。 「フラッシュと凍結は、」得られた膜のダイナミクスをキャプチャすることができます。 「フラッシュおよび凍結」方法には2つの主な制限があります。まず、それは別の細胞から特定のイベントの「スナップショット」をキャプチャします。言い換えれば、時間をかけて一つのセル内膜のダイナミクスを追跡することはできません。このように、あらゆる細胞の再構築のためにもT、一つは各試料から、各時点で多数の画像を取得し、分析しなければなりません。マウス海馬ニューロンにおけるシナプスの30％の18、28 -シナプス小胞の融合がわずか20に場所を取るので、ニューロンにおいて、画像のより大きな数が必要です。このような大規模なデータセットの分析は、時間の膨大な量を必要とします。将来的には、画像取得と解析が29、30のアプローチは、より効率的にするために自動化する必要があります。 第2の制限は、高圧凍結技術の性質によって課されます。細胞が凍結するとき、細胞水が凍結速度は100 K / sの21未満である場合に氷結晶を形成するために再配置します。これらの氷晶は、膜を貫通または膜の破裂をもたらす、局所浸透圧を変えるための溶質を濃縮することができます。氷の結晶を避けるために、HIGH圧力（約2,000気圧）試料に適用されます。過冷却効果により、100 K /秒の凍結速度は、この圧力21で氷晶の形成から水を防止するのに十分です。理論的には、試験片として厚さ500μmの氷結晶なしで凍結することができるが、氷の立方体の形態が形態を損なう、厚い組織に形成される傾向があるように200μm程度は、おそらく実用的限界です。 5ミクロンより厚い試料を処理するときに、BSAなどの適切な凍結保護剤の使用は、必要です。しかし、BSAは、溶液の浸透圧を変化させると、細胞の生理学的応答に影響を及ぼし得ます。したがって、広範囲の対照実験は、特定のシステムにおけるBSAの使用を検証するために必要とされます。試料は誤っ液体窒素浴から除去された場合に氷結晶はまた、高圧凍結後に形成することができます。このように、すべての回で、液体窒素中に標本を維持するとの予冷した鉗子を使用することが重要ですそれらを操作。 実験を計画する場合は、以下の3点を考慮する必要があります。 8.0ミリワット/ mm 2で-まず、光の最大強度（460 nmのライン）が5.5です。この強度は活性を誘導するのに十分であるかどうかをフラッシュし、凍結実験に先立って、蛍光顕微鏡でのライブセルイメージングを用いて検証する必要があります。第二に、実験は、生理的な温度で行われなければなりません。高圧フリーザーの段階は、マウス海馬ニューロン31との実験のために37℃まで加温します。最後に、時間ポイントは慎重にメンブレンダイナミクスをキャプチャするために選択されなければなりません。初期の研究は、エンドサイトーシスが刺激の100ミリ秒後に完了していることが示されました。したがって、三つの追加の時点（15、30、および50ミリ秒）は、膜ダイナミクス17、18に従うように調べました。これらの時点は膜輸送のイベントを可視化するために必要でしたシナプス伝達中の。しかしながら、時間点の数のための要件は、各細胞事象で異なります。そのため、いくつかの時点では大規模なデータセットの収集を開始する前にサンプリングする必要があります。

細胞内膜およびタンパク質動態を可視化することは、特定のプロセスの細胞生物学を理解することに向けた重要なステップです。ダイナミックな人身売買のイベントは、光や蛍光顕微鏡を用いて撮影することができます。細胞内構造は完全に色素または蛍光プローブにより「塗装」と空間的およびスペクトル1,2解決できないのでしかし、細胞内のコンテキストは、主にこのような画像に欠けています。電子顕微鏡は、絶妙な詳細に亜細胞アーキテクチャを描くことができながら、試料を撮像する前に固定しなければならないので、一方、それは、細胞ダイナミクスを捕捉することができません。したがって、典型的には、完全にのみ1つの撮像モダリティを使用して細胞のダイナミクスを理解するのに十分ではありません。 光と電子顕微鏡の限界を克服するために、相関顕微鏡技術が開発されています。相関光と電子顕微鏡（CLEM）は、光学顕微鏡と電子顕微鏡との根本的な細胞内構造を使用して細胞内動態を可視化します。 CLEMでは、そのような分裂およびエンドサイトーシス3、4、5、6のような様々なプロセス、に従事した細胞は、ライブ画像化され、その後、電子顕微鏡のために処理されます。 CLEMは、細胞内ダイナミクスの特定の側面をキャプチャしますが、このアプローチの有用性を制限する4つの要因があります。固定剤7の遅い拡散および反応による分-まず、時間分解能は、細胞は、典型的には、Sをとる、固定化することができる方法を迅速によって制限されます。第二に、細胞内のアーキテクチャは、8 事後観察されます。従って、動的形態学的変化は、このアプローチを使用してキャプチャすることができません。第三に、蛍光および電子顕微鏡写真は、正確に起因する組織SHに整列することはできません電子顕微鏡9、10のためのサンプル調製時の脱水によって引き起こさrinkage。第四に、細胞質分裂およびエンドサイトーシスなどのイベントは、すべてのセル5、11で同時に行われていない、ため、イベントに従事している特定の細胞は、細胞の大集団から識別されなければなりません。このプロセスは、多くの場合、面倒です。従って、新しい方法は、すべてのセル内の特定のイベントを誘発することと定義された時点での細胞の急速な固定化によって得られた細胞ダイナミクスを捕捉する必要があります。 最近、いくつかのツールは、光（光遺伝学）を使用して、特定の細胞動態を誘導するために開発されています。チャネルロドプシンは、 コナミドリムシ 12、13から単離された感光性、非選択的カチオンチャネルです。チャネルロドプシンはneuronaで発現された場合L膜は、光の短いフラッシュは、ニューロンへのナトリウムイオンの流入を誘導し、14、15の潜在的作用を誘発します。活動電位は、その後、シナプス小胞18はしたがって、チャネルロドプシンは、神経活動を誘導し、ミリ16、17内に融合シナプス末端へ伝播します。シナプス末端膜のダイナミクスを追跡するために、ニューロンはミリ秒精度での刺激後に定義された時点で固定化されなければなりません。 神経活動を誘導した後の膜のダイナミクスをキャプチャするために、我々は、高圧凍結17、18、19で光刺激を結合しました。高圧凍結を低減氷晶形成20を有する細胞のほぼ瞬間的固定化を可能にします。氷の結晶CAN膜を破裂させ、細胞内のアーキテクチャ21を混乱させる。刺激および凝固の間の時間間隔を変化させることにより、シナプス端末内膜輸送は、活動電位の誘導後に捕捉しました。 ここでは、そのカップル、高圧凍結と光刺激のミリ秒時間的な制御を商品化し、高圧の冷凍庫を使用して実験手順を示しています。光刺激及び凝固を制御する外部装置を必要とする他の機器とは異なり、光刺激は完全にこのシステムに統合され、MSの精度19を適用することができます。このプロセスは複数のステップを必要とします。 1）マウスの海馬ニューロンは、サファイアディスク上で培養し、チャネルロドプシン18のための発現ベクターを保有するレンチウイルスに感染しています。 2）ニューロンが刺激され、刺激後定義された時点で凍結されています。 3）ガラス化水で代替され有機溶媒とD、脂質及びタンパク質は、細胞内のアーキテクチャを維持するために固定剤によって架橋されています。 4）サンプルをエポキシ樹脂に浸透し、埋め込まれています。 5）超薄切片をウルトラミクロトームを使用して収集されます。 6）薄切片を透過型電子顕微鏡で撮像されます。 7）画像取得及び分析は、時間点又は遺伝子型に対して盲目的に行われます。細胞動態は、時間分解画像17、18の再構成によって決定することができます。サンプル調製は、（2ステップ - 上記5）の週が必要ですが、その後の画像解析は、年に数ヶ月を要します。

<table><tbody><tr><td>凍結置換・低温埋込装置&nbsp; 光学・電子顕微鏡用 -AFS II</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高圧冷凍庫 - EM-ICE</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>EM ICEは、光刺激と凍結を精密に制御できる特殊な高圧冷凍庫です。</td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>ゴノテック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム UC7</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>ブルーM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ペルソナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>EMS</td><td>16530</td><td></td></tr>四<tr><td>酸化オスミウム</td><td>EMS</td><td>RT19132</td><td>有毒、認定化学フードの下でのみオープン</td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>エムドミリポア</td><td>391340-250GM</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>49159-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>746436-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ></td><td>シグマ</td><td>21115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>J.T.ベイカー</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>液状エポキシ樹脂 エポネート 12</td><td>テッドペラ</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>ビスフェノールAエポキシ樹脂 アラルダイト 502</td><td>テッドペラ</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>無水コハク酸ドデセニル (DDSA)</td><td>テッドペラ</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>ベンジルジメチルアミン (BDMA)</td> <td>テッドペラ</td><td>18241</td><td></td></tr><tr><td>特殊埋め込み (BEEM) カプセル</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>銅グリッド</td><td>テッドペラ</td><td>1GC12H</td><td></td></tr><tr><td>ポリ酢酸ビニル (Pioloform F)</td><td>Ted Pella</td><td>19244</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>エチルシアノアクリレート (瞬間接着剤)</td><td>スコッチ</td><td>170497</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Themo scientific</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Thermo scientific</td><td>10569-044</td><td>37°Cに温める必要があります。C 使用前の</td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td> <td>Thermo scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>フルオロデオキシウリジン (FUDR)</td> <td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td>S175223</td><td>酸洗浄</td></tr><tr><td>サファイアディスク</td><td>Technotrade</td><td>616-100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸酸</td><td>Emdmillipore</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン</td><td>Thermo scientific</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>フィッシャー</td><td>10888022</td><td>37°Cに温める必要があります。C使用前のL</td></tr><tr><td>-アラニル-L-グルタミン(グルタマックス)</td><td>フィ</td><td>ッシャー35050-079</td><td></td></tr>セラ<tr><td>ウムフリーサプリメント&nbsp;(B-27)&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワーシントン</td><td>LS003126</td><td>アクティブユニットは、各バッチについて計算する必要があります</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>サーモミキサー C</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>トクリス</td><td>03-731-0</td><td></td></tr><tr><td>ビキュリン</td><td>トクリス</td><td>01-091-0</td><td></td></tr><tr><td>ワットマン I 濾紙</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>フィリップス CM20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

細胞は、絶えず彼らの膜構造およびタンパク質分布を変更するが、それぞれ、MSおよびナノメートルのオーダーの時間および空間分解能でこれらのイベントを視覚化することは極めて困難です。私たちは、光遺伝学と細胞事象を誘導し、刺激後定義された時点で細胞を凍結することにより得られた膜の動態を可視化する時間分解電子顕微鏡技術、「フラッシュや凍結を」を開発しました。この技術を実証するために、我々は、マウスの海馬ニューロンにおけるチャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを発現しました。光のフラッシュは、ニューロン活動を刺激し、シナプス小胞の融合を介してシナプス終末からの神経伝達物質の放出を誘発します。ニューロンの光遺伝学的刺激は、シナプス伝達中の形態学的変化に追従して高圧凍結に連結されています。商業用器具を用いて、我々は、シナプス小胞の融合とSYNAの回復を捕獲しましたPTIC小胞膜。形態学的変化を時間をかけて別の細胞に続いていたので、一連のイベントを可視化するために、大規模なデータセットは、生成され、盲目的に分析しました。それにもかかわらず、フラッシュや凍結はミリ秒の時間分解能を持つ電子顕微鏡写真でメンブレンダイナミクスの可視化を可能にします。

上記のプロトコルを使用して、我々は、チャネルロドプシンを発現するマウス海馬神経細胞に「フラッシュおよび凍結」の実験を行いました。これらのニューロンは、光発症後15ミリ秒または100ミリ秒のいずれかを凍結しました。我々は以前に18それぞれ、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、15ミリ秒と100ミリ秒の時点でシナプス末端で起こることを示しています。これらのイベントは、正常にフラッシュおよび凍結実験がうまく選択を行うことができることを示唆し、適切な時間（ 図2）で撮影した（ 材料の表を参照）高圧フリーザーを専門。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> 高圧冷凍庫図1.サンプル・ロードとプログラミング。高PのA）サンプルローディングテーブルressure冷凍庫。構造の詳細は、挿入図に示す中間プレートは、サンプルローディング用クレム・ホルダー内に配置されます。半円筒の一つは、試料載置台の底部に配置され、他方はトップカバーにクリップで取り付けられています。サンプルがロードされると、中間プレートは、底部半円筒に前方に押され、カバーが凍結を開始するために閉じられます。 B）試料のアセンブリ。ニューロンを含むサファイアディスクは、細胞側を上に向けて、中間プレートのウェル内に配置されます。 100μmの環が直接ウェル内部サファイアディスクの上方に配置されています。その後、生理食塩水に浸漬空サファイアディスクは溶液側と下方に配置されます。気泡は避けなければなりません。最後に、100μmのリングと400μmのリングがぴったりと上方に配置されています。余分な液体を濾紙で除去されます。 C）エポキシ樹脂に浸漬サファイアディスクと埋め込みカプセルの断面図。 SAPP雇うディスクは、細胞側を上に向けて、カプセルの底に配置され、浸潤および埋め込み用エポキシ樹脂で覆われています。単一、10ミリ秒の刺激のための高圧フリーザープログラミングD）。標本は、90ミリ秒の光パルスの後に凍結されています。 E）20 Hzで10の刺激のための高圧フリーザーのプログラミング。標本は5ミリ秒、最後の光パルスの後に凍結されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> マウスの海馬神経細胞におけるエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの2可視化図。海馬の神経細胞は一度刺激され、示された時間で凍結されています。電子顕微鏡写真は、シナプス小胞Aのエキソサイトーシス）及び超高速エンドサイトーシスを表示します<strong&gt; B）。 PSD、シナプス後密度。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

本手順の全体的な目的は、オプトジェネティクスを用いて神経活動を誘導した後、刺激後の定義された時点での細胞を凍結し、電子顕微鏡によって膜ダイナミクスを捉えることです。この手法は、シナプス小胞のリサイクリング機構に関する神経科学および細胞生物学における重要な疑問への回答や、極めて迅速な時間スケールでのモデリングに役立ちます。本手法の主な利点は、ミリ秒単位の時間スケールで、細胞内の形態的変化を電子顕微鏡を用いて可視化できることです。本手順は、私の研究室の大学院生であるShuo Liと、研究員であるSumana Raychaudhuriによって実演されます。固定液を準備する前に、検体番号に従って2 mLのクライオバイアルに鉛筆でラベルを貼ってください。次に、すべての固定剤を混合し、固定剤を1 mLずつ各バイアルに分注します。チューブにキャップをした後、直ちに固定剤を液体窒素に浸し、バイアルを密閉された発泡スチロール箱に入れて保存します。続いて、自動凍結置換装置と高圧凍結機に液体窒素を満たします。次に、アセトンの入った小さな容器を凍結置換装置の試料室に入れ、置換装置の温度が-90°Cに達するまで待ちます。光刺激プロトコルをプログラムするには、タッチスクリーンモニターの光刺激ウィンドウにある編集をクリックします。別のウィンドウが開きます。暗期に15秒、周期に100ミリ秒、パルスに10ミリ秒、そして1回の10ミリ秒刺激あたりの周期数に1を入力します。メイン画面で、「light stimulation」ボックスにチェックが入っていることを確認し、「specimen storage」をクリックしてから「edit」を選択します。新しいウィンドウで、プラスまたはマイナスボタンを使用して、各チャンネルに2つずつ計2つの検体を保存するように選択し、「storage liquid nitrogen enabled」が選択されていることを確認します。次に、実体顕微鏡の下で、サファイアディスクセルをセル面を上に向けた状態で、ミドルブラックプレートのウェルに配置します。続いて、100 micronのスペーサーリングを配置します。ブランクのサファイアディスクの一面を、あらかじめ温めておいた生理食塩水に浸し、生理食塩水に浸した面を下にしてスペーサーリングの上に置きます。さらに別の100 micronのスペーサーリングを配置します。最後にサファイアディスクの上に400 µmのスペーサーリングを載せ、フィルターペーパーを用いて余分な液体を取り除きます。サンプルを保持する際、サファイアディスクの間に気泡が閉じ込められないように注意してください。その後、アセンブリ全体を2つの透明な半円筒の間に配置し、上部の赤いカバーを閉じて凍結プロセスを開始します。凍結プロセスが完了すると、赤いカバーが自動的に跳ね上がります。すべてのサンプルの凍結が完了したら、保存用デュワーのドアを開け、デュワーをベンチトップに移動させます。検体チャンバーを保存用デュワーから、液体窒素を満たした専用のサンプル用トレイに移してください。ノブを解除して試料カップを取り出します。次に、液体窒素で冷却したピンセットを使用して、試料カップから透明な半円筒形パーツを取り除きます。そして、中央の黒いプレートを、液体窒素を入れた小型カップに慎重に移動させます。凍結サンプルは常に液体窒素中に保持し、サンプルの取り扱いには常に予冷したピンセットを使用するように注意してください。ピンセットを再度予冷し、最初の中間プレートを迅速に予冷したアセトンに転移させます。プレートを静かに振ったり叩いたりして、サファイアディスクをプレートから分離させます。次に、固定液を入れた蓋のない凍結保存用バイアルを置換装置の検体チャンバーに入れます。サファイアディスクをバイアルに移し、直ちにバイアルに蓋をします。すべての試料の移送が完了したら、適切な自由置換プログラムのパラメータを設定し、プログラムを開始します。自由置換プログラムの終了後、手袋を使用して極低温ファイルを試料チャンバーから薬品用フードへ移送し、ピペットを用いて各バイアルに室温のアセトンを加えます。1〜2時間の間に、各バイアル内の洗浄液を新しいアセトンで4〜6回交換してください。次に、調製したばかりの30%エポキシ樹脂を各バイアルに加え、室温のオービタルシェーカー内で120 rpmで2〜3時間インキュベートします。インキュベーション終了後、30%エポキシ樹脂を70%エポキシ樹脂に 교体し、オービタルシェーカー上で3〜4時間インキュベートします。その後、ピンセットを用いて各ディスクを細胞面を上にして包埋カプセルのキャップに移し、90%エポキシ樹脂をディスクに加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、各サファイアディスクを新しい包埋カプセルのキャップに移し、作りたての100%エポキシ樹脂をキャップに満たします。最後の100%エポキシ樹脂によるインキュベーション後、サンプルを60 °Cのオーブンで48時間重合させます。サンプルの重合が完了したら、最初のサンプルを実体顕微鏡の上に逆さまに置き、サファイアディスクが樹脂ブロックの最上部にくるようにして、カミソリでサンプルの上部から樹脂の薄い層を取り除きます。次に、カミソリの刃を使用してディスクの縁に沿って浅く切り込みを入れ、サファイアディスクをエポキシ樹脂から切り離します。その後、ディスクを液体窒素に約10秒間浸し、ディスクを樹脂の残りの部分から分離させます。樹脂を解剖顕微鏡下に移し、サンプルを顕微鏡ステージにテープで固定します。4倍から10倍の倍率を用いて細胞のある領域を探し、両刃カミソリを使用して、目的領域の周囲を2 mm × 2 mmのサイズに切り出します。次に、シアノアクリレート系接着剤を用いて、エポキシ樹脂製の円筒形ダミーブロックに細胞を固定し、このブロックを60 °Cで1時間インキュベートします。ウルトラミクロトームで薄切した後、サンプルを透過型電子顕微鏡に移し、930,000倍の倍率で観察します。この画像では、マウス海馬ニューロンのシナプス前膜の活性領域において、光照射から15ミリ秒後に記録されたエキソサイトーシスによるシナプス小胞の融合が示されています。光照射から100ミリ秒後には、活性領域に隣接してエンドサイトーシス小穴が観察でき、神経細胞による超高速エンドサイトーシスが示されています。このビデオを視聴することで、フラッシュ＆フリーズ実験を用いたサンプルの処理方法について十分に理解できるはずです。グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、および液体窒素の取り扱いは非常に危険であるため、必ず保護衣を着用してください。習熟すれば、本手順の凍結工程は12サンプルあたり数時間で完了しますが、イメージングおよび画像解析を含む残りの工程には、数日から数週間、あるいは数ヶ月かかる場合があり、非常に長期的な手順となる可能性があります。タンパク質の局在化やダイナミクスの可視化を行う場合は、抗原性や真珠光沢タンパク質の光沢を維持するための異なるプロトコルを用い、これらの手法でダイナミクスを可視化することも可能です。

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Research

JoVE Journal

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