細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

このプロトコールの全体的な目標は、グリコシル化部位の同定や心血管組織における糖鎖形態の組成特性評価など、細胞外マトリックスタンパク質組成を分析することです。この方法は、構造マトリックスグリコストレーションが心血管疾患の組織線維化にどのように影響するかなど、組織線維化のプロセスにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全体的なグリコシル化の変化を分析する以前のプロトコルとは異なり、構造マトリックスタンパク質の特定の部位でのグリコシル化の特性評価を可能にし、よりターゲットを絞ったフォローアップ機構研究のためのツールを提供することです。

その手順を実演していただくのは、当研究室のMarika Fava博士とFerheen Baigさんです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで説明されているように、すべての抽出バッファーを準備します。次に、メスを使って20〜50ミリグラムの組織を約2ミリメートルの大きさの3つまたは4つの小さなピースにさいの目に切ります。

さいの目に切った組織を1.5ミリリットルのチューブに入れ、500マイクロリットルの氷冷PBSを追加します。血液汚染を最小限に抑えるために、洗浄ごとに500マイクロリットルのPBSを使用して組織を5回洗浄します。洗浄したサンプルをスクリューキャップ付きの1.5ミリリットルチューブに移し、組織重量の10倍の量の塩化ナトリウム緩衝液を追加します。

室温で最低速度で1時間渦巻く。次に、抽出物を新しい遠心分離チューブに移し、摂氏4度で10分間Gの16,000倍で遠心分離します。得られた組織ペレットを新鮮な塩化ナトリウム緩衝液で短時間洗浄します。

この後、組織重量の10倍の容量のSDSバッファーを添加し、室温で16時間、最低速度でボルテックスします。抽出物を新しい遠心分離管に移し、摂氏4度で10分間Gの16, 000倍で遠心分離します。得られたペレットを二重蒸留水で洗浄します。

塩酸グアニジンバッファーを組織の重量の5倍の量で加え、室温で72時間最高速度でボルテックスします。得られた抽出物を新しいチューブに移し、摂氏4度で10分間Gの16,000倍で遠心分離します。タンパク質を定量した後、グリコシル化部位の占有率を評価するために、サンプルごとに10 μgを新しいチューブに分注し、直接グリコペプチド分析のために50 μgを別のチューブに分注します。

それぞれに10倍の量のエタノールを加え、摂氏20度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを16, 000倍Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。沈殿したペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引します。

次に、真空濃縮器を使用して、ペレットを室温で15分間乾燥させます。調製した10マイクロリットルの脱グリコシル化バッファーを各サンプルに加えます。サンプルチューブを50ミリリットルの円錐形チューブに詰め、摂氏25度で45度の角度で2時間インキュベートします。

この後、温度を摂氏37度に上げ、穏やかに攪拌しながら36時間インキュベートします。16, 000倍Gで1分間遠心分離した後、室温で真空濃縮器を45分間使用して水を蒸発させます。乾燥サンプルを10マイクロリットルのO-18標識水で再懸濁し、50単位/ミリリットルのPNGase F.Incubateで摂氏37度で36時間インキュベートし、一定の攪拌下下で37°C、その後、すべてのサンプルに対して溶液内トリプシン分解を行い、C-18クリーンアップを進めます。

まず、C-18スピンプレートの各ウェルに200マイクロリットルのメタノールを加えて、樹脂を活性化します。1, 000倍Gで1分間遠心分離します。次に、200マイクロリットルの80%ACNと0.1%TFAを各井戸に水に加え、Gの1,000倍で1分間遠心分離します。

次に、各井戸に1%ACNおよび0.1%TFAを水で含んでいる溶液の200マイクロリットルを加え、1,000回G.この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返すことで1分間遠心分離します。この後、サンプルをスピンプレートのウェルにロードし、Gの1500倍で1分間遠心分離します。フロースルーをリロードし、遠心分離を繰り返します。

次に、1%ACNと0.1%TFAの水を含む溶液を各ウェルに200マイクロリットル加え、Gの1500倍で1分間遠心分離します。この溶液の添加と遠心分離を2回繰り返します。次に、50%ACNと0.1%TFAの水を含む溶液170マイクロリットルを各ウェルに加え、Gの1500倍で1分間遠心分離します。

この添加と遠心分離をもう一度繰り返します。真空濃縮器を使用して、結合した溶出液を室温で2時間乾燥させます。乾燥させたサンプルは、使用する準備ができるまで摂氏80度で保管します。

この後、グリコサイトの占有率評価を目的としたサンプルに対して液体クロマトグラフィータンデム質量分析を実行します。直接グリコペプチド分析を目的としたサンプルについては、まず、テキストプロトコールに概説されている標準のTMTゼロ標識に進みます。まず、TMTゼロ標識サンプル10マイクロリットルごとに、提供された結合バッファー50マイクロリットルを追加します。

次に、50マイクロリットルの均質なグリコ捕捉樹脂懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに分注し、2500倍Gで1分間遠心分離します。上清を除去し、ピペットを使用して樹脂ペレットを含むチューブに60マイクロリットルのサンプルと結合緩衝液を加えて混合します。1200 RPMで撹拌しながら、室温で20分間インキュベートします。2, 000倍Gで2分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移します。

この後、ピペットで各樹脂チューブに150マイクロリットルの洗浄バッファーを加えて混合し、洗浄プロセスを開始します。1200 RPMで撹拌しながら、室温で10分間インキュベートします。2500倍Gで2分間遠心分離した後、各上清を対応する上清保存チューブに移して洗浄を完了します。

この洗浄プロセスをさらに2回繰り返します。次に、75マイクロリットルの溶出バッファーを加え、ピペットで混合します。1200 RPMで撹拌しながら、室温で5分間インキュベー

Gの2500倍で2分間遠心分離し、各上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。ピペットを使用して75マイクロリットルの溶出バッファーを加えて混合し、サンプルのインキュベーションと遠心分離を繰り返します。各溶出物を対応するチューブに移します。

結合溶出液を2500倍Gで2分間遠心分離した後、各上清を新しいチューブに移し、樹脂が完全に除去されるようにします。その後、真空濃縮器を使用して溶出液を室温で2時間乾燥させます。乾燥したダウン糖ペプチドを15マイクロリットルの2%ACNおよび05%TFAに再懸濁し、二重蒸留水に浸します。

次に、テキストプロトコルに概説されているように質量分析を行います。この研究では、心血管組織由来のECMタンパク質を調製し、液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析、ECM組成の分析、および間接的および直接的な糖ペプチド分析を行います。コア戦略は、塩化ナトリウム、SDS、および塩酸グアナジンによるシーケンシャルインキュベーションと、それに続く間接的または直接的なグリコペプチド分析に基づいています。

抽出の効率は、銀染色を施したbis-trisアクリルアミドゲルでモニターし、可視化します。分析される3つの抽出物のうち、ECM糖タンパク質の大部分は塩酸グアナジンアリコートに見られます。ECM糖タンパク質は、大きくて反復的なグリコサミン糖鎖と、短く多様なNおよびO結合オリゴ糖で装飾されています。

脱グリコシル化の効率は、グリコサミン糖鎖を消化する酵素と、より小さなNおよびO結合オリゴ糖を標的とする酵素を追加することで見られます。次に、糖タンパク質は、NXTまたはNXSセクオン内の酸素18で標識された脱アミド化アスパラギンの存在によって識別されます。ここでは、位置2 11にデコリンと脱アミド化アスパラギンを含有するペプチドの代表的なHCDタンデム質量スペクトルを示します。

次に、HCD ETDフラグメンテーションを使用して、糖タンパク質が豊富なECM抽出物を分析します。ETDタンデムマススペクトルにより、糖鎖組成の特性評価が可能になります。このテクニックを習得すると、約2〜3週間かかります。

このグライコプロテオミクスにより、線維化の生理学的および病理学的機能だけでなく、プロテオミクスの変化だけでなく、思考糖の組成についても調査することができます。このビデオを見れば、質量分析によるタンパク質グリコシル化の研究のためのサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。この方法は心血管疾患に関する洞察を提供することができますが、呼吸器疾患や癌など、体積線維症の他の病状にも適用できます。