パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

本手法の全体的な目的は、検出可能な組織損傷を引き起こさず、深部領域においても確実な注入を保証する、個別化された再利用可能な石英針を用いた脳微量注入プロトコルを精緻化することです。この手法は、神経変性疾患や精神疾患の病態生理、ならびにウイルスベクターや細胞移植による遺伝子治療および細胞治療の効果など、神経科学分野における重要な問いへの解明に寄与します。最大の利点は、これらの針が検出可能な組織損傷を一切引き起こさないため、脳深部領域への確実な注入が可能になることです。

これらは洗浄して再利用できるため、費用対効果が高くなります。この手順を開始するには、石英キャピラリーを蒸留水に5分間浸して洗浄および滅菌します。続いて、99% ethanolに5分間、次いでジエチルエーテルに5分間浸します。

その後、キャピラリーをフード内で少なくとも1時間放置し、完全に乾燥させます。その間に、レーザープルヤーを用いて細長く鋭い針を作製します。次に、あらかじめ70% ethanolで洗浄したペトリ皿に、作製した針を配置します。

ディッシュをプラスチック製パラフィンフィルムで覆います。次に、マイクロディセクターでキャピラリーを切断します。ニードルを顕微鏡ステージにしっかりと固定し、その先端をコンピュータ画面の中心に配置します。

メニューバーにある鉛筆アイコンをクリックし、針を切断する位置にマークを描画します。サイドバーの機能から「Start Cut」ボタンを含むフラグを選択し、レーザーで先ほどマークした箇所を切断します。必要に応じて、針を移動させずにマークを描画し、切断手順を繰り返すことでサイドホールを切断してください。

ニードルを切断後、プラスチックチューブを介して真空ポンプに接続します。次に、ポンプの電源を入れ、前方向の流量を3 µL/minに手動で設定します。その後、99% ethanolを吸引し、続いて蒸留水を吸引して、切断による不純物を除去します。

その後、乾燥を早めるために99%ethanolを再度吸引します。続いて、手術当日まで、適切に蓋をしたペトリ皿に針を保管してください。針を再利用する場合は、実験終了後に適切な洗剤と70%ethanolで洗浄し、注入液および付着した可能性のある組織残渣を除去してください。

必要に応じて、これらの針を蒸留水で満たした専用のガラス瓶で煮沸することも可能です。このステップでは、設定メニューを選択し、マイクロインジェクション用シリンジの容量あたりの直径に従ってポンプを校正してください。そして、流量を0.3 microliters per minuteに設定します。

次に、10 mLのシリンジに滅菌水を満たします。それを使用して、手動マイクロインジェクションポンプ用のマイクロインジェクションシリンジと注入アセンブリパーツキットを満たします。その後、針を手動マイクロインジェクションポンプキットに接続します。

マイクロインジェクション用シリンジの先端に水滴が残るようにピストンをゆっくりと押し込みながら、10 mLシリンジをマイクロインジェクション用シリンジから切り離します。次に、ピストンをマイクロインジェクション用シリンジに挿入します。その後、マイクロインジェクション用シリンジをポンプに接続し、流速を0.3 µL/minに設定します。

続いて、流速を0.1 µL/minに変更し、手術手順を開始します。手術を行うために、動物の頭部を剃毛し、アルコール綿で清浄します。次に、ラットを脳立体定位固定装置にセットします。

滅菌済みのメスを用いて、頭蓋骨に沿って正中切開を行います。過剰な出血を避けるため、慎重に操作してください。その後、平型スパチュラを用いて頭皮を開き、皮膚のフラップにサージカルクリップを装着して開いた状態を維持します。

骨膜を非常に慎重に剥離し、ブレグマおよび針を刺入する頭蓋骨の領域を露出させます。続いて、アームを脳定位固定装置に取り付け、針先が折れないように注意しながら、ブレグマの真上まで移動させます。ブレグマの前後および内外側の座標を記録し、針を目的の座標まで移動させます。

次に、ニードルを下げて先端が頭蓋骨にほぼ触れるまで近づけ、ステレオタキシスアームをわずかに上げて穿孔箇所に印を付けます。髄膜と脳を損傷しないように注意しながら、印を付けた箇所に頭蓋骨を穿孔します。続いて、プラスチック製パラフィンフィルムを小さく切り、頭蓋骨の上に配置します。

10 µLピペットを使用して、プラスチック製パラフィンフィルム上に適用するための溶液の液滴を作成します。ポンプを停止し、ポンプのプッシャーをわずかに戻して、マイクロインジェクション用シリンジのピストンをゆっくりと引くことで、キャピラリー内に小さな気泡を作ります。針先を液滴に到達するまで下げます。

気泡の形成を防ぐため、マイクロインジェクションシリンジのピストンを非常にゆっくりと引き、サンプルを吸い込みます。ポンププッシャーをピストンに接触させ、0.3 microliters per minuteの流速でポンプを起動します。その後、液滴が形成されるまで待機してから、次の手順に進んでください。

その後、流量を0.1 microliters per minuteまで下げます。ステンレス製のベベルチップ針で硬膜に切り込みを入れ、ゆっくりと針を下げて脳組織内に進入させます。目的の位置に達したら、さらに0.1 millimeters分深く進め、ポンプを停止させます。

ステレオタキシスアームを0.1 millimeters上昇させ、0.3 microliters per minuteでポンプを再始動します。その後、タイマーと注入を開始してください。注入中は気泡の動きをモニターします。

最後に、ポンプを停止させ、5分間待ってからゆっくりと針を回収します。クオーツ針を完全に抽出した後、再びポンプを始動させ、針先に液滴が形成されるかを確認します。次に、頭蓋骨表面の開口部をボーンワックスで封止します。

止血クリップを取り除き、頭皮を縫合します。創傷部位の周囲に抗生物質クリームを塗布し、動物をホームケージに戻します。これらは、線条体レベルにおけるラット脳の8 µm厚の冠状断面です。

この画像は、26ゲージの鈍端ステンレス製針を用いて2 µLのACSFを注入した際に生じた損傷を示しています。対照的に、クオーツ針で注入した線条体では、検出可能な損傷は見られませんでした。その他の画像は、背側海馬のレベルにおいて2種類の針によって誘発された損傷を示しています。

しかし、石英針では検出可能な損傷は認められませんでした。どちらの針を用いた注入も成功したことは、トリパンブルーの分布によって示されました。習熟すれば、適切に実施することでこの手技は2時間で完了させることができます。

これらの手順に従い、薬剤誘発効果など、異なる疑問に答えるための追加の手術などの必要な操作を行うことができます。この開発により、本手法は神経科学分野の研究者が、動物モデルを用いて毒素や薬剤、そしてより最近では遺伝子治療および細胞治療製品の効果を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、パーソナライズされた石英針を用いて、検出可能な病変を残さずに脳の深部領域へマイクロインジェクションを行う方法について十分に理解できるはずです。

レーザーで切除した試薬および病原体を使用することは非常に危険であることに留意してください。また、本手順を実施する際は、レーザー安全手順や個人用保護具の使用など、常に適切な予防措置を講じる必要があります。