腹部色素沈着の定量化ショウジョウバエmelanogaster
2017年6月1日
この研究は、デジタル画像解析を用いてショウジョウバエの腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法を提示する。この方法は、表現型の取得とデータ解析との間の手順を合理化し、標本のマウント、画像取得、画素値抽出、形質測定を含む。
この方法論の全体的な目標は、ショウジョウバエ Drosophila melanogaster の腹部色素沈着を迅速に定量化することです。この方法は、信頼特異的な変異形態学の根底にある遺伝的遺伝子座の特定や、形態学的表現型の発達と進化の理解など、進化生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ユーザーが色素沈着の広がりや深さなど、腹部の色素沈着のさまざまな側面を非破壊的に測定できることです。
この方法は、ショウジョウバエ・メラノガスターの腹部の色素沈着に関する洞察を得ることができますが、他のショウジョウバエ種にも適用でき、他の昆虫や動物分類群の色素沈着パターンの測定にも容易に適応させることができます。イメージングの前に、フライを70%エタノールで保存して、色素沈着を維持することができます。視覚化には取り付けパッドが必要です。
60ミリメートルのシャーレに約10ミリリットルの1.25%寒天を水に入れます。顕微鏡下で、細い鉗子を使用して、長さ20ミリメートル、幅2ミリメートル、深さ1ミリメートルの溝をゲルに掘ります。1つの皿で複数のトレンチを作ることができます。
次に、フライをトレンチに埋め込み、分析用の表面をゲル表面のすぐ上に置きます。この場合、背側が注目されます。次に、ハエが完全に沈むまで皿に70%エタノールを入れます。
これにより、色素沈着パターンを覆い隠す可能性のあるキューティクルからの反射が減少します。次に、顕微鏡に接続されたイメージングソフトウェアとデジタルカメラを起動します。光源としては、ダブルグースネックデバイスからの冷光で十分です。
画像解析ソフトウェアで、画像の種類を 8 ビットに設定します。次に、画像キャプチャソフトウェアで、ライブ設定を切り替えて、カメラのビューウィンドウを開きます。画像の種類をグレースケールに設定します。
次に、光源を最大強度に設定し、ステージから約 120 mm の場所にライトを配置します。顕微鏡を60倍の倍率に設定して、視野が3ミリメートルの幅になるようにします。次に、2ミリメートルのステージマイクロメータを視野に入れ、焦点を合わせます。
ソフトウェアに戻り、露光時間を調整して view 露光ボックスにあるフィールドを使用してマイクロメーター。次に、スケールを設定します。直線ツールを開き、ステージマイクロメータに沿って2ミリメートルの長さを描きます。
次に、その長さを [スケールの設定] オプションに入力します。その後、ウィンドウにはスケールがピクセル/ミクロンで表示されます。スケールをメモし、調整をOKします。
次に、画像キャプチャソフトウェアに戻り、StopコマンドとSnapコマンドを使用してステージマイクロメータの画像をキャプチャします。次に、画像解析ソフトウェアに戻り、画像をTiffファイルとして保存します。次に、マウントされたハエの背側正中線に焦点を当てます。
最良のイメージング結果を得るには、正中線をまっすぐ上に配置する必要があります。翼やその他の目立たない構造物を押しのけ、キューティクルを最もよく照らすように照明を調整します。次に、ピクセル値ヒストグラムをガイドとして使用して、画像キャプチャソフトウェアで露出を設定し、彩度なしで画像の全ピクセル範囲をキャプチャし、コントラストを最大化します。
実験中も、この露出と照明を保持します。ここで、画像をキャプチャする前に、目的の腹部セグメントがビューになっていることを確認します。次に、画像をキャプチャし、ファイル名にサンプルID番号を付けて画像を保存します。
記述されたプロトコルに記述されている形式を使用してください。この分析では、著者が提供するマクロを利用しています。分析する画像シリーズはすべて同じファイルフォルダに含まれている必要があります。
次に、マクロを開始し、プロンプト コマンドに従います。まず、保存されているファイルの場所を特定します。次に、分析データを保存する場所を特定します。
次に、ソフトウェアが画像シリーズを正しく読み取れるように、ファイル名に使用された文字数を入力します。次のプロンプトは、関心領域の幅です。ここでは、分析する必要のある前後のストリップに沿ったピクセル数を入力します。
次に、プロンプトで、シリーズの最初の画像を分析することを選択します。その他のオプションは、系列の次の画像を分析するか、分析を終了するかです。線ツールが自動的に選択されます。
これを使用して、画像に沿って前方から後方向に線を引くことにより、画像上の正中線を識別します。次に、マクロのプロンプトに従って、ライン ツールを使用して Tergite4 の後端を特定します。ラインツールは、ラインの中心が顔料バンドの後エッジのすぐ後になるように、後部正中線エッジから右横端まで線を引くために利用可能になります。
次に、ラインツールを使用してTergite4の前縁を定義します。正中線の前端から右横端まで線を引きます。白い正方形で定義される線の中央は、薄く色素沈着したキューティクルの前端にある必要があります。
この情報を使用して、マクロは色素沈着プロファイルを生成します。ただし、プロファイルが測定されるストリップに剛毛やその他の傷が交差すると、プロファイルが不正確になる可能性があります。これを修正するには、ヒストグラムウィンドウでライブプレビューを選択し、プロファイルが滑らかになるように線を調整します。
画像分析ストリップが色素沈着のさまざまな側面を正確に捉えるためには、画像や標本の不規則性によって引き起こされるノイズが最小限に抑えられる分析領域を特定することが重要です。次に、同じ画像内のTergite3の分析に進み、次の画像に進みます。記載された手順は、飼育温度によって引き起こされる腹部の色素沈着の既知の変化を調査するために使用されました。
3番目と4番目のテルギットは、さまざまな照明と露出の下で数回調べられました。色素沈着のさまざまな側面が調査されました。具体的には、ハエを低温で飼育すると色素沈着帯が広くなることがわかりました。
次に、計算された値を、5人の異なる観察者によって同じハエで行われた一般的な主観的測定と比較しました。45匹の雌のハエの評価では、4番目の腹部色素沈着バンドの幅の平均観測順位は、マクロの自動測定と密接に相関していました。同じ色素沈着バンドも、イメージングソフトウェアを使用して手動で測定しました。
これらの結果は、マクロを使用して生成された測定値とも強く相関していました。次に、ソフトウェアをテストして、3番目と4番目の色素バンドで色素沈着が増加していることがよく知られている女性の黒檀変異体の色素沈着を測定しました。この方法は、野生型の女性の5番目と6番目の腹部バンドを測定するためにも使用されました。
自動化された技術により、顔料の密度とバンドサイズの測定が常に可能でした。このビデオを見た後、ショウジョウバエの腹部の色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法をよく理解しているはずです。この技術を習得するには、主に鉗子を深く使用する必要があります。
一度習得すると、この技術のイメージング部分は、1時間あたり50検体の速度で行うことができます。これらの画像から色素沈着測定値を抽出することは、1時間あたり70枚の画像のペースで行うことができます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、デジタル画像解析を用いてキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の腹部色素沈着を迅速かつ精密に定量化する方法を提示します。この手法により、色素沈着の広がりと深さを非破壊的に測定することが可能となり、進化生物学への知見が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 進化生物学
- 遺伝学
背景
- Drosophila melanogasterは、遺伝学および進化研究におけるモデル生物です。
- 色素沈着を理解することで、形態学的変異に関連する遺伝子座を明らかにできます。
- 正確な表現型解析には、非破壊的なイメージング技術が不可欠です。
- 70% ethanolでの事前保存は、イメージングのための色素沈着の維持に役立ちます。
研究目的
- 腹部色素沈着を定量化するための迅速な手法を開発すること。
- Drosophilaにおける遺伝学的および進化的な問いに関する研究を促進すること。
- 他のDrosophila種および昆虫に適用可能な技術を提供すること。
使用方法
- 色素沈着を定量化するためのデジタル画像解析。
- 視覚化パッドへの検体の固定。
- 画像の取得および画素値の抽出。
- 色素沈着特性の測定。
主な結果
- この手法により、色素沈着形質の精密な定量化が可能になります。
- 表現型の取得からデータ解析までのプロセスが効率化されます。
- 得られた結果は、形態進化に関する研究に寄与します。
- この技術は、さまざまな昆虫分類群への適用が可能です。
結論
- この手法により、Drosophilaにおける腹部の色素沈着の研究が強化されます。
- これは、進化生物学における今後の研究の枠組みを提供します。
- このアプローチは、他の種や形態学的形質にも拡張可能です。
よくある質問
産業界における重要性
定量的な表現型解析により、形態的特性の精密な測定が可能となり、初期創薬段階におけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングを支援します。本手法は、色素沈着パターンに関する再現性とスケーラビリティのあるデータ抽出を実現し、機能横断的な連携や、遺伝子型-表現型研究における予測精度の向上を促進します。また、昆虫の多様な分類群への適応性により、表現型スクリーニングのワークフローにおけるトランスレーショナルな連続性とポートフォリオの妥当性が高まります。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 定量的形質測定を通じて、形態学的変異の基礎となる遺伝子座の解析を可能にする。
- 運用上の価値： 遺伝的スクリーニングパイプラインと互換性のある、非破壊的なハイスループットイメージングを提供する。
- 戦略的価値： 表型発現に影響を与える発生経路の仮説検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 個体間における色素沈着の強度およびバンド幅の標準化された定量的リードアウトを生成する。
- 運用の価値： オープンソースソフトウェアのマクロを利用し、異なるイメージングシステム間で一貫したデータ抽出を可能にする。
- 戦略的価値： 色素沈着経路の遺伝的修飾因子のスクリーニングに向けたアッセイの準備を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：適応的な形態学的特性を定量化することで、疾患に関連したシステムモデリングを促進する。
- 運用的価値：標準化されたマウンティングおよびイメージングプロトコルにより、研究室間での再現性を確保する。
- 戦略的価値：遺伝型と測定可能な表現型の出力とを相関させることで、リスク調整後の開発進展に関する意思決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、遺伝的な摂動または環境的な調節後の定量的形質解析を可能にすることで、ディスカバリーバイオロジーのワークフローに統合されます。
- 探索生物学： 精密な形態学的定量化により、仮説検定とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物または遺伝的修飾因子の評価に向けた、アッセイの標準化と再現性のある定量的出力を提供します。
- 分析： ピクセルベースの測定と統計的出力により、表現型の分布を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： 測定可能で進化的に関連のある形質を通じて、前臨床的な連続性を構築します。
- エンタープライズ再利用： 多様な形態学的スクリーニングアプリケーションに活用可能な、再利用可能なイメージングおよび分析プラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 客観的かつ定量的な形質測定により、遺伝子型と表現型の関係における予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 高い再現性と拡張性を備え、1時間あたり50検体のイメージングおよび70枚の画像の解析が可能である。
- 戦略的価値： 表現型評価における曖昧さを排除し、Go/No-Go判定の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 定量的な表現型しきい値を用いることで、リスクに基づいた遺伝的標的の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- Drosophilaのハンドリング、顕微鏡観察、および画像解析ソフトウェアに関する専門知識が必要です。
- 正確な測定を行うためには、標準化された照明、倍率、およびスケール校正に依存します。
- 一貫した標本固定およびエタノール保存を行うため、チームをまたいだプロトコルの遵守が必要です。
- 適応上の検討事項として、種や組織型に応じて関心領域（ROI）の幅を調整することが含まれます。
- 実用上の制限として、剛毛や標本の不規則性に起因するノイズの影響を受けやすく、手動でのプロファイル修正が必要になる場合があります。
