細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

本プロトコルの総合的な目的は、心血管組織における糖鎖付加部位の同定および糖鎖形態の組成特性解析を含む、細胞外マトリックスタンパク質の組成を分析することである。この手法は、心血管疾患における構造マトリックスの糖鎖付加が組織の線維化にどのように影響するかなど、組織線維化の過程における重要な疑問への回答に寄与することができる。本手法の主な利点は、全体的な糖鎖付加の変化を分析する従来のプロトコルとは異なり、構造マトリックスタンパク質の特定の部位における糖鎖付加の特性解析が可能であることであり、より標的を絞った後続のメカニズム研究のためのツールを提供する点にある。

手順の実演は、当研究室のMarika Fava博士とFerheen Baig氏が行います。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、すべての抽出バッファーを準備してください。次に、メスを使用して、20〜50 mgの組織を約2 mmサイズの3〜4個の小さな断片に細かく切断します。

細切にした組織を1.5 milliliterチューブに入れ、氷冷したPBSを500 microliters加えます。血液による汚染を最小限にするため、500 microlitersのPBSを用いて組織を5回洗浄します。洗浄したサンプルをスクリューキャップ付きの1.5 milliliterチューブに移し、組織重量の10倍量の塩化ナトリウム緩衝液を加えます。

室温で1時間、最低速度でボルテックスします。次に、抽出液を新しい遠心チューブに移し、4°Cで10分間、16,000 ×gで遠心分離します。得られた組織ペレットを新鮮な塩化ナトリウム緩衝液で手短に洗浄します。

その後、組織重量の10倍量のSDS緩衝液を加え、室温で16時間、最低速度でボルテックスします。抽出液を新しい遠心チューブに移し、4°Cで16,000 ×g、10分間遠心分離します。得られたペレットを二回蒸留水で洗浄します。

組織重量の5倍の量のグアニジン塩酸塩緩衝液を加え、室温で72時間、最大速度でボルテックスします。得られた抽出液を新しいチューブに移し、4°Cで16,000 ×gで10分間遠心分離します。タンパク質の定量後、糖鎖修飾部位の占有率評価用に各サンプルから10 µgを新しいチューブに分注し、直接的な糖ペプチド分析用に50 µgを別のチューブに分注します。

それぞれに10倍量のエタノールを加え、20 °Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルを4 °Cで16,000 ×g、30分間遠心分離します。沈殿したペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去します。

次に、真空濃縮機を用いて、室温で15分間ペレットを乾燥させます。調製した脱糖鎖緩衝液を各サンプルに10 µL添加します。サンプルチューブを50 mLコニカルチューブに入れ、25 °Cで2時間、45度の角度でインキュベートします。

その後、温度を37 °Cに上げ、緩やかに攪拌しながら36時間インキュベートします。16,000 ×gで1分間遠心分離した後、室温で真空濃縮機を用いて45分間、水を蒸発させます。乾燥したサンプルを、50 units/mLのPNGase Fを含む10 µLのO-18標識水で再懸濁します。37 °Cで絶えず攪拌しながら36時間インキュベートし、次にすべてのサンプルに対して液相でのトリプシン消化を行い、C-18クリーンアップに進みます。

まず、レジンを活性化させるため、C-18スピンプレートの各ウェルに200 µLのメタノールを加えます。1,000 ×gで1分間遠心分離します。次に、各ウェルに200 µLの80% ACNおよび0.1% TFA水溶液を加え、1,000 ×gで1分間遠心分離します。

次に、1%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに200 µLずつ加え、1,000 ×gで1分間遠心分離します。この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返します。その後、サンプルをスピンプレートのウェルにロードし、1,500 ×gで1分間遠心分離します。流出液を再度ロードし、遠心分離を繰り返します。

次に、1%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに200 µLずつ加え、1500 ×gで1分間遠心分離します。この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返します。続いて、50%ACNおよび0.1%TFAを含む水溶液を各ウェルに170 µLずつ加え、1500 ×gで1分間遠心分離します。

この添加と遠心分離をもう一度繰り返します。真空濃縮機を用いて、合わせた溶出液を室温で2時間乾燥させます。乾燥させたサンプルは、使用するまで-80℃で保存します。

この後、グリコサイト占有率の評価を目的としたサンプルに対して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を行います。直接的なグリコペプチド分析を目的とするサンプルについては、まずテキストプロトコルに記載されている標準的なTMTゼロラベル化の手順に従ってください。まず、TMTゼロラベル化されたサンプル10 µLに、提供された結合バッファー50 µLを加えます。

次に、均質化したglyco capture resin懸濁液を50 µLずつ新しい1.5 mLチューブに分注し、2500 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、ピペットを用いてサンプルと結合バッファー溶液60 µLを樹脂ペレットの入ったチューブに加え、混合します。1200 RPMで攪拌しながら、室温で20分間インキュベートします。2000 ×gで2分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移します。

次に、ピペットを使用して各レジンチューブに150 µLの洗浄バッファーを加え、混合して洗浄プロセスを開始します。1200 RPMで攪拌しながら、室温で10分間インキュベートします。2500 ×gで2分間遠心分離した後、各上清を対応する上清保存チューブに移して洗浄を完了させます。

この洗浄工程をさらに2回繰り返します。次に、75 µLの溶出バッファーを加え、ピペットで混合します。1200 RPMで撹拌しながら、室温で5分間インキュベートします。

2500 ×gで2分間遠心分離し、各上清を新しい1.5 mLチューブに移します。ピペットを用いて溶出バッファー75 µLを加えて混合し、サンプルのインキュベーションと遠心分離を繰り返します。各溶出液を対応するチューブに移します。

混合溶出液を2500 ×gで2分間遠心分離した後、レジンを完全に除去するために、各上清を新しいチューブに移します。その後、真空濃縮機を用いて、室温で2時間、溶出液を乾燥させます。乾燥させた糖ペプチドを、超純水で調製した2% ACNおよび0.5% TFA 15 µLで再懸濁します。

次に、テキストプロトコルに記載されている通り、質量分析を実施します。本研究では、心血管組織から得られたECMタンパク質を、ECM組成の液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析、ならびに間接的および直接的なグリコペプチド分析のために調製します。基本戦略は、塩化ナトリウム、SDS、および塩酸グアニジンの順次インキュベーションに基づき、その後に間接的または直接的なグリコペプチド分析を行います。

抽出効率は、視覚化のために銀染色を施したbis-trisアクリルアミドゲルでモニタリングします。分析した3つの抽出物のうち、ECM糖タンパク質の大部分はグアニジン塩酸塩分画に認められます。ECM糖タンパク質は、大きく反復的なグルコサミン糖鎖とともに、短く多様なN結合およびO結合オリゴ糖で修飾されています。

脱糖鎖修飾の効率は、アミノグリコサミノグリカンを消化する酵素および、より小さいN結合型およびO結合型オリゴ糖を標的とする酵素の添加によって確認されます。その後、NXTまたはNXSセクオン内の酸素18で標識された脱アミド化アスパラギンが存在することで、糖タンパク質が同定されます。ここでは、2番目の位置に脱アミド化アスパラギンを持つデコリンペプチドの代表的なHCDタンデム質量スペクトルを示します。

次に、HCD ETD断片化を用いて、糖タンパク質を濃縮したECM抽出物を分析します。ETDタンデム質量スペクトルにより、糖鎖組成の特性解析が可能になります。この手法を習得するには、およそ2〜3週間かかる見込みです。

このグリコプロテオミクスにより、プロテオミクスの変化だけでなく、糖鎖の組成に基づいた線維化機能の生理学的および病理学的解析が可能になります。このビデオを視聴することで、質量分析を用いたタンパク質糖鎖修飾研究のためのサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。この手法は心血管疾患への洞察を提供しますが、呼吸器疾患や癌など、線維化を伴う他の病理学的状態にも適用可能です。