Name: マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶマイクロ電極アレイを用いたE17マウス神経細胞培養と電気刺激によるネットワーク応答の時間依存的増加。この手法は学習と記憶の神経メカニズムを解明し、創薬研究にも応用可能です。

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この研究は、国立科学財団グラントCMMI-1300007によって資金提供されました。ジョセフ・メイソン大学でジョセフ・J・パンクラジオ博士、ハミド・チャルカカル博士、グレッチェン・クナック博士（Dr. Gretchen Knaack）博士の5年間にわたり、これらのプロトコールの設計と5年以上の文化の維持に協力してきた先の研究員に感謝したい。 、フランツ・ハミルトン博士、マイケル・マケラ、ロバート・グラハム。

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<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコールで概説されている手順は、初心者がMEA上で自身のニューロン培養物をプレートし、ネットワーク活動を記録するのに十分な詳細を提供する。このプロトコールは、培養物が適切に付着し、電極アレイ上に細胞のカーペット層を形成し、数ヶ月間健康で汚染物質を含まないことを確実にするのに役立つ。 プロトコルのすべての部分を順守することが最善の方法ですが、成果を上げるために重要なプロセスがあります。培養が汚染されるのを防ぐためには、プロセス全体を通して無菌技術を使用することが不可欠です。プロトコールに記載されているように、新しいMEAを親水性にしなければならない。そうでなければ、細胞接着不良が生じる。厳しいピペッティングおよび解離中の気泡の形成を回避することにより、損傷した細胞がプレーティングされる回数を減少させ、より高く、より健康的な収量をもたらす。最初の後にDMEM 5/5からDMEM +に切り替える摂食も重要です。 DMEM 5/5にはウマ血清が含まれており、連続的に使用するとグリア細胞が培養上支配的になり、培養が正常に見えるものの、ニューロン活性が低下します17 。スケジュールどおりに培養物に給餌し、適切なインキュベーション条件に保つこともまた重要である。 MEA上の細胞培養物をプレーティングすることは、最適ではない結果をもたらす可能性がある多くの変数を伴う。目標は細胞の完全な「カーペット」であるが、上記の重要なステップに対処できなければ、細胞の成熟が悪くなったり、汚染されたりする。乏しい細胞の成熟とは異なる貧弱な細胞接着もまた懸念される。これは、メッキ前の貧弱なMEA調製または古い培地の使用を含むいくつかの要因によって引き起こされる可能性がある。神経細胞培養のための安定化形態のL-グルタミンおよび無血清補充物を含有する古い培地（ 材料 表）が使用されると、細胞は最初に接着するが、約2週間後に浮遊する。細菌汚染が持続的な問題である場合、アンピシリンまたはペン - ストレプトンなどの抗生物質を培地に添加することができる。真菌汚染を処理するために利用できる殺菌剤もある。これらは、文化の成果に影響する可能性があるより一般的な変数のいくつかです。時間と経験の後にのみ遭遇する多くのものがあります。 ガラス微小電極の使用と比較して、この技術はネットワークのダイナミクスおよび薬理学的応答を研究するのに優れている。これは、多くの異なる時空間刺激パターンの使用を可能にし、同時に複数の領域からの神経応答の記録を可能にする。以前のグループは、ここで説明したものと同様のプロトコルを使用して興味深い結果を示しています18 。培養は数週間または数ヶ月続き、同じ培養物を再使用することができるので、この技術もまた同じネットワーク上で時間の経過とともに複数の実験が繰り返されます。 しかし、この手法には限界があります。 MEAは非侵襲性である。したがって、パッチクランプまたはピペットによる細胞内記録とは対照的に、細胞外活性のみを記録することができる。さらに、アレイ中の各電極はいくつかの細胞によって覆われているので、単一のニューロンの活性を分解することは不可能である。逆に、これらはインビトロ培養であるため、脳内のネットワークの構造的特性を完全に再現することはできません。また、細胞がそれらのpHバランスを維持するためのCO 2雰囲気を提供する機構がなければ、活性は一度に30分未満しか記録できない。 この技術が習得されると、電気刺激を伴うまたは伴わない薬理学的操作が探究され得る。ニューロンネットワークにおける学習および記憶形成を突き止めるための新しいプロトコルもまた、p海馬または脊髄ネットワークのためのプロトコル。ネットワークの刺激および訓練のためのプロトコルは以前に公開されており、これらのうちのいくつかは、Eytan らによって提案された「選択的適応」などのインビボプロトコルにさらに発展した 。 19 。いくつかのプロトコルがテストされました。しかし、2005年にRuaroによって提案された破傷風手技の修正の結果のみがここに提示される14,20。

マイクロ電極アレイ（MEA）は、薬物の毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます1 。単一の細胞からの活動のみを記録できるパッチクランプ法や、単一のサイトで電極を囲むニューロンからの細胞外応答を記録できるガラスピペットによるフィールド記録などの従来の方法とは対照的に、MEAは同時に各電極を個々に配置するという煩雑な作業を必要とすることなく、細胞培養中の複数の部位から記録することができる。これは、その培養物内のネットワークを形成する細胞群間の動的相互作用の研究を可能にする。さらに、ネットワーク発射パターン2,3,4,5およびネットワーク制御6に対する電気刺激の効果は、/ sup&gt;は十分に実証されており、電気的刺激および制御の多数の構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広い時空間ダイナミクスを探究することができる。 これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが、学習の指標である7,8,9,10,11,12,13を示す程度であった。 Peixoto Labは以前、Ruaro らに記載されているように、高周波トレーニング信号の影響を調べました。 14 、マイクロ電極アレイ15上にプレートされたマウスニューロンのネットワーク上。これらの実験では、ネットワークは応答フォローインの増加を示した電気刺激によって誘導されるg訓練。増加した反応は、刺激認識を介した学習の一形態と考えられ、これにより、ネットワークは、特定の刺激（ すなわちトレーニング）プロトコルの適用後に刺激の変化に対して一貫した方法で応答した。 このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養し、皿の95％以上からの記録を成功させ、刺激のパターンに応答してネットワークを訓練し、単一ユニットの活動を分類し、ヒストグラムをプロットし、そのような実験。ニューロン培養の刺激および記録のための専用システム（ 表を参照 ）の使用、ならびにニューロンユニットを分類するためのソフトウェアパッケージ（ 表の表を参照 ）の適用を実証する 。カスタムデザインのグラフィカルユーザーインターフェイス（ 表の表を参照 ）を使用してポストsを視覚化します時間間隔ヒストグラム、インターバースト間隔、およびバースト持続時間の測定、ならびにトレーニングプロトコルの前後の刺激に対する細胞応答を比較することができる。

<table><tbody><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A4403</td><td>4 mg/mL アリコート</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>神経細胞培養用の無血清サプリメントを製造。1 mLのアリコートを作り、凍結</td></tr>する <tr><td>ビーカー - ガラス - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー - ガラス - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>鈍い先端の親指鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル - 滅菌、2 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル - 無菌、5 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>L-グルタミンDNaseの安定化型を含む細胞培養培地</td></tr><tr><td></td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>先端の細い親指鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipets</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>A stabilized form of L-glutamine used as a suplement</td></tr><tr><td>Hemocytometer chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB complete</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2細胞記憶培</td></tr><tr><td>地 馬血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCSフィルターアンプ</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCSヘッドステージ/プリアンプ</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS微小電極アレイ</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>60MEA200/10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS電源</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS信号分周器</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS刺激発生器</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS温度コントローラー</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>メディア収納ボトル - ガラス 500mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ - 0.4 mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3485</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ - 2 mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3434ECONO</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ - 10 &mu;L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ - 1,000 &mu;L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ - 200 &mu;L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロピペッター - 10 &mu;L&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー4641170N</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペッター - 1,000 &mu;L&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー4641210N</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペッター - 200 &mu;L&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー4641230N</td><td></td></tr><tr><td>パパイン-0.22フィルターワー</td><td>ジントン生化学</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン連鎖球菌)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿-100 mm使い捨て</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿-100 mmガラス</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr>ペ<tr><td>トリ皿-35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaning System</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸塩 (PDL)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンコニカル (遠心分離) チューブ -15 mL</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン コニカル (遠心分離) チューブ -50 mL</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>プロシージャ マスク</td><td>Imco</td><td>1530-IMC</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr>メス<td>刃</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td><td>ツ&nbsp;500237-G</td><td></td></tr><tr><td>はさみ - 虹彩</td><td>ワールド精密機器</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>はさみ - 大型</td><td>世界精密機器</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>はさみ - 小型外科</td><td>用ワールド精密機器</td><td>&nbsp;501733-G</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット - 滅菌済み、1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット-滅菌、2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット - 滅菌済み、25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット-滅菌、50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr>ソフトウェア<tr><td>:Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>.matファイルの分析に使用されます。&nbsp;ご要望に応じて無料でご利用いただけます。&nbsp;npeixoto@gmu.edu に連絡してコピーをリクエストしてください。</td></tr><tr><td>ソフトウェア:MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>データ収集に使用</td></tr><tr><td>ソフトウェア:NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer.nex</td><td>ファイルを.matに変換するために使用されます</td></tr><tr><td>ソフトウェア:オフラインソー</td><td>ターPlexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>ニューラルスパイクをソートし、データファイルを.plxに変換し、次に.nexに変換するために使用されます</td></tr><tr><td>ソフトウェアマニュアル:MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>ソフトウェアマニュアル:NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>ソフトウェアマニュアル:オフラインソーター</td><td>プレクソン&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>スパチュラ - 小型ダブルエンド</td><td>のワールド精密機器</td><td>&nbsp;503440</td><td></td></tr><tr><td>ステリカップ 0.22 & マイクロ;m孔フィルター - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette - 大口径&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット - 小口径&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 濾紙</td><td></td><td>Whatman 1442 150</td><td>ガラスのペトリ皿で 8 つのパイのくさびとオートクレーブにカット</td></tr></tbody></table>

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイ（MEA）は、薬物毒性、次世代パーソナライズド医薬品の設計パラダイム、神経細胞培養におけるネットワークダイナミクスの研究に使用できます。単一のセルからの活動だけを記録できるパッチクランプのような従来の方法とは対照的に、MEAは、各電極を個別に配置するという厄介な作業を必要とせずに、ネットワークの複数のサイトから同時に記録することができる。さらに、多数の制御および刺激構成を同じ実験装置内で容易に適用することができ、幅広いダイナミクスを探索することが可能になる。これらのインビトロ研究における重要な動力学の1つは、培養されたネットワークが学習を示す特性を示す程度であった。 MEA上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激によって誘発された訓練後の応答の増加を示す。このプロトコルは、MEA上で神経細胞を培養する方法を示す。成功したメッキされた皿の95％以上からのコード;刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するためのプロトコルを確立する。そのような実験の結果をソートし、プロットし、解釈する。ニューロン培養を刺激および記録するための独自のシステムの使用が実証される。ソフトウェアパッケージは、ニューロンユニットの分類にも使用されます。刺激後時間ヒストグラム、バースト間隔、バースト持続時間を視覚化し、トレーニングプロトコールの前後で刺激に対する細胞応答を比較するために、カスタム設計されたグラフィカルユーザインタフェースが使用される。最後に、この研究努力の代表的な結果と今後の方向性について議論する。

多電極アレイ上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激後の応答の増加を示す。このプロトコルは、ニューロンを培養する方法、活動を記録する方法、および刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するプロトコルを確立する方法を示す。

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

この手順の全体的な目的は、マイクロ電極アレイ上で神経ネットワークを培養、記録、および刺激するために、E17マウスの神経組織を単離し、結合させることです。この手法は、学習と記憶の基本メカニズムに関連するネットワークダイナミクスの研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイクロ電極アレイにより、複数の部位から同時に記録が可能であるため、従来の単一部位でのガラスピペットによる記録と比較して、より優れた空間的・時間的分解能を得られることです。この手法は、学習と記憶のネットワークダイナミクスに関する洞察を得られるだけでなく、薬物毒性の調査や、次世代の個別化医療のためのパラダイム設計にも利用できます。組織の操作は、解剖および解離プロセスにおいて、単にプロトコルを読むだけでは習得することが困難であるため、このプロセスの視覚的な実演が不可欠です。アレイを準備するために、滅菌ピペットチップを用いて、各MEAの中心に解凍したラミニンを40〜50 µL、コントロールプレートにラミニンを0.2 mL添加します。バイオフード内ですべてのMEAおよびコントロールディッシュを密閉し、37°Cのインキュベーターに1時間置いておく。1時間後、滅菌済みのパステールピペットを用いて、MEAの中心部にある過剰なラミニンを慎重に吸引除去し、播種前に表面を風乾させる。次に、L-15培地を4枚の100mmペトリ皿に注ぎ、蓋をして-20°Cのフリーザーに約40〜60分間、培地が完全に凍結せず、シャーベット状の粘度になるまで置いておく。解剖の準備として、氷を満たしたトレイにガラス製ペトリ皿を伏せて置きます。次に、動物の下腹部に70% ethanolをスプレーします。小さな外科用ハサミを用いて、下腹部の皮膚と皮下脂肪にV字型の切開を加え、切開線を胸腔の遠位端まで広げて子宮を露出させます。ピンセットを用いて、胚の間の子宮を慎重に持ち上げます。解剖用ハサミで結合組織を切り除き、子宮全体を完全に切り離します。次に、70% ethanolで子宮を短時間洗浄して血液を除去し、冷やしたL-15を満たした4枚のペトリ皿のうちの1枚に置きます。続いて、2組の微細先端ピンセットを用いて、各胚を子宮および胚嚢内部から取り出します。取り出した胚を冷えたL-15を満たした2枚目のディッシュに入れ、その後、頭部を3枚目のシャーレに、胴体を4枚目のシャーレにそれぞれ移します。バイオフード内で、冷却されたガラスシャーレステージ上にオートクレーブ滅菌済みフィルターペーパーのくさび形に切ったものを置き、そのフィルターペーパーの上に胚の頭部を1つ置きます。次に、アイリスシザーの下刃の切断端を頭蓋骨の基部に挿入します。下刃を頭蓋骨の内面に沿わせ、脳に触れないように注意しながら、後頭板を切断し、続いて頭頂板の正中線に沿って切断します。そのまま、軟骨性の前頭頭蓋板の間を吻側に向かって切断し続けます。その後、後頭板の中心から、中心の切開線に対して垂直に左右へ切断します。その後、小さなスパチュラを脳の腹側表面と頭蓋底板の間に慎重に差し込み、脳の下に完全に収まるまで進めます。次に、スパチュラを持ち上げて脳を取り出します。清潔なスパチュラを用いて、まず嗅球を取り除き、次に前頭葉を台形に切り出します。次に、組織を保存液の入った15 milliliter遠心チューブに移します。この手順では、2本の滅菌済みメスを用いて組織を細切します。その後、ペトリ皿内の細切した組織に2.5 millilitersのDnase papain混合液を加えます。ペトリ皿をゆっくりと回し、すべての組織が溶液中に浮いており、皿の底に付着していないことを確認します。その後、皿を37 °Cのインキュベーターに15分間置きます。バイオクリーンベンチ内で、滅菌済みの広口トランスファーピペットを使用して、すべての培地と組織を5 mLの滅菌済みクライオチューブに転送します。同じ転送ピペットの先端をチューブの底近くに配置し、混合液を10〜15回、穏やかにピペッティングします。次に、加温した2 mLのDMEM 5/5を解離細胞混合液に加え、遠心チューブに蓋をします。転倒混和により穏やかに混ぜ合わせ、室温で573 ×gで5分間遠心分離します。バイオセーフティーキャビネット内で、ペレットを壊さないようにすべての上清を捨てます。続いて、チューブ内のペレットに温めたDMEM 5/5を1 mL加え、細胞を再懸濁します。滅菌済みの小口径転送ピペットを使用し、混合液が均一になるまで緩やかにピペッティングしてペレットを分散させます。次に、細胞懸濁液10 µLをマイクロ遠心チューブに移します。バイオハザード対策フードの外で、マイクロ遠心チューブ内の細胞懸濁液10 µLにトリパンブルー10 µLを加えます。その後、細胞数をカウントするために、トリパンブルー細胞懸濁液10 µLを使い捨てヘモサイトメーターチップにロードします。バイオセーフティキャビネット内で、滅菌済みマイクロピペットを使用し、50 µLの細胞懸濁液を各アレイの中心および各コントロール用ペトリ皿に分注します。その後、蓋をしたペトリ皿を37 °Cに設定したインキュベーターに3〜4時間置きます。次に、温めておいたDMEM 5/5を各MEAに1 mLずつ静かに加えます。培地をMEAの内側の縁に沿って1滴ずつ慎重に加え、アレイ中心部から細胞が洗い流されないようにしてください。その後、各MEAにガス透過性FEP膜付きのキャップを被せ、インキュベーターに戻します。2日後、ディッシュから培地を吸引して取り除き、加温したDMEM+で培地を完全に交換します。ピペットの先端を内壁に慎重に当て、温めたDMEM+を1 mL分注します。その後の給餌では、ディッシュから500 µLの培地を吸い出し、温めたDMEM+を再び500 µL分注します。この手順において、顕微鏡下で2日ごとにディッシュのサンプルを観察し、アレイ上の細胞被覆状況および細菌や真菌による汚染の有無を確認してください。培養物をインキュベーターから取り出す前に、温度コントローラーを接続してシステムを起動し、プリアンプの加熱ベースプレートが35 °Cに達するまで待ちます。次に、MEAウェルの黒い線がリファレンスグランド（基準接地）に一致するように、キャップを閉じた培養物をプリアンプに設置します。プリアンプのピンが正しく並び、プリアンプの上部が固定され、培養物のキャップが閉まったままであることを確認してください。続いて、ソフトウェア環境で「start」を押して、信号の可視化を開始します。メインウィンドウで Spikes、Detection、Automatic を選択し、標準偏差の値を-5に変更して、Refresh をクリックして閾値をリセットします。信号を可視化した後、Stop、Record、Play をクリックして活動の記録を開始します。マウス胚性ニューロンを60チャンネルのMEA上に播種することで、各電極からネットワーク全体のニューロン活動を同時に記録することが可能になります。トレーニング前後における、刺激に応答した8つの電極の活動を示す代表的なラスタープロットです。垂直の赤線は刺激時間を、黒いティックマークは活動電位を示しています。トレーニング前では、チャネル全体で刺激パルスに対する即時反応が見られます。トレーニング後、ネットワークは刺激に対する即時的な反応だけでなく、より持続的な活動反応を示します。ここでは、トレーニング済みネットワーク12個とコントロールネットワーク10個の平均を示しており、トレーニング済みネットワークではスパイク頻度が有意に変化していることが分かります。このビデオを視聴することで、マウス胚から神経組織を単離・結合する方法を十分に理解し、マイクロ電極アレイを用いた神経ネットワークの培養、記録、および刺激ができるようになります。

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、セットアップの世話から、記録と電気的に多国間での文化を刺激するために必要な情報を提供します。...

どのように文化、レコードとマイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激する（多国間環境協定）へ

皮質における臨界​​状態のダイナミクスを示す神経雪崩、すなわちスケール不変時空間アクティビティのバーストを、勉強するための確実な方法。雪崩は、正確に制御された条件下で平面統合マルチ電極アレイ（MEA）との活動の長期的な測定を可能にする培養皮質の浅層の開発に自発的に出現する。...

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

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微小電極アレイを用いた神経回路網の電気生理活性の測定

このビデオでは、多電極アレイ(MEA)を使用して3D共培養球のシナプス生理機能を測定する手順を示しています。この方法により、3D球体内のニューラルネットワークダイナミクスとシナプスネットワークバースト活動を理解することができます。...

多電極アレイを用いた3D共培養球のシナプス生理機能の測定

この研究では、3Dニューロン培養物が平面微小電極アレイ(MEA)に結合される新しい実験モデルpresented.

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

私たちは、ニューロンの応答プロファイルを研究し、刺激パラメータを最適化するために、多電極アレイ上で一次マウススパイラル神経節ニューロン外植片を培養するためのプロトコルを提示します。このような研究は、人工内耳のニューロン電極インターフェースを改善して、患者の聴覚とデバイスのエネルギー消費に利益をもたらすことを目的としています。...

マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

環境毒素への暴露鋭く胚に影響を与えることができます。内分泌撹乱化学物質ビスフェノール類の神経系に悪影響を与えると知られているようです。ここで初期胚の毒素の機能の影響を研究する脊椎動物 (ニワトリ)の in vitro神経ネットワーク...

ホルモン多電極アレイを用いた脊椎動物の神経回路網関数の開発化合物の影響の評価

このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。...

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース

本稿では、マルチウェルMEAプレート上で培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)ネットワークの開発のためのプロトコルのセットを含み、作用電位測定のために細胞膜を可逆的に電気ポレートする。ハイスループットの記録は、同じセルサイトから何日も繰り返し取得されます。...

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

マイクロメートルスケールの3Dプリンティングにより、神経細胞培養用のポリマーデバイスのラピッドプロトタイピングが可能になります。原理証明として、ニューロン間の構造的結合は、神経突起伸長に影響を与える障壁とチャネルを作成することによって制約され、そのような操作の機能的結果は細胞外電気生理学によって観察されました。...

2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング

ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

学ぶマイクロ電極アレイを用いたE17マウス神経細胞培養と電気刺激によるネットワーク応答の時間依存的増加。この手法は学習と記憶の神経メカニズムを解明し、創薬研究にも応用可能です。

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

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