パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

この方法論の全体的な目標は、検出可能な組織損傷を引き起こさず、深部領域でも信頼性の高い送達を保証する、パーソナライズされた再利用可能な石英針を使用した脳マイクロインジェクションのプロトコルを改良することです。この方法は、神経変性疾患や精神疾患の病態生理学、ウイルスベクターや細胞移植による遺伝子治療や細胞治療の影響など、神経科学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。主な利点は、これらの針が検出可能な組織損傷を引き起こさないため、脳深部領域への信頼性の高い送達が保証されていることです。

それらは洗浄して再利用できるため、費用対効果に優れています。この手順を開始するには、石英キャピラリーを蒸留水に5分間入れて洗浄および滅菌します。99%エタノールで5分間、続いてジエチルエーテルで5分間。

次に、毛細血管をボンネットの下に少なくとも1時間置いて、完全に乾かします。その間に、レーザープーラーを使用して長くて細い針を準備します。次に、70%エタノールで事前に洗浄したシャーレに針を置きます。

皿をプラスチックパラフィンフィルムで覆います。次に、マイクロディセクタでキャピラリーを切断します。針を顕微鏡テーブルにしっかりと固定し、その先端をコンピューター画面の中央に配置します。

メニューバーで、鉛筆アイコンをクリックし、それを使用してカットする針のマークを描きます。サイドバー機能で、[カット開始]ボタンを含むフラグを選択して、レーザーが以前にマークされたスポットをカットできるようにします。必要に応じて、マークを引いて側面の穴をカットし、針の位置を変えずにカット手順を繰り返します。

針を切断した後、プラスチックチューブを介してボイドポンプに接続します。次に、ポンプをオンにし、順方向流量を毎分3マイクロリットルに手動で設定します。次に、99%エタノールを吸引し、続いて蒸留水を吸引して、切断による不純物を取り除きます。

その後、99%エタノールを再度吸引して乾燥を容易にします。その後、手術の日まで、針を適切に覆ったペトリ皿に保管してください。針を再利用するには、実験の最後に、適切な洗剤と70%エタノールで針を洗浄し、注入された溶液と組織残留物を取り除きます。

必要に応じて、これらの針は蒸留水で満たされた専用のガラス瓶で煮ることさえできます。このステップでは、設定メニューを選択して、マイクロインジェクションシリンジの体積あたりの直径に従ってポンプを校正します。そして、流量を毎分0.3マイクロリットルに設定します。

次に、10ミリリットルの注射器に滅菌水を入れます。そして、それを使用して、マイクロインジェクションシリンジと手動マイクロインジェクションポンプ用のインジェクションアセンブリパーツキットを充填します。その後、針を手動マイクロインジェクションポンプキットに接続します。

10ミリリットルのシリンジをマイクロインジェクションシリンジから外し、ピストンをゆっくりと押しながら、マイクロインジェクションシリンジの上部に水滴を残します。次に、ピストンをマイクロインジェクションシリンジに挿入します。次に、マイクロインジェクションシリンジをポンプに接続し、流量を毎分0.3マイクロリットルに設定します。

その後、流量を毎分0.1マイクロリットルに変更し、手術手順を開始します。手術を行うには、動物の頭を剃り、アルコールワイプできれいにします。次に、ラットを定位固定装置フレームに配置します。

滅菌したメスを使用して、頭蓋骨を縦方向に切り込みます。過度の出血を避けるために優しくしてください。その後、平らなヘラを使用して頭皮を開き、皮膚のフラップに外科用クリップを取り付けて開いたままにします。

非常に穏やかに骨膜を取り外して、ブレグマと針が挿入される頭蓋骨の領域を露出させます。その後、アームを脳定位固定装置フレームに取り付け、針の先端をブレグマの真上に動かし、先端が折れないように注意します。ブレグマの前後および内側の横座標に注釈を付け、針を目的の座標に移動します。

次に、針の先端が頭蓋骨にほぼ触れるまで針を下げ、定位固定アームを少し上げた後に穴あけスポットに印を付けます。髄膜と脳を傷つけないように注意しながら、マークされた場所に頭蓋骨をドリルで穴を開けます。次に、プラスチックパラフィンフィルムの小片を切り取り、頭蓋骨の上に置きます。

10マイクロリットルのピペットを使用して、溶液を一滴垂らし、プラスチックパラフィンフィルムに塗布します。ポンプを停止し、ポンプのプッシャーを少し取り出し、マイクロインジェクションシリンジのピストンをそっと引いて毛細血管に小さな気泡を作ります。針の先端を滴に達するまで下げます。

マイクロインジェクションシリンジのピストンを非常にゆっくりと引っ張ってサンプルを引き出し、気泡の形成を避けます。ピストンと接触しているポンププッシャーを交換し、毎分0.3マイクロリットルの流量でポンプをオンにします。次に、液滴が形成されるまで待ってから、次のステップに進みます。

その後、流量を毎分0.1マイクロリットルに下げます。ステンレス製のベベルチップ針で硬膜に切り込みを入れ、針をゆっくりと下げて脳組織に入ります。目的の位置に達したら、さらに0.1ミリメートル下がってから、ポンプを停止します。

定位アームを0.1ミリメートル上げ、毎分0.3マイクロリットルでポンプを再始動します。その後、タイマーとインジェクションを開始します。注入中の気泡の動きを監視します。

最後に、ポンプを停止し、5分間待ってからゆっくりと針を取り出します。石英針が完全に抜かれたら、ポンプを再度始動し、針の先端に液滴が形成されるかどうかを確認します。次に、頭蓋骨表面の開口部を骨ワックスで塞ぎます。

ホメオスタシスクリップを取り外し、頭皮を縫合します。傷の周りを抗生物質クリームでコーティングし、動物を自宅のケージに戻します。これらは、線条体レベルでのラット脳の8マイクロメートルの冠状切片です。

この画像は、26ゲージの鈍い端のステンレス鋼針を使用して、2マイクロリットルのACSFを注入することによって生じる損傷を示しています。逆に、石英針を注入した線条体は、検出可能な損傷を示しませんでした。これらの他の画像は、背側海馬のレベルで2本の針によって誘発された損傷を示しています。

しかし、石英針は検出可能な損傷を引き起こさなかった。両方の針による注射の成功は、トリパンブルーの分布によって示されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2時間で完了できます。

これらの手順に続いて、追加の手術など、重要なことはすべて、薬物誘発効果などのさまざまな質問に答えるために実行できます。この開発の後、この技術は、神経科学の分野の研究者が毒素と薬物、そして最近では動物モデルにおける遺伝子および細胞治療製品の影響を調査する道を開きました。このビデオを見た後、パーソナライズされた石英針を使用して、検出可能な病変なしに脳の深部領域にマイクロインジェクションを行う方法についてよく理解しているはずです。

レーザー解剖された試薬や病原体の使用は非常に危険であることを忘れないでください。また、この手順を実行するときは、レーザーの安全手順や個人用保護具などの予防措置を常に講じる必要があります。