組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

この手順の全体的な目標は、組織工学用の血管新生ユニットを生成するために、マウス脂肪組織から微小血管断片を分離することです。この方法は、組織代替物のin vivo血管新生に関する組織工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、複雑なin vitro処理を行わずに、完全に機能する微小血管セグメントが得られることであり、それを足場に播種して組織欠損部に埋め込むことができます。

この方法は、in vitro血管新生アッセイなどの他のシステムにも適用でき、微小血管ネットワークの形成とリモデリングの根底にある分子メカニズムを解明できます。まず、麻酔をかけた雄の野生型C57ブラックシックスマウスを手術用実体顕微鏡で仰臥位に置き、つま先のつま先つまみに対する反応がないことを確認します。足をテープで固定し、腹部を消毒します。

次に、解剖ハサミを使用して腹部層を下の筋肉組織から分離し、正中線開腹術を行います。腹壁のフラップを横方向に広げ、精巣、精巣上体、精巣上体脂肪パッドを両側に特定します。次に、小さな準備ハサミと細い鉗子を使用して脂肪パッドを採取し、精巣上体組織を収集しないように注意し、脂肪パッドを摂氏37度のDMEM15mlを含むシャーレに脂肪パッドを置きます。

層流フードで、15 mlのPBSが入った3つの別々のシャーレで脂肪パッドを洗い、洗浄した脂肪を空の14 mlポリプロピレンチューブに入れます。チューブスケールを使用して、採取した脂肪の量を決定します。次に、細いハサミを使用して、脂肪組織を機械的にミンチにします。

均質な組織懸濁液が得られたら、10 mLの測定ピペットを使用して、2容量のコラギナーゼNB 4Gを含むミンチ組織を、25 mmの攪拌棒を含む50 mLの三角フラスコに移します。フラスコを細胞培養インキュベーターに10分間、激しく攪拌しながら置きます。次に、10 mcLの消化された組織を顕微鏡で観察します。

この分離手順で最も難しいステップは、消化を止める適切な時間を特定することです。脂肪パッドを長時間消化すると、微小血管の断片のない単一細胞懸濁液になります。消化物に遊離脂肪組織由来の微小血管断片が単一細胞の隣に含まれている場合は、20%FCSを添加した2容量のPBSで酵素を中和し、細胞血管懸濁液を新しいポリプロピレンチューブに移します。

溶液を摂氏37度で5分間インキュベートし、重力によって微小血管断片を残りの脂肪から分離します。次に、1 mLの精密ピペットを使用して、主脂肪上清1 mLを慎重に除去し、続いて100 mcLの精密ピペットを使用して、懸濁液が無脂肪になるまで残りの上清を除去します。すべての脂肪を除去したら、10 mLの測定ピペットを使用して、50 mLのコニカルチューブ上の50ミクロンのストレーナーで細胞血管懸濁液をろ過し、ろ過した懸濁液を個々の微小血管フラグメント分離株ごとに新しい14 mLポリプロピレンチューブに移します。

遠心分離により微小血管断片ペレットを回収し、各チューブから最後の1 mLを除くすべての上清を除去します。ペレットを残りのスーパーナテントに再懸濁します。次に、各懸濁液を個々の 1.5 mL 円錐形微量遠心チューブに移し、微小血管フラグメントを再度ペレット化して、計画されたダウンストリーム分析のために適切な最終容量の PBS および 20%FCS に再懸濁します。

ここでは、生後6ヶ月、7ヶ月から12ヶ月齢の野生型C57ブラック6マウスから新たに単離された微小血管断片の長さ分布が示されており、平均長は約42マイクロメートルで観察されました。この代表的な細胞血管懸濁液塗抹標本が示すように、脂肪組織が十分に消化されると、大、中、小の微小血管断片と単一細胞が観察されます。高倍率では、微小血管断片が階層的な微小血管セグメントを持つ成熟した微小血管形態を示すことが明らかになります。

フローサイトメトリーによる微小血管断片の特性評価は、それらがCD31陽性内皮細胞、アルファ平滑筋アクトン陽性傍血管細胞、およびCD117陽性間葉系幹細胞、マーカー発現細胞を含むことを示しています。真皮皮膚代替品に播種した後、より大きな微小血管断片が主にインプラントの表面に局在し、インプラントコア内で一部の毛細血管セグメントが検出されます。播種された微小血管断片の免疫組織化学的染色は、動脈、静脈、および毛細血管のような断片による生理学的微小血管構成をさらに明らかにします。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。このビデオを見れば、組織工学のための血管新生ユニットとして、マウス脂肪組織から微小血管断片を単離する方法を十分に理解できるはずです。