Name: 腹部色素沈着の定量化ショウジョウバエmelanogaster (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶDrosophila melanogasterの腹部色素沈着の定量化法。デジタル画像解析を用いて非破壊的に色素の広がりと深さを測定し、進化生物学における形態変異の遺伝的基盤解明に貢献します。

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この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1256565とIOS-1557638がAWSに資金提供しました。このペーパーの以前のバージョンに対する彼らの有益なコメントについてPatricia Wittkoppと3人の匿名の批評家に感謝します。

著者は何も開示することはない。

この方法論により、複数の下流分析に適した定量的形態での色素沈着データの正確で迅速かつ再現性のある取得が可能になる。この方法は、同種のハエの系統における腹部色素沈着に及ぼす温度の影響に関するデータを得るために使用されてきた。しかし、方法論は、個体、個体群、または種間の色素沈着の差異の基礎となる遺伝子、または色素沈着パターンに対する特定の遺伝子の影響を調べるための逆遺伝学的研究を行うために、フォワード遺伝学研究で使用することができる。上述のように、 D. melanogaster色素沈着の発達および進化を探究した多くの研究があったが、この方法論が色素沈着データを定量的形態で捕捉する精度は、より強力な統計学的アプローチを可能にする。これにより、研究者は色素沈着パターンを解析する際に使用する試料数を減らすことができ、より微妙な解明が可能になります色素沈着の局面。さらに、この方法は、フライの解剖を必要とせず、形態学的測定または遺伝子型決定のようなさらなる分析のために試料をその後使用することを可能にする。実際、この方法は、麻酔されたハエに使用される可能性があり、その後、その色素形成特性に基づいて選択的に繁殖することができる。 </...

色素沈着は、種、個体群、個体間、さらには個体群1,2,3,4,5,6において、個体間でさえ莫大な表現型の変化を示す 。多種多様な動物で色素沈着に関する研究が数多く行われていますが、色素沈着を調節する発達的および生理学的機序を解明するために分子遺伝学の完全な力が使用され、これらのメカニズムがどのように進化するかについて、Drosophila melanogaster 、 6 。 D.メラノガスター（melanogaster）7,8の生化学的合成を制御する遺伝子、および時間的および空間的なディーを制御する遺伝子については、多くのことが知られているこの生合成のストリエーション9,10,11,12,13。さらに、遺伝的マッピングは、 D.メラノガスター（ Melanogaster）14,15,16,17において色素沈着における細胞内および細胞間の相違の根底にある遺伝子座を同定した。行動18,19および免疫19,20などの色素沈着と多面発現形質との間の関係も、色素沈着パターン15,21,22の適応的意義を有するように探究されている。したがって、 D.メラノガスターの色素沈着は、強力でしかも単純なm複雑な表現型の発達と進化のためのodel。 成人の色素沈着D.メラノガスターは、特に翼と背側の胸部と腹部の体のメラニン化パターンが特徴です。しかし、最も研究の注目を集めているのは背側腹部の各クチクラ板（tergite）の色素沈着である。遺伝的な17,23および環境的な24,25の両方の要因のために、この色素沈着にはかなりの変動がある（ 図 1A〜F）。腹部硬質のクチクラは、前部および後部の発生区画（ 図1G ）で構成され、それぞれが色素沈着および装飾に基づいてさらに細分化することができる26 。前部区画は、6つのクチクラ（a1-a6）を含み、後区画は3つ（p1-p3）を含む（ 図1G ）。これらのうち、p1、p2、およびa1キューティクルは、典型的には、引き伸ばされていない腹部のターガイトの下に折りたたまれ、隠される。確実に目に見えるキューティクルは、キューティクルタイプa4（中程度の剛毛を有する毛状）およびa5（毛状の毛状）からなる「色素バンド」と呼ばれる重い色素沈着のバンドによって特徴付けられ、バンドの後端前縁よりも強く色素沈着した（ 図1G ）。このバンドの前部は、明るく着色した毛状のキューティクルの領域であり、後部に（a3）剛毛があり、前部にはa2ではない。ハエ間の色素沈着の変動は、色素沈着の強度および色素バンドの幅の両方で観察される。一般に、変動は、最も後部のセグメント（腹部セグメント5,6,7）において最も大きく、より前方のセグメント（腹部セグメント3および4項） 24 。さらに、 D. melanogasterの色素沈着に性的な二型性があり、男性は一般的に全身に5番目と6番目の腹部を着色しています（ 図4C ）。 D.メラノガスターの腹部色素沈着に関する大部分の研究では、色素沈着は、質的に27,28,29または半定量的に14,15,16,17,24,30の尺度で測定されたパターンを有する、類型的または序数的形質として扱われている、 31,32,33,34,35、 36,37 。これらの方法は、必然的に精度の欠如に悩まされており、色素沈着の主観評価に依存しているため、研究を通してデータを比較することは困難である。いくつかの著者は、色素沈着の空間的な大きさ38,39 、特定のキューティクルタイプの色素沈着の強度23,25,39,40、または腹部テルグタイト全体の色素沈着の平均強度を全体として41,42,43として定量化した。それにもかかわらず、これらの定量方法は、腹部色素沈着の強度および空間分布の両方を同時に測定するものではなく、従って、色素沈着がabd全体でどのように変化するかのニュアンス最終的なtergite。さらに、これらの定量化方法38,41,42,43のいくつかは、腹部キューティクルの解剖および装着を必要とする。これは時間がかかり、サンプルを破壊し、追加の形態学的解析に利用できなくなる。腹部色素沈着の発達および進展の理解が深まるにつれて、空間分布および色素沈着の強度の両方を迅速かつ正確に測定するより洗練されたツールが必要となる。 この方法の全体的な目標は、 D. melanogasterにおける腹部色素沈着の複製可能かつより正確な測定値を得るためにデジタル画像分析を利用することである。方法論は3つの段階を含む。まず、大人のフライは非破壊的に装着され、背面の腹部のデジタル画像が撮影されます。次に、ImageJマクロを使用して、ユーザー第3および第4の腹部セグメントの両方においてa2キューティクルの前部からa5キューティクルの後部（緑色のボックス、 図1G ）まで延在するピクセルの前 - 後部ストリップを画定する。次いで、このストリップの幅にわたる平均ピクセル値がその長軸に沿って抽出され、それがターゲットの前部から後部に変化する際の色素沈着の空間分布および強度を捕捉するプロファイルを生成する。第3に、Rスクリプトを使用して、三次スプラインを使用して数学的に色素沈着プロファイルを記述する。 Rスクリプトはスプラインとその1次微分と2次微分を使用してa2-a5キューティクルの幅、色素バンドの幅、色素沈着の最大レベルと最小レベルを抽出します。従って、本方法は、空間的特性と腹部色素沈着の深さの両方を定量化する。 この方法論は、第3および第4の腹部胸部の色素沈着を定量化し、排他的に、またはより多くの後部ヘルニアと組み合わせて、多数の先行研究1、15、23、24、25、28、33、39、42の焦点であった。第5および第6腹部テルゲイトよりも変化は少ないが、第3および第4テルゲイトは男性において完全に色素沈着していないので、このプロトコルは男性および女性の両方に適用することができる。それにもかかわらず、ここに示すように、プロトコルは、女性の第5および第6腹部腸内細菌の色素沈着を測定するために使用することができる。さらに、色素沈着プロフィールの特徴を抽出するために使用されるスクリプトのわずかな変更は、この方法を使用して、多種多様な色素沈着における変化を定量化することを可能にすべきである生物。

<table><tbody><tr><td>デュモン#5生物学鉗子</td><td>FST11252-30</td><td></td><td></td></tr>寒<tr><td>天</td><td>Sigma-Aldrich5040</td><td></td><td></td></tr>解<tr><td>剖スコープ</td><td>ライカ</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>ベース</td><td>ライカ</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ライカ</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>グースネック冷光源</td><td>ショット</td><td>ACE1</td><td></td></tr><tr><td>画像アクイジション制御ソフトウェア</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://micro-manager.org/ 画像解析ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>マルチメーター</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm ペトリ皿</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

色素沈着は形態学的に単純であるが、しばしば適応性のある特徴を有する非常に可変性の形質である。それは、形態学的表現型の発達および進化を理解するためのモデルとして広範に役立ってきた。 Drosophila melanogasterの腹部色素沈着は特に有用であり、研究者は形態間および体内特異的変異の根底にある遺伝子座を同定することができます。しかしながら、 D.メラノガスターの腹部色素沈着は、色素沈着データに適用され得る統計学的分析の形態を制限する定量的ではなく、スコアリングによって定性的に大部分検定されてきた。この研究は、成人D. melanogasterの腹部色素沈着パターンの様々な局面の定量化を可能にする新しい方法論を記述している。このプロトコールは、標本のマウント、画像キャプチャ、データ抽出、および分析を含む。画像の取り込みと解析に使用されるすべてのソフトウェアは、マクロオープンソースの画像解析用に書かれています。このアプローチの利点は、異なるイメージングシステムにわたって再現性の高い方法論を使用して、色素沈着特性を正確に測定する能力である。この技術は、成虫のメラノガスターの褐色色素沈着パターンの変動を測定するために使用されてきたが、この方法論は柔軟性があり、無数の異なる生物における色素沈着パターンに広く適用可能である。

プロトコルは、腹部の色素沈着に飼育温度の効果を探索するために使用された。これまでの研究では、発生温度の上昇は、ショウジョウバエのいくつかの種（ D. melanogaster 30,32を含む）における腹部色素沈着の拡散を減少させることを示している。具体的には、腹部3および4において、色素沈着の程度（色素バンドの幅）は17℃から25℃に低下し、25℃から28℃まで同じままである24,36。これらの研究は、1-10スケール（0：顔料バンドなし、完全に黄色のテルグライト、5：テルグライトの50％を占める、10：完全に暗色のテルゲライト）で色素沈着の程度を評価した。定量的方法論がこの表現型可塑性を捕捉できるかどうかを立証するために、色素沈着をth17℃（7フライ）、25℃（9フライ）、28℃（9フライ）で卵から成虫まで飼育された、表情的に野生型のハエのアイソジェニック系統の第3および第4腹部腹部。セッション効果によって導入された厄介な因子を除去する際の補正手順の有効性を判定するために、同じハエの...

この研究は、デジタル画像解析を用いてショウジョウバエの腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法を提示する。この方法は、表現型の取得とデータ解析との間の手順を合理化し、標本のマウント、画像取得、画素値抽出、形質測定を含む。

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

本手法の全般的な目的は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の腹部色素沈着を迅速に定量化することです。この方法は、形態の種固有の変異の基礎となる遺伝子座の特定や、形態表現型の発生および進化の理解など、進化生物学の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、色素沈着の広がりや濃淡を含む、腹部色素沈着のさまざまな側面を非破壊的に測定できることです。この手法はキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の腹部色素沈着に関する知見を提供しますが、他のショウジョウバエ属の種に適用することもでき、また他の昆虫や動物分類群における色素沈着パターンの測定に容易に転用することが可能です。イメージングの前に、色素沈着を維持するためにハエを70% ethanolに保存することができます。可視化にはマウンティングパッドが必要です。60 mmのペトリ皿に、1.25%のアガー水溶液を約10 mL分注入します。顕微鏡下で、精密切断鉗子を用いて、ゲルに長さ20 mm、幅2 mm、深さ1 mmの溝を掘ります。1枚の皿に複数の溝を作成することが可能です。次に、解析対象となる表面がゲル表面のすぐ上にくるようにして、ショウジョウバエを溝に埋め込みます。本手法では、背面が解析対象となります。その後、ショウジョウバエが完全に浸るまで、ディッシュに70% ethanolを満たします。これにより、色素沈着パターンを不明瞭にするキューティクルからの反射を抑えることができます。次に、顕微鏡に接続されているイメージングソフトウェアとデジタルカメラを起動します。光源には、ダブルグースネックデバイスからの冷光で十分です。画像解析ソフトウェアで、画像タイプを8-bitに設定します。次に、画像キャプチャソフトウェアのLive設定を切り替えて、カメラのビューウィンドウを開きます。画像タイプをグレースケールに設定します。次に、光源を最大強度に設定し、照明をステージから約120 millimeters離れた位置に配置します。顕微鏡を60倍の倍率に設定し、視野の幅を3 millimetersにします。その後、2 millimeterのステージマイクロメーターを視野内に配置し、ピントを合わせます。ソフトウェアに戻り、露出ボックスにあるフィールドを使用して、マイクロメーターが見えるように露出時間を調整します。次に、スケールを設定します。直線ツールを開き、ステージマイクロメーターに沿って2 mmの長さを描画します。次に、「Set Scale」オプションにその長さを入力します。すると、ウィンドウに1ミクロンあたりのピクセル数でスケールが表示されます。スケールを確認し、「OK」をクリックして調整を確定してください。次に、画像キャプチャソフトウェアに戻り、「Stop」および「Snap」コマンドを使用してステージマイクロメーターの画像をキャプチャします。その後、画像解析ソフトウェアに戻り、画像をTiffファイルとして保存します。ここで、固定したハエの背側正中線に焦点を合わせます。最適な撮像結果を得るためには、正中線が真っ直ぐ上を向くように配置してください。翼やその他の突出した構造物を脇に避け、クチクラが最もよく照らされるように照明を調整します。次に、画像キャプチャソフトウェアで露光を設定します。その際、ピクセル値のヒストグラムをガイドとして、飽和することなく画像の全ピクセル範囲を取り込み、コントラストを最大限に高めてください。実験を通して、この露出と照明を維持してください。次に、画像を撮影する前に、目的の腹部節が視野に入っていることを確認します。その後、画像を撮影し、ファイル名にサンプルID番号を付けて保存してください。書面によるプロトコルに記載された形式を使用してください。この解析では、著者によって提供されたマクロを使用します。解析対象の画像シリーズは、すべて同じファイルフォルダ内に保存されている必要があります。それでは、マクロを開始し、プロンプトに従って操作してください。まず、保存済みファイルの場所を指定します。次に、解析データの保存先を指定します。次に、ソフトウェアが画像シリーズを正しく読み込めるように、ファイル名に使用された文字数を入力します。次のプロンプトは関心領域の幅に関するものです。ここでは、解析が必要な前後のストリップに沿ったピクセル数を入力してください。次に、プロンプトで、シリーズの最初の画像を解析することを選択します。その他のオプションは、シリーズの次の画像を解析するか、解析を終了することです。ラインツールが自動的に選択されます。これを使用して、前方から後方に向かって線を描き、画像上の正中線を特定します。次に、マクロプロンプトに従い、ラインツールを用いて第4背板（Tergite4）の後縁を特定します。ラインツールを使用して、正中線の後端から右側端まで線を引きます。この際、線の中心が色素帯の後縁のすぐ後方に位置するようにしてください。次に、ラインツールを使用してTergite4の前縁を定義します。前方の正中線端から右側の側縁まで線を引きます。白い四角で示される線の中心が、淡く着色したクチクラの前縁に位置するようにしてください。この情報に基づき、マクロが色素沈着プロファイルを生成します。ただし、プロファイル測定ライン上に剛毛やその他の欠陥が重なっている場合、プロファイルが不正確になる可能性があります。これを補正するため、ヒストグラムウィンドウの「Live preview」を選択し、プロファイルが滑らかになるようにラインを調整してください。画像解析ストリップで色素沈着のさまざまな側面を正確に捉えるためには、画像や標本の不規則性に起因するノイズを最小限に抑えられる解析領域を特定することが不可欠です。次に、同じ画像内でTergite3を解析し、その後次の画像へと進んでください。なお、上述の手順は、飼育温度によって引き起こされる腹部色素沈着の既知の変化を調査するために用いられました。第3および第4背板を、さまざまな照明条件下および露光時間で数回にわたり観察しました。色素沈着のさまざまな側面について検討した結果、特に、低温で育成した個体において色素沈着の帯が広くなることが判明しました。その後、算出された値を、5人の異なる観察者が同じ個体に対して行った一般的な主観的測定値と比較しました。45匹の雌のハエを評価したところ、第4腹部色素帯の幅に関する平均観察ランキングは、マクロによる自動測定値と密接に相関していました。また、同じ色素帯をイメージングソフトウェアを用いて手動で測定しました。これらの結果は、マクロを用いて生成された測定値とも強い相関を示しました。次に、第3および第4色素帯の色素沈着が増加していることで知られている、ebony変異体の雌における色素沈着を測定してソフトウェアの検証を行いました。また、この手法を用いて、野生型雌の第5および第6腹部帯の測定も行いました。この自動化手法により、色素密度とバンドサイズの有用な測定値が常に得られました。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエ（Drosophila）の腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法について、十分な理解を深めることができます。この手法を習得するには、主にピンセットの熟練した操作が必要です。この手法のイメージング部分は、習熟すれば1時間あたり50検体のペースで実施可能です。また、これらの画像から色素沈着の測定値を抽出する作業は、1時間あたり70枚のペースで実施できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

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の定量的比較シス</emトランスジェニックで> -調節エレメント（CRE）の活動キイロショウジョウバエ</em

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腹部色素沈着の定量化

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