マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

この手順の全体的な目的は、マイクロ電極アレイ上で神経ネットワークを培養、記録、および刺激するために、E17マウスの神経組織を単離し、結合させることです。この手法は、学習と記憶の基本メカニズムに関連するネットワークダイナミクスの研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイクロ電極アレイにより、複数の部位から同時に記録が可能であるため、従来の単一部位でのガラスピペットによる記録と比較して、より優れた空間的・時間的分解能を得られることです。

この手法は、学習と記憶のネットワークダイナミクスに関する洞察を得られるだけでなく、薬物毒性の調査や、次世代の個別化医療のためのパラダイム設計にも利用できます。組織の操作は、解剖および解離プロセスにおいて、単にプロトコルを読むだけでは習得することが困難であるため、このプロセスの視覚的な実演が不可欠です。アレイを準備するために、滅菌ピペットチップを用いて、各MEAの中心に解凍したラミニンを40〜50 µL、コントロールプレートにラミニンを0.2 mL添加します。

バイオフード内ですべてのMEAおよびコントロールディッシュを密閉し、37°Cのインキュベーターに1時間置いておく。1時間後、滅菌済みのパステールピペットを用いて、MEAの中心部にある過剰なラミニンを慎重に吸引除去し、播種前に表面を風乾させる。次に、L-15培地を4枚の100mmペトリ皿に注ぎ、蓋をして-20°Cのフリーザーに約40〜60分間、培地が完全に凍結せず、シャーベット状の粘度になるまで置いておく。

解剖の準備として、氷を満たしたトレイにガラス製ペトリ皿を伏せて置きます。次に、動物の下腹部に70% ethanolをスプレーします。小さな外科用ハサミを用いて、下腹部の皮膚と皮下脂肪にV字型の切開を加え、切開線を胸腔の遠位端まで広げて子宮を露出させます。

ピンセットを用いて、胚の間の子宮を慎重に持ち上げます。解剖用ハサミで結合組織を切り除き、子宮全体を完全に切り離します。次に、70% ethanolで子宮を短時間洗浄して血液を除去し、冷やしたL-15を満たした4枚のペトリ皿のうちの1枚に置きます。

続いて、2組の微細先端ピンセットを用いて、各胚を子宮および胚嚢内部から取り出します。取り出した胚を冷えたL-15を満たした2枚目のディッシュに入れ、その後、頭部を3枚目のシャーレに、胴体を4枚目のシャーレにそれぞれ移します。バイオフード内で、冷却されたガラスシャーレステージ上にオートクレーブ滅菌済みフィルターペーパーのくさび形に切ったものを置き、そのフィルターペーパーの上に胚の頭部を1つ置きます。

次に、アイリスシザーの下刃の切断端を頭蓋骨の基部に挿入します。下刃を頭蓋骨の内面に沿わせ、脳に触れないように注意しながら、後頭板を切断し、続いて頭頂板の正中線に沿って切断します。そのまま、軟骨性の前頭頭蓋板の間を吻側に向かって切断し続けます。その後、後頭板の中心から、中心の切開線に対して垂直に左右へ切断します。

その後、小さなスパチュラを脳の腹側表面と頭蓋底板の間に慎重に差し込み、脳の下に完全に収まるまで進めます。次に、スパチュラを持ち上げて脳を取り出します。清潔なスパチュラを用いて、まず嗅球を取り除き、次に前頭葉を台形に切り出します。

次に、組織を保存液の入った15 milliliter遠心チューブに移します。この手順では、2本の滅菌済みメスを用いて組織を細切します。その後、ペトリ皿内の細切した組織に2.5 millilitersのDnase papain混合液を加えます。

ペトリ皿をゆっくりと回し、すべての組織が溶液中に浮いており、皿の底に付着していないことを確認します。その後、皿を37 °Cのインキュベーターに15分間置きます。バイオクリーンベンチ内で、滅菌済みの広口トランスファーピペットを使用して、すべての培地と組織を5 mLの滅菌済みクライオチューブに転送します。

同じ転送ピペットの先端をチューブの底近くに配置し、混合液を10〜15回、穏やかにピペッティングします。次に、加温した2 mLのDMEM 5/5を解離細胞混合液に加え、遠心チューブに蓋をします。転倒混和により穏やかに混ぜ合わせ、室温で573 ×gで5分間遠心分離します。

バイオセーフティーキャビネット内で、ペレットを壊さないようにすべての上清を捨てます。続いて、チューブ内のペレットに温めたDMEM 5/5を1 mL加え、細胞を再懸濁します。滅菌済みの小口径転送ピペットを使用し、混合液が均一になるまで緩やかにピペッティングしてペレットを分散させます。

次に、細胞懸濁液10 µLをマイクロ遠心チューブに移します。バイオハザード対策フードの外で、マイクロ遠心チューブ内の細胞懸濁液10 µLにトリパンブルー10 µLを加えます。その後、細胞数をカウントするために、トリパンブルー細胞懸濁液10 µLを使い捨てヘモサイトメーターチップにロードします。

バイオセーフティキャビネット内で、滅菌済みマイクロピペットを使用し、50 µLの細胞懸濁液を各アレイの中心および各コントロール用ペトリ皿に分注します。その後、蓋をしたペトリ皿を37 °Cに設定したインキュベーターに3〜4時間置きます。次に、温めておいたDMEM 5/5を各MEAに1 mLずつ静かに加えます。

培地をMEAの内側の縁に沿って1滴ずつ慎重に加え、アレイ中心部から細胞が洗い流されないようにしてください。その後、各MEAにガス透過性FEP膜付きのキャップを被せ、インキュベーターに戻します。2日後、ディッシュから培地を吸引して取り除き、加温したDMEM+で培地を完全に交換します。

ピペットの先端を内壁に慎重に当て、温めたDMEM+を1 mL分注します。その後の給餌では、ディッシュから500 µLの培地を吸い出し、温めたDMEM+を再び500 µL分注します。この手順において、顕微鏡下で2日ごとにディッシュのサンプルを観察し、アレイ上の細胞被覆状況および細菌や真菌による汚染の有無を確認してください。培養物をインキュベーターから取り出す前に、温度コントローラーを接続してシステムを起動し、プリアンプの加熱ベースプレートが35 °Cに達するまで待ちます。

次に、MEAウェルの黒い線がリファレンスグランド（基準接地）に一致するように、キャップを閉じた培養物をプリアンプに設置します。プリアンプのピンが正しく並び、プリアンプの上部が固定され、培養物のキャップが閉まったままであることを確認してください。続いて、ソフトウェア環境で「start」を押して、信号の可視化を開始します。

メインウィンドウで Spikes、Detection、Automatic を選択し、標準偏差の値を-5に変更して、Refresh をクリックして閾値をリセットします。信号を可視化した後、Stop、Record、Play をクリックして活動の記録を開始します。マウス胚性ニューロンを60チャンネルのMEA上に播種することで、各電極からネットワーク全体のニューロン活動を同時に記録することが可能になります。

トレーニング前後における、刺激に応答した8つの電極の活動を示す代表的なラスタープロットです。垂直の赤線は刺激時間を、黒いティックマークは活動電位を示しています。トレーニング前では、チャネル全体で刺激パルスに対する即時反応が見られます。

トレーニング後、ネットワークは刺激に対する即時的な反応だけでなく、より持続的な活動反応を示します。ここでは、トレーニング済みネットワーク12個とコントロールネットワーク10個の平均を示しており、トレーニング済みネットワークではスパイク頻度が有意に変化していることが分かります。このビデオを視聴することで、マウス胚から神経組織を単離・結合する方法を十分に理解し、マイクロ電極アレイを用いた神経ネットワークの培養、記録、および刺激ができるようになります。