Name: 細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 学ぶ 心血管組織の細胞外マトリックス糖タンパク質の質量分析法による部位特異的糖鎖解析手法。逐次抽出とエンリッチメントにより線維化の分子メカニズム解明に貢献する。

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JBBは王の英国心臓財団センターでのキャリア構築フェローです。 MMは、英国心臓財団（FS / 13/29892分の2）のシニアフェローです。研究は優秀イニシアティブ（優れた技術のためのコンピテンス・センター - COMET）によってサポートされていましたオーストリアの研究振興事業FFGの「血管における優秀研究センターエイジング - チロル、VASCage」（K-プロジェクト番号843536）とNIHR生物医学研究をキングスカレッジ病院との提携でガイさんとセントトーマスの国民保健サービス財団トラストとキングス・カレッジ・ロンドンを拠点センター。

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</ol>

このプロテオミクスプロトコルは、我々の研究室で過去数年間に最適化されています。ここでは、心臓組織を使用したが、わずかな調整は、他の組織への適用のために必要となる場合があります。例えば、抽出プロトコルを考慮に組織の細胞性を取る必要があります。心臓組織、血管組織と比較して高い細胞です。血管組織を使用する場合、SDS濃度が低い（ すなわち、0.08％）であることができ、脱細胞化時間が短い（ すなわち 4時間）11、12、13です。脱グリコシル化酵素の使用は、ECM組成物のLC-MS / MS分析のために重要です。しかし、インキュベーション時間は、異なる組織タイプのために調整する必要があります。 （データは示していない）（ 例えば、アグリン、パールカン）基底膜タンパク質が豊富で皮膚などのサンプルを使用する場合、例えば、25℃でII必要拡張インキュベーション時間をヘパリナーゼ。直接糖ペプチド解析は、培養液15中の細胞からの馴化培地上で実行することができます。濃縮手順は、この単純化されたsubproteomeの分析のために必要とされない場合があります。 GuHCl抽出物と同様に、NaClの抽出物はまた、小さな変更を有するグライコプロテオミクス分析のために適しています。 ECMタンパク質の濃縮のための他の抽出プロトコルは、ECM糖ペプチド19、20を特徴付けるために適合させることができます。 グリコシル化は、最も複雑なPTM 5です。糖ペプチドの間接的な同定は、NXT / Sのシークオンに組み込ま18 Oで脱アミド化Asnでの検出によって達成されます。他の位置で脱アミド化Asnが偽陽性を表すことができます。同様に、Nグリコシル化は、タンパク質オントロジーの文脈で考慮されなければならない：NXT / Sのシークオンを含む細胞内タンパク質はグリコシル化されることはありませんが、偽陽性を生じる可能性があります。現在searcとして、Hアルゴリズムは所定の配列のみ（NXT / Sで、すなわち ASN）でのPTMのスクリーニングを可能にしない、データの手動フィルタリングが必要とされます。これらの位置でのグリコシル化の存在/非存在の同定は、疾患と対照試料間で比較することができます。 O-脱グリコシル化のためのPNGアーゼFへの酵素と同等（ すなわち、トレオニンまたはセリンに質量シフトを導入する）が存在しません。従って、O-グリコシル化の同定は、直接糖ペプチドの分析に限定されます。直接グリコペプチド解析は、タンパク質に付​​着した糖の組成情報を得るために使用されるが、グリカンの構造的な情報を提供しません。また、グリカン組成物は、分泌後のグリカン合成およびプロセシングの結果です。 ECMタンパク質のための私達の3段階抽出法（「英語クイックステップ」）6は、心臓血管組織の様々なECMを特徴付ける可能にしました。組織の分別他所6論じたように、いくつかの抽出に簡略化されたECMプロテオームを得るために必要とされます。細胞内タンパク質は、そうでなければあまり豊富ECMタンパク質の同定を妨げる抽出物中のタンパク質の存在量の過剰なダイナミックレンジに貢献します。また、細胞内タンパク質は、ECM糖ペプチドの濃縮及びその後のMS分析を複雑になるO -グリコシル化5を運びます。他の著者は、しかし、彼らはグリコシル化の分析を追求していなかった、例の肺21と軟骨組織10のために特徴付けるために同様の抽出方法論を適用します。 glycositesの識別に焦点を当てたグリコシル化の前の分析は、タンパク質コアからのグリカンの除去を必要とし、O-グリコシル化22、23を評価することはできません。レクチンアレイと化学濃縮は、グリカン標準の評価のために用意されてい生物学的サンプルのESは、それらの結合特異性に基づいて、これらの技術は、特定のタンパク質24にグリカンタイプを割り当てることができないも、彼らは、グリコシル化部位を評価することができます。 最初に、我々は、従来のECMタンパク質のLC-MS / MSにゲル電気泳動を使用します。ゲル分離は、LC-MS / MS分析に適し簡略化されたタンパク質画分を得る上で有用であるが、最新の機器は、より速いスキャン速度を提供します。このように、電気泳動分離工程を省略することができます。ゲルの上に保持されている大型のECMタンパク質は、より効率的に分析され、これは付加的な利点を提供します。しかし、完全なタンパク質のMwに関する情報が失われます。 PNGアーゼF脱グリコシル化前に蒸発工程は、偽陰性を最小限に抑えるために、通常のH 2 Oの完全な除去を保証します。糖残基（ すなわち、可変グリカン質量）LCによる分離に干渉し、MS / MSによって後続ペプチド同定を損ないます。 P- 脱グリコシル化プロトコルはまた、グリコシル化に焦点を当てていないECMタンパク質のプロテオミクス解析のために推奨されます。 プロテオミクスはECMに前例のない洞察を提供することができます。構造的な支持を超えて、ECMに添付グリカンは、臓器移植後の同種移植片拒絶反応、 すなわち宿主-病原体相互作用、細胞間コミュニケーションと免疫応答25のために不可欠です。グライコプロテオミクスは糖鎖生物学に不可欠なツールとなるでしょう。

線維症は、多くの疾患の特徴です。線維芽細胞が増殖し、細胞外マトリックス（ECM）1の悪化分泌および沈着に関連している高度に合成表現型に向かって分化します。過剰なECM沈着は、機能障害につながる、最初の損傷が弱まった後でも、続けることができます。プロテオミクスを使用して、我々は以前に心臓組織2、3で150以上のECMとECM関連タンパク質を同定しました。彼らは唯一の構造タンパク質ではなく、また、継続的な改造や心臓のダイナミックな適応に貢献マトリックス細胞タンパク質およびプロテアーゼ。特に、多くのECMタンパク質が4グリコシル化されています。この翻訳後修飾（PTM）は、特定のアミノ酸位置への糖残基の付加を伴い、それが結合、タンパク質の折り畳み、溶解度に影響を与え、劣化5 </s&gt;アップ。 哺乳類で発生する二つの主要なグリコシル化のタイプがあります。 （1）N-グリコシル化は、Xaaは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、コンセンサス配列はAsn-Xaaは、Thrで/ SER内のアスパラギン残基（ASN）のカルボキサミド窒素で起こります。 （2）O-グリコシル化において、糖残基ヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンするために、はるかに少ない程度に、セリンおよびトレオニン残基（セリン、Thrで）に付着又は。 O-グリコシル化は、タンパク質グループの様々な起こり得るが、N-グリコシル化は、分泌タンパク質または膜タンパク質5の細胞外ドメインに制限されています。 ECMを勉強するときに、N-グリコシル化に魅力的な標的になります。 プロテオミクスは、疾患におけるタンパク質の変化を分析するための新しい標準を設定します。これまでのところ、ほとんどのプロテオミクス研究では、細胞内タンパク質6に焦点を当ててきました。これは、主に次のような理由によるものです。まず、豊富な細胞内タンパク質は、同定を妨げます希少なECM成分の品名。これは、ミトコンドリア及び筋フィラメントタンパク質は、タンパク質含有量7の大きな割合を占めた心臓組織において特に重要です。第二に、一体型ECMタンパク質が重く架橋および可溶化することは困難です。最後に、豊富のPTM（ すなわち、グリコシル化）の存在は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）による分離及び同定の両方に影響を与える、分子量、電荷、及びペプチドの電気泳動特性を変化させます。ここ数年、私たちは、その後の質量分析（MS）分析と互換性のあるECMタンパク質のための逐次抽出および濃縮法を開発し、改善しています。戦略は、順次インキュベーションに基づいています。 最初のステップをNaCl、ECM関連し、緩く結合したECMタンパク質、ならびに新たに合成されたECMタンパク質の抽出を容易にイオン緩衝液を用いて行われます。それは私S洗剤フリー、非変性、細胞膜の無停止、およびさらに生化学的アッセイのために8やすいです。次いで、脱細胞化は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いて達成されます。この段階で、低いSDSの濃度は、膜不安定化及びより可溶性非整数ECM成分の破壊を防止しながら、細胞内タンパク質の放出を確実にします。最後に、ECMタンパク質をグアニジン塩酸塩緩衝液（のGuHCl）で抽出します。 GuHClは、腱9、軟骨10、容器11、12、13及び心臓2、3のような組織から高濃度架橋タンパク質およびプロテオグリカンを抽出するのに有効です。私たちは、心血管疾患2にECMリモデリングを探るために、LC-MS / MSとの組み合わせで、この生化学的分別を適用しました<sup&gt;、3、11、12、13、14。 MSの最近の進歩は、無傷の糖ペプチド3、15の直接分析を可能にするより高いエネルギーの衝突解離（HCD）および電子移動解離（ETD）の組み合わせ、などの新規な断片化方法が挙げられます。 ここでは、タンパク質組成物、グリコシル化部位の同定、およびグリカン形態の特性の分析を可能にするMS分析のためにECMを調製する方法を記載しています。 ECMのグリコシル化16の以前の分析と比較すると、この方法論は、MSを用いた部位特異的にグリコシル化プロファイルの組成変化を直接評価することができます。私たちは、心血管組織にこの方法論を適用しています。しかし、それができアルので、他の組織標本におけるECMの研究に、わずかな変更で、適用されるとECMの生物学に前例のない洞察を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>A. 化学薬品</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、MSグレード&nbsp;(ACN, C2H3N)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51101</td><td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤のカクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>1.3,&nbsp; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム (Na2H2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>3.1</td></tr><tr><td>ジチオトレイトール (DTT, C4H10O2S2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>4.3</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA, C10H16N2O8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>1.3,&nbsp;1.4.1、1.5.1、1.6.1</td></tr>エ<tr><td>タノール(C2H6O)</td><td>VWR</td><td>437433T</td><td>2.2.1</td></tr>塩<tr><td>酸グアニジン(GuHCl、CH6ClN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>グリセロール(C3H8O3)</td><td>Acros有機物</td><td>158920025</td><td>供給1.1</td></tr><tr><td>H2O LC-MS Cromasolv</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td>プロトコル全体</td></tr><tr><td>H218O</td><td>大陽日酸</td><td>FO3-0027</td><td>3.5</td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン (HA, H3NO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td>6.4</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAA, C2H4INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td>4.4</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10x</td><td>Lonza</td><td>51226</td><td>1.3</td></tr>酢<tr><td>酸ナトリウム(C2H3NaO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7545</td><td>1.6.1</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>1.4.1、3.2</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS, NaC12H25SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466143</td><td>1.5.1</td></tr><tr><td>重炭酸トリエチルアンモニウム (TEAB, C7H17NO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11268</td><td>4.7, 6.1</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA, C2HF3O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T62200</td><td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2,3</td></tr><tr><td>チオ尿素 (CH4N2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>4.2</td></tr><tr><td>トリス-塩酸塩 (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>1.4.1, Suppl 1.</td></tr><tr><td>尿素 (CH4N2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Name</td><td> Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>B. 酵素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;2-3,6,8,9-ノイラミニダーゼ (シアリダーゼ)</td><td>EDM ミリポア</td><td>362280 (KP0012)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&beta;1,4-ガラクトシダーゼ</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0004)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&beta;-N-アセチルグルコサミニダーゼ</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0013)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Chondroitinase ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3667</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Endo-&α;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0011)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Heparinase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6512</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Keratanase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6920</td><td>3.1</td></tr><tr><td>PNGase-F (N-グリコシダーゼF)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0001)</td><td>3.5</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td>4.7</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>C. 試薬キット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO スピンフィルター&nbsp;</td><td>Amicon, Millipore</td><td>10256744</td><td>5.9, Suppl 2</td></tr><tr><td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5657</td><td>5.1</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex BisTris アクリルアミドゲル</td><td>Thermo-Scientific</td><td>NP0322PK2</td><td>Suppl 1</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td><td>Merk Millipore</td><td>72103</td><td>7</td></tr><tr><td>タンデム質量タグ 0 (TMT0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>900067</td><td>6.2, 6.3</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>D. 機器およびソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap100 C18 トラップ、5 mm x 300 & マイクロ;メートル、5、マイクロ;メートル、100&Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 &micro;メートル、3、マイクロ;メートル、100&Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Byonic Search Engine</td><td>Protein Metrics</td><td>Version 2.9.30</td><td>Suppl 5</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td><td>Thermo Scientific</td><td>n/a</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray イオン源&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES081</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&nbsp; 50 cm x 75 &micro;メートル、2 &ミュー;メートル、100&Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES803</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Mascot Search Engine</td><td>Matrix Science</td><td>Version 2.3.01</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>Version 2.1.1.21</td><td>Suppl 3, 5</td></tr><tr><td>Picoview Nanospray Source</td><td>New Objective</td><td>550</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Q Exactive HF 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 濃縮器</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td></tr><tr><td>スキャフォールドソフトウェア</td><td>Proteome Software&nbsp;</td><td>バージョン4.3.2</td><td>補遺3</td></tr></tbody></table>

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

線維症は、多くの心血管疾患の顕著な特徴であり、細胞外マトリックス（ECM）の悪化分泌および堆積に関連しています。プロテオミクスを使用して、我々は以前に、心血管組織における150以上のECMとECM関連タンパク質を同定しました。特に、多くのECMタンパク質は、グリコシル化されています。この翻訳後修飾は、タンパク質の折り畳み、溶解性、結合、および劣化に影響を与えます。我々は、無傷の糖ペプチドのその後の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）分析に対応しているECMタンパク質に対する逐次抽出及び濃縮方法を開発しました。戦略は、組織の脱細胞化、およびECMタンパク質の可溶化のための塩酸グアニジンのためにNaClを、SDSによる逐次インキュベーションに基づいています。 LC-MS / MSにおける最近の進歩はを可能にするような、より高いエネルギーの衝突解離（HCD）および電子移動解離（ETD）の組み合わせのような断片化方法を、含みますECMタンパク質の糖ペプチドの直接の組成分析。本論文では、組織サンプルからECMを調製する方法を記載します。この方法は、タンパク質プロファイリングもMS分析による評価およびグリコシル化の特徴付けのためにできるだけでなく。

プロトコルの概略的なワークフローを図1に提供されます。 ECM抽出プロトコル抽出の効率は、アリコートを実行することによってモニターすることができるビス - トリスアクリルアミドゲル上の各抽出物を形成し、視覚化のために銀染色を用いました。 図2Aは、逐次抽出後のNaCl、SDSとのGuHCl抽出物の相補性を示します。このQCは、過剰なタンパク質分解などのサンプル品質の潜在的な問題の識別を可能にします。抽出後、ECM糖タンパク質は、のGuHCl抽出物（ 図2B）において豊富です。 脱グリコシル化脱グリコシル化の効率を評価するために、非脱グリコシル化制御は、PAで実行する必要がありますrallel。脱グリコシル化時間は、図3（a）に例示したように、糖残基の完全かつ均質な除去を達成するために適していることがあります。 図3Bは、効率的に小さくN-およびO-結合オリゴ糖を標的化GAGの除去および脱グリコシル化酵素の酵素の添加によって脱グリコシル化試料の代表的な例を示しています。 グライコプロテオミクス NXT / Sのセクオンの占有率を評価するためのプロトコルは、MS（ 図3C）の後ECM糖タンパク質についてのタンパク質配列カバー率を改善し、糖タンパク質の存在の最初のスクリーニングを可能にします。データベースが以前に同定された糖タンパク質を含むようにカスタマイズすることができ、これは、糖ペプチドのための検索時間を短縮するのに役立ちます。 HCD-ETDフラグメンテーションは、ECM gに取り付けられたオリゴ糖の同定および組成特徴付けのために使用されています<html> lycoproteins。 図4Aは、脱グリコシル化（間接的な糖ペプチド分析）の後に18 Oで標識されたペプチドについて得られた代表的なスペクトルを表示します。 図4Bは、ECM抽出物から無傷の糖ペプチド（直接糖ペプチド分析）の分析後に得られたスペクトルの代表例です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> 図1：メソッドの概要。 （A）ECMタンパク質について順次濃縮した後、LC-MS / MS分析は、脱グリコシル化された抽出物に対して行われます。 （B）あるいは、非脱グリコシル化されたECM抽出物をさらに糖ペプチドについて濃縮されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：ECMタンパク質の抽出。 （A）逐次抽出手順（「英語クイックステップ」）から、3つの異なる抽出物は、それらのタンパク質含有量に相補的です。 SDS抽出物は、細胞内タンパク質に富んでいるが、のGuHCl抽出物は、ECMタンパク質の大部分を含んでいます。成功した分別は異なる銀染色パターンにより可視化されます。 （B）ECMタンパク質は、小ロイシンリッチプロテオグリカンのデコリン、バイグリカン及びmimecanとして主SDSおよびNaCl抽出物中のほとんど存在と、のGuHCl抽出物中で検出されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> 図3. Glycの分析osylation。 （A）は、適切なインキュベーション時間は、完全な脱グリコシル化のために必要とされます。例は、糖タンパク質デコリンからのグリコサミノグリカン鎖の除去の間インキュベーション時間の効果を示しています。 （B）ECM糖タンパク質は、大規模で繰り返しグリコサミノグリカン鎖と短い多様なN-およびO-結合オリゴ糖が施されています。イムノブロットの各々の上のレーン1は、未処理の心臓抽出物を表します。レーン2は、グリコサミノグリカンを消化する酵素で処理した抽出物を含んでいます。レーン3のサンプルは、加えて、N-およびO-結合oligossacharidesを除去するための酵素を含みます。ガレクチン-1は、したがって、タンパク質の大きさには変化がない、グリコシル化されていません。リンチM、 らから適応。 図4（C）LC-MS / MS分析では、H 2 18 Oの存在下でPNGアーゼFで処理した試料は、非脱グリコシル化されたサンプルと比較して（右側％）より良好な配列カバレッジを達成します。 DLC-MS / MSによって配列カバレッジを表す緑色領域をアーク。赤い点線は、それらのアミノ酸の位置を示す数字と、glycositesを表します。位置におけるデコリンのグリコシル化の検出211のAsn（N、太字で強調）は、図4に一例として詳細に示されている<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">。この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> 図4. MSによる糖ペプチドの分析。 （A）ECM富化された抽出物にショットガンプロテオミクスアプローチを用いて、糖ペプチドをNXT / Sのセクオン内の脱アミド化アスパラギンの存在によって同定され、18 Oで標識することができる例は、含有デコリンのペプチドに対するHCD MS / MSスペクトルを示します以前のAsn 211にグリコシル化。得られたデータを使用することができますECM糖タンパク質のカスタマイズされたデータベースを作成します。 （B）HCD-ETDフラグメンテーションは、グリコペプチド富化ECM抽出物を分析するために使用されます。 ETD MS / MSスペクトルは、グリカン組成の特徴付けを可能にします。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A.ストック溶液 </td><td></td></tr><tr><td> DTT（ジチオトレイトール、C 4 H 10 O 2 S 2） </td><td> 100のddH 2 Oで1 mMのDTT </td></tr><tr><td> EDTA（エチレンジアミン四酢酸、C 10 H 16 N 2 O 8） </td><td> ddH 2 O、pH8.0中の250mM EDTA。 </td></tr><tr><td> GuHCl（塩酸グアニジン、CH 6 CLN 3） </td><td> 8 MのGuHCl中ddH 2 O. </td></tr><tr><td> IAA（ヨードアセトアミド、C 2 H 4 INO） </td><td> ddH 2 O 1,2における500mMのIAA </td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム（酢酸ナトリウム、C 2 H 3 NaOが2） </td><td> ddH 2 O中1M酢酸Na、pHは5.8。 </td></tr><tr><td> NaCl（塩化ナトリウム、NaCl）で</td><td> ddH 2 O中1MのNaCl </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基（リン酸二ナトリウムのNa 2 H 2 PO 4） </td><td> DD H 2 O、pHを6.8に1 Mリン酸ナトリウム二塩基。 </td></tr><tr><td> SDS（ドデシル硫酸ナトリウム、のNaC 12 H 25 SO 4） </td><td> ddH 2 O 3 1％SDS（35ミリモル） </td></tr><tr><td> TFA（トリフルオロ酢酸、C 2 HF 3 O 2） </td><td> ddH 2 O中の10％TFA（1.2 M） </td></tr><tr><td> TEAB（重炭酸トリエチルアンモニウム、C 7 H 17 </サブ&gt; NO 3） </td><td> ddH 2 O、pH8.5の中での1M TEAB </td></tr><tr><td>チオ尿素（チオ尿素、CH 4 N 2 S） </td><td> ddH 2 Oで3 Mチオウレア</td></tr><tr><td>トリス-HCl（トリス-塩酸（NH 11 C 4 O 3 [塩酸]） </td><td> ddH 2 O、pH7.5中の100mMのTris-HCl。 </td></tr><tr><td>尿素（尿素、CH 4 N 2 O） </td><td> ddH 2 O 9 M尿素</td></tr><tr><td> B.反応バッファー </td><td></td></tr><tr><td> C18クリーンアップ平衡緩衝液</td><td> ddH 2 O中1％ACN、0.1％TFA </td></tr><tr><td> C18クリーンアップカラム洗浄バッファー</td><td> H 2 O中80％ACN、0.1％TFA </td></tr><tr><td> C18のクリーンアップの溶出バッファー</td><td> ddH 2 O中の50％アセトニトリル、0.1％TFA </td></tr><tr><td>脱グリコシル化バッファー（4×） </td><td> 600mMのNaClおよびのddH 2 O、pHは6.8で200mMのリン酸Na。 </td></tr><tr><td> GuHClバッファ4 </td><td> 4 M塩酸グアニジン、50mMの酢酸ナトリウムとのddH 2 O中に25mMのEDTA、pHは5.8。使用前にプロテアーゼ阻害剤のカクテル：100（V V：1）を追加します。 </td></tr><tr><td> NaCl緩衝液4 </td><td> 0.5MのNaCl、10mMのトリス-HClとのddH 2 O中に25mMのEDTA、pHは7.5。使用前にプロテアーゼ阻害剤のカクテル：100（V V：1）を追加します。 </td></tr><tr><td> PBS（1×） </td><td> 1.7 mMのKH 2 PO 4、5mMののNa 2 HPO 4、150mMのNaCl、pH7.4中。使用前にプロテイナーゼ阻害剤カクテル：100（V V：）、25mMのEDTA及び1を加えます。 </td></tr><tr><td>サンプルバッファー（4×） </td><td> 100mMのTris、2％SDS、のddH 2 O、pH6.8の中40％グリセロール、0.02％ブロモフェノールブルー。使用前に10％のβメルカプトエタノールを追加します。 </td></tr><tr><td> SDSバッファー4 </td><td> O. 1の追加のddH 2中0.1％SDSおよび25mM EDTA：100（V：V）プロテイナーゼインヒビターBEFのカクテル鉱石の使用。 </td></tr><tr><td> C.酵素 </td><td></td></tr><tr><td>コンドロイチナーゼABCの5 </td><td> 0.5脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td>ケラタナーゼ5 </td><td> 0.1脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td>ヘパリナーゼII 5 </td><td> 0.1脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9 -ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.025 U / mLの</td></tr><tr><td> β1,4ガラクトシダーゼ5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.015 U / mLの</td></tr><tr><td> β-N-アセチルグルコサミニダーゼ5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.25 U / mLの</td></tr><tr><td>エンドα-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（O-グリコシダーゼ）5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.013 U / mLの</td></tr><tr><td> PNGアーゼF（N-グリコシダーゼF）6 </td><td> 5H 2 18 O中0 U / mLの</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> TEABバッファーで0.01μgの/μL </td></tr><tr><td> テーブルNOTES。 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 -20℃で凍結保存溶液を保管してください。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 IAAは、光から保護し維持しなければなりません。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 SDS容易に&lt;20℃で結晶化します。 1％SDS（原液）の可溶化を促進するために、熱い水道水で緩衝液を温めます。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 4つの抽出バッファは室温で保存することができます。使用前に示されるように、プロテアーゼ阻害剤の広域スペクトルのカクテルを追加します。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 5これらの酵素は、第一脱グリコシル化工程の間に添加されるべきです。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGアーゼFは、第二の脱グリコシル化工程の間に添加されるべきです。 </TD&gt; </tr></tbody></table> 表1：株価ソリューション、反応緩衝液および酵素。このテーブルは、MS分析の前に心臓ECMタンパク質の抽出、（酵素的消化を含む）以降の処理に必要な各ストック溶液を、反応緩衝液の組成を示しています。

本稿では、ECMタンパク質組成物の（1）分析、グリコシル化部位の（2）識別、およびグリカン形態の（3）組成の特徴付けを可能にするMS分析のために心臓血管組織サンプルを調製する方法を記載しています。この方法は、他の組織におけるECMの研究に、軽微な修正を適用することができます。

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

本プロトコルの総合的な目的は、心血管組織における糖鎖付加部位の同定および糖鎖形態の組成特性解析を含む、細胞外マトリックスタンパク質の組成を分析することである。この手法は、心血管疾患における構造マトリックスの糖鎖付加が組織の線維化にどのように影響するかなど、組織線維化の過程における重要な疑問への回答に寄与することができる。本手法の主な利点は、全体的な糖鎖付加の変化を分析する従来のプロトコルとは異なり、構造マトリックスタンパク質の特定の部位における糖鎖付加の特性解析が可能であることであり、より標的を絞った後続のメカニズム研究のためのツールを提供する点にある。手順の実演は、当研究室のMarika Fava博士とFerheen Baig氏が行います。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、すべての抽出バッファーを準備してください。次に、メスを使用して、20〜50 mgの組織を約2 mmサイズの3〜4個の小さな断片に細かく切断します。細切にした組織を1.5 milliliterチューブに入れ、氷冷したPBSを500 microliters加えます。血液による汚染を最小限にするため、500 microlitersのPBSを用いて組織を5回洗浄します。洗浄したサンプルをスクリューキャップ付きの1.5 milliliterチューブに移し、組織重量の10倍量の塩化ナトリウム緩衝液を加えます。室温で1時間、最低速度でボルテックスします。次に、抽出液を新しい遠心チューブに移し、4°Cで10分間、16,000 ×gで遠心分離します。得られた組織ペレットを新鮮な塩化ナトリウム緩衝液で手短に洗浄します。その後、組織重量の10倍量のSDS緩衝液を加え、室温で16時間、最低速度でボルテックスします。抽出液を新しい遠心チューブに移し、4°Cで16,000 ×g、10分間遠心分離します。得られたペレットを二回蒸留水で洗浄します。組織重量の5倍の量のグアニジン塩酸塩緩衝液を加え、室温で72時間、最大速度でボルテックスします。得られた抽出液を新しいチューブに移し、4°Cで16,000 ×gで10分間遠心分離します。タンパク質の定量後、糖鎖修飾部位の占有率評価用に各サンプルから10 µgを新しいチューブに分注し、直接的な糖ペプチド分析用に50 µgを別のチューブに分注します。それぞれに10倍量のエタノールを加え、20 °Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルを4 °Cで16,000 ×g、30分間遠心分離します。沈殿したペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去します。次に、真空濃縮機を用いて、室温で15分間ペレットを乾燥させます。調製した脱糖鎖緩衝液を各サンプルに10 µL添加します。サンプルチューブを50 mLコニカルチューブに入れ、25 °Cで2時間、45度の角度でインキュベートします。その後、温度を37 °Cに上げ、緩やかに攪拌しながら36時間インキュベートします。16,000 ×gで1分間遠心分離した後、室温で真空濃縮機を用いて45分間、水を蒸発させます。乾燥したサンプルを、50 units/mLのPNGase Fを含む10 µLのO-18標識水で再懸濁します。37 °Cで絶えず攪拌しながら36時間インキュベートし、次にすべてのサンプルに対して液相でのトリプシン消化を行い、C-18クリーンアップに進みます。まず、レジンを活性化させるため、C-18スピンプレートの各ウェルに200 µLのメタノールを加えます。1,000 ×gで1分間遠心分離します。次に、各ウェルに200 µLの80% ACNおよび0.1% TFA水溶液を加え、1,000 ×gで1分間遠心分離します。次に、1%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに200 µLずつ加え、1,000 ×gで1分間遠心分離します。この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返します。その後、サンプルをスピンプレートのウェルにロードし、1,500 ×gで1分間遠心分離します。流出液を再度ロードし、遠心分離を繰り返します。次に、1%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに200 µLずつ加え、1500 ×gで1分間遠心分離します。この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返します。続いて、50%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに170 µLずつ加え、1500 ×gで1分間遠心分離します。この添加と遠心分離をもう一度繰り返します。真空濃縮機を用いて、合わせた溶出液を室温で2時間乾燥させます。乾燥させたサンプルは、使用するまで-80℃で保存します。この後、グリコサイト占有率の評価を目的としたサンプルに対して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を行います。直接的なグリコペプチド分析を目的とするサンプルについては、まずテキストプロトコルに記載されている標準的なTMTゼロラベル化の手順に従ってください。まず、TMTゼロラベル化されたサンプル10 µLに、提供された結合バッファー50 µLを加えます。次に、均質化したglyco capture resin懸濁液を50 µLずつ新しい1.5 mLチューブに分注し、2500 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、ピペットを用いてサンプルと結合バッファー溶液60 µLを樹脂ペレットの入ったチューブに加え、混合します。1200 RPMで攪拌しながら、室温で20分間インキュベートします。2000 ×gで2分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移します。次に、ピペットを使用して各レジンチューブに150 µLの洗浄バッファーを加え、混合して洗浄プロセスを開始します。1200 RPMで攪拌しながら、室温で10分間インキュベートします。2500 ×gで2分間遠心分離した後、各上清を対応する上清保存チューブに移して洗浄を完了させます。この洗浄工程をさらに2回繰り返します。次に、75 µLの溶出バッファーを加え、ピペットで混合します。1200 RPMで撹拌しながら、室温で5分間インキュベートします。2500 ×gで2分間遠心分離し、各上清を新しい1.5 mLチューブに移します。ピペットを用いて溶出バッファー75 µLを加えて混合し、サンプルのインキュベーションと遠心分離を繰り返します。各溶出液を対応するチューブに移します。混合溶出液を2500 ×gで2分間遠心分離した後、レジンを完全に除去するために、各上清を新しいチューブに移します。その後、真空濃縮機を用いて、室温で2時間、溶出液を乾燥させます。乾燥させた糖ペプチドを、超純水で調製した2% ACNおよび0.5% TFA 15 µLで再懸濁します。次に、テキストプロトコルに記載されている通り、質量分析を実施します。本研究では、心血管組織から得られたECMタンパク質を、ECM組成の液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析、ならびに間接的および直接的なグリコペプチド分析のために調製します。基本戦略は、塩化ナトリウム、SDS、および塩酸グアニジンの順次インキュベーションに基づき、その後に間接的または直接的なグリコペプチド分析を行います。抽出効率は、視覚化のために銀染色を施したbis-trisアクリルアミドゲルでモニタリングします。分析した3つの抽出物のうち、ECM糖タンパク質の大部分はグアニジン塩酸塩分画に認められます。ECM糖タンパク質は、大きく反復的なグルコサミン糖鎖とともに、短く多様なN結合およびO結合オリゴ糖で修飾されています。脱糖鎖修飾の効率は、アミノグリコサミノグリカンを消化する酵素および、より小さいN結合型およびO結合型オリゴ糖を標的とする酵素の添加によって確認されます。その後、NXTまたはNXSセクオン内の酸素18で標識された脱アミド化アスパラギンが存在することで、糖タンパク質が同定されます。ここでは、2番目の位置に脱アミド化アスパラギンを持つデコリンペプチドの代表的なHCDタンデム質量スペクトルを示します。次に、HCD ETD断片化を用いて、糖タンパク質を濃縮したECM抽出物を分析します。ETDタンデム質量スペクトルにより、糖鎖組成の特性解析が可能になります。この手法を習得するには、およそ2〜3週間かかる見込みです。このグリコプロテオミクスにより、プロテオミクスの変化だけでなく、糖鎖の組成に基づいた線維化機能の生理学的および病理学的解析が可能になります。このビデオを視聴することで、質量分析を用いたタンパク質糖鎖修飾研究のためのサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。この手法は心血管疾患への洞察を提供しますが、呼吸器疾患や癌など、線維化を伴う他の病理学的状態にも適用可能です。

glycoproteomics-extracellular-matrix-method-for-intact-glycopeptide

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生物化学

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グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

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学ぶ 心血管組織の細胞外マトリックス糖タンパク質の質量分析法による部位特異的糖鎖解析手法。逐次抽出とエンリッチメントにより線維化の分子メカニズム解明に貢献する。

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

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