Name: 成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ成体マウスにおける脊髄皮質下AAV9ベクター送達法。脊髄灰白質と白質全体に強力な遺伝子発現を誘導し、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄神経変性疾患のメカニズム解明と遺伝子治療研究を支援します。

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この研究は、SANPORCおよびALSA財団の助成金（Martin Marsala）によって支持された。国家持続可能性プログラム、プロジェクト番号LO1609（チェコ文部省、青少年スポーツ）。 RVO：67985904（Stefan JuhasとJana Juhasova）。

これらの試験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物実験および使用委員会の承認を受けたプロトコールのもとで実施され、動物実験のための動物実験ガイドライン評価協会に準拠しています。すべての研究は、群の大きさおよび動物の苦痛を最小限に抑えるように実施した。 1.一般的な動物および外科的調製物<ol><li> 手術を開始する前に、ウイルスを解凍する（AAV9-UBI-GFP;5μLアリコート） 8 。デキストラン粉末を蒸留水に混合して5％デキストラン（10,000 MW）溶液を調製する。ウイルス溶液を5％デキストラン溶液と1：1で混合し、2.5％の最終デキストラン濃度にする。 <ol><li>ウイルス溶液を氷上に保存する（4℃）。 </li></ol></li><li>成体C57BL / 6Jマウス（オスおよびメス、20〜30g）を使用する。 5％イソフルラン（O 2、1L /分）を用いてマウスを麻酔し、 2で維持する-3％は、呼吸速度及び足ピンチ応答に応じて、手術中、ノーズコーンによってイソフルラン（O 2中、1 L /分）吸入します。 </li><li>シェービングクリッパーで動物の背中を剃り、2％クロルヘキシジンで皮膚をきれいにする。 </li><li>慢性的な回復研究では、厳密な無菌技術に従う。 </li><li> 腰椎注射を行う場合は、Th8-L1椎骨の上にある皮膚をメスで切って、はさみを使ってTh10-12脊椎骨から傍脊椎筋を離します。 <ol><li>マウスの脊髄クランプを使用して動物を標準的な定位フレームにマウントする。 </li><li>亀裂が現れるまで歯科用ドリル（ドリルビット：0.9mm、速度：20,000rpm）を使用して、Th10-12椎骨の薄層の両面を剃る。 </li><li>割れた骨断片を鉗子で除去し、腰椎の背側表面を露出させる。 </li><li> 30Gステンレススチール針と鉗子を使用して約1cmの硬膜を切る。 </li></ol></li><li><s子宮頸部の皮下注射を行う場合は、はさみを使用して背根の皮膚を1.5〜2cm切開し、C1〜C2の部分を露出させる。 <ol><li> 23Gステンレス鋼の針と鉗子を使用して、大槽のアトランタ - 後頭皮膜を除去する。 </li><li>綿棒で組織や骨の破片の切開部位をきれいにします。 </li><li> 30Gのステンレス製の針と鉗子を使用して約2〜3mmの硬膜を切る。 </li></ol></li></ol> 2.膜貫通開口およびAAV9送達のための子宮頸部針挿入<ol><li>ガラス毛細管ホルダー（ 図1AおよびB ）を使用して、XYZマニピュレータのZアームに34 Gの貫通針を取り付けます。 注：貫通針を製造するために、34Gニードルの元の面取りされた先端は、ダイヤモンド研磨板を有するガラスキャピラリーベベル（荒い（5.0μm〜50μmの先端サイズ））および砥石角度15〜20°。針の先端（先端から測定して1mmの長さ）を約90°に緩やかに曲げます （ 図1B 、左のインサート）。 </li><li> 8-10倍に設定された外科的解剖スコープを使用して、Xアームを用いて約1mm（ 図1C ）の穿刺針で穿刺する。 <ol><li>組織の表面に針を通す角度を5~10°に保つ。 </li></ol></li><li>開口部を開いた後、Xアームを用いて平滑筋から水平に貫通した針を抜去する（ 図 1D）。 注：貫通した場所は、血管などのランドマークで覚えています。 </li><li> PE-10またはPE-20チューブを注射針に接続した50μLマイクロシリンジを用いて、鈍的36G注射針にAAV9-UBI-GFPウイルスをロードする。 </li><li>第2のXYZマニピュレータのZアームに針を取り付けます （ 図1A </stroガラスキャピラリーホルダ（ 図1B、右側インサート）を使用してNG&gt;及びB）。 注：サブプライアルAAV9注射針を製造するために、36G針の鈍い先端を、ダイヤモンド研磨板 - 粗い（5.0μm〜50μmの先端サイズ）を備えたガラスキャピラリーベベルを用いて研磨し、鋭いエッジを除去する。針の先端（先端から測定して2〜3mmの長さ）を緩やかに約90°に曲げる。穿刺針および穿刺針を1-2cm長の20Gスレーブステンレス鋼管（針の端から10mm）に挿入し、エポキシで接着する。ガラスキャピラリーホルダーに確実に取り付けるためには、直径20 mm（直径0.91 mm）のチューブを使用する必要があります。 </li><li>第2マニピュレータのX、Y、Zアームを操作することにより、AAV9注射針の先端を穿刺部位に位置させ、次にこれを使用して、 Xアーム（ 図1EおよびF ）。 注：1）AAV9-UBI-GFPは、以前のプロトコル9、10を報告し、最終力価は、mL当たり1.2×10 13ゲノムコピー（GC / mLで）に調整されるに従って調製されます。 2）容易に同定できるので、軟口蓋の部位をマークする必要はない（ 図1D ）。 </li><li> 50μLのマイクロシリンジを用いて、AAV9-UBI-GFP（1.5、3、または5μL）をサブスペースに注入します（実験グループについては表1を参照）。 </li><li> AAV9-UBI-GFP注入が完了した後、注射針をサブスペースから外す。 </li><li> 4.0モノフィラメント縫合糸と外科用クリップを使用して筋肉と肌を閉じます。 注記：開いた椎骨をシールする必要はありません。 </li><li>動物を加熱パッドで回復させる。 </li><li>疼痛管理のために、ブプレノルフィン0.05mg / kg / scを12時間毎に手術後2〜3日。 </li></ol>灌流固定、組織凍結保護、および免疫蛍光染色<ol><li>亜脂肪族AAV9注射後の所定の時点で、マウスを安楽死溶液（0.3mLの表を参照）で深く麻酔し、20mLのヘパリン処理した生理食塩水、次いで20mLのPBS中の4％パラホルムアルデヒドで経心灌流する。 </li><li>骨鉗子を使用して脊髄と脳を解剖し、PBS中の4％ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定する。 </li><li>最低5〜7日間、PBS中の30％スクロースで脊髄および脳を凍結保護する。 </li><li>クライオスタット上で、コロナ、トランスバース、または縦/横の凍結切片（厚さ30μm）を切り取り、PBSに4℃で保存します。 </li></ol> 4.脊髄および脳切片の免疫蛍光染色（材料表を参照） <ol><li>フリーフローティングセクションをprimarでインキュベートするy抗体を一晩インキュベートする。 </li><li>一次抗体とのインキュベーションの後、PBSで3回切片を洗浄し、蛍光結合ロバ抗ウサギ、ロバ抗チキンおよびロバ抗ヤギ二次抗体とともにインキュベートする。 </li><li>切片を顕微鏡スライド上に載せ、室温で乾燥させ、そして退色防止培地で覆う。 </li><li>落射蛍光顕微鏡（対物レンズ：10X、NA-0.3; 20X、NA-0.8;および63X、NA-1.4）を用いて画像を取り込む。 </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+SMA%3A+a+dose-response+study+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+fidelity+of+intrathecal+delivery+of+self-complementary+AAV9-survival+motor+neuron+1+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy.</a> Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).</li>
<li>Bell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+transduction+after+intracisternal+delivery+of+AAV9+in+a+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).</li>
<li>Miyanohara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+spinal+parenchymal+AAV9-mediated+gene+delivery+by+subpial+injection+in+adult+rats+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+knockdown+in+rat+dorsal+root+ganglia+mediated+by+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+5+following+intrathecal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 32581(2012).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
</ol>

Martin Marsalaは、Neurgain Technologies、Inc.（米国サンディエゴ）の共同設立者です。

現在の研究では、成体マウスにおける腹側ベクター（AAV9）送達の技術が記載されている。付属のビデオで実証されているように、確立され、試験された仕様に従って、必要な器具および穿刺針および胸骨下注射針が適切に製造されるならば、この手法および技法を効果的に使用することができる。 マウスにおける一貫した安全な副作用注射を行う際の重要な技術変数： 示されているように、子宮頸部または腰椎椎弓切除術の後、成体麻酔したマウスにおいて、小児の注射を容易に行うことができる。サブパーティクル注入技術の成功を定義するいくつかの重要な技術的変数があります。第1に、34Gの通気針の先端は、通気孔の円滑な穿刺を保証するために、ベベルを用いて一貫して鋭利にする必要がある。針が鋭利にされる方法に関する技術の不一致は、痛みを穿刺するにはあまりにも多くの力を使用することによって痛みの浸透中に起こり、および/または脊髄損傷を引き起こす可能性がある。通常の状況下では（ビデオおよび図1CおよびDに示されるように...

多様な脊髄およびCNS神経変性疾患を治療するためのAAVベクターの使用は、関心のある遺伝子の発現を効果的にアップレギュレートまたはサイレンシングするための十分に容認されたプラットフォームとなっている。 CNS /脊髄障害を治療するためのこの技術のより有効な利用に対する重要な制限の1つは、成人哺乳動物の深部脳または脊髄実質にAAVベクターを送達する能力が限られていることである。 それは大人の齧歯類、ネコ、または非ヒト霊長類におけるAAV9の全身送達は、脳や脊髄の1、2、3のニューロンに導入遺伝子発現を誘導することでのみ適度に有効であること、例えば、実証されました。 AAV9ベクターのより効果的な髄腔内送達は、解剖学的に定義されたニューロンのプールにおいて限られたトランスジーン発現しかもたらさないことも示されている。より具体的には、それは悪魔非ヒト霊長類、ブタ、またはげっ歯類におけるcisternalまたはlumbo-sacralの髄腔内髄腔内AAV9送達が、脊髄α-運動ニューロンおよび部分的な背根神経節ニューロンにおいて高レベルのトランスジーン発現をもたらすことを示している。しかし、脊髄介在ニューロン又は昇順または白質における下降軸索における最小または全く発現は、4、5、6、7を見ています。まとめると、これらのデータは、髄腔内に送達されたAAVのより深い脊柱実質への拡散を防止する、非常に有効な生物学的 - 解剖学的障壁が存在することを示す。 成体ラットおよびブタを用いた以前の研究では、新規な小児ベクター送達技術が開発された8 。このアプローチを使用して、単一ボーラスAAV9送達後に、非常に強力で多セグメントのトランスジーン発現が実証された。激しいGFP発現が一貫して見られた神経細胞、グリア細胞、および下垂/上行軸索において、注入された脊髄分節を通過する。この研究は、髄膜腔からの脊髄実質への効果的なAAV9の拡散を制限する主な障壁であることを初めて実証した。この以前に開発された技術および小児注射デバイスは、大きなげっ歯類（ラットのような）または成人のブタで使用するのが比較的容易であるが、成体マウスのような小型動物での使用には適していない。様々な神経変性障害の利用可能なトランスジェニックマウスモデルの数が多いため、マウスにおける効果的な脊柱 - 実質細胞ベクター送達技術の開発が明らかに必要とされている。そのような技術の利用可能性は、細胞非特異的（ 例えば、サイトメガロウイルス-CMVまたはユビキチン）または細胞特異的（ 例えば、シナプシンまたはグリア）を用いた特異的遺伝子サイレンシング（ 例えば、 shRNAを用いる）またはアップレギュレーションの研究を可能にする線維性酸性プロテイン（GFAP））プロモーターの活性を阻害する可能性がある。 したがって、本研究では、成体マウスにおいて効果的に使用され得る小型の小児ベクター送達システムを開発し、検証した。同様に、以前のラットおよびブタの研究の場合と同様に、この研究は、マウスにおける単球ボーラスsubpial AAV9送達後の脊柱実質全体にわたる有力なトランスジーン発現を実証する。このアプローチの単純さ、腹腔内AAV9送達に対する注射されたマウスの非常に良好な忍容性、および脊髄実質における導入遺伝子発現の高い効力は、この技術が任意の実験室環境において効果的に実施され得、脊髄遺伝子発現を標的とする実験において使用され得ることを示唆する。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>マウス用標準定位固定装置</td><td>ハーバード大学 装置</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>マウス脊髄アダプター</td><td>ハーバード大学装置</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>XYZ マニピュレーター</td><td>ストールティング</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>手動輸液ポンプ</td><td>ストールティング</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>34G 斜めのナノフィル針</td><td>世界の精密機器</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G鈍いナノフィル針</td><td>世界の精密機器</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>フルリソ、イソフルラン</td><td>MWI獣医用供給</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジン溶液</td><td>MWI獣医用供給</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>20Gステンレス鋼針</td><td>ベクトン-ディキンソン</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>23Gステンレス鋼針</td><td>ベクトン-ディキンソン</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>30Gステンレス鋼針</td><td>ベクトン-ディキンソン</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>綿チップアプリケー</td><td>ターMWI獣医供給</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管ベベラー&nbsp;</td><td>成茂国際</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>スライド顕微鏡 スーパーフロスト</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu;L マイクロシリンジ&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BDイントラメディックPE-20チューブ</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BDイントラメディックPE-10チューブ</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0モノフィラメント縫合</td><td>VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細血管ベベラー&nbsp;</td><td>成重ピ</td><td>ペットマイクログラインダー EG-40&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5分 エポキシ (エポキシ クリア)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>安楽死溶液</td><td>MWI 獣医用品</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン Inj 1,000 U/mL</td><td>MWI 獣医用品</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体</td><td>EMD-Millipore</td><td>ABN78</td><td>一次ウサギポリクローナル抗体, 1:1000</td></tr><tr><td>抗コリンアセチルトランスフェラーゼ (CHAT) 抗体</td><td>EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>一次ヤギポリクローナル抗体, 1:100</td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>一次ニワトリポリクローナル抗体, 1:1000</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>二次抗体, 1:1000</td></tr><tr><td>&nbsp;ロバ抗ウサギIgG二次抗体、Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td><td>二次抗体、1:1000</td></tr>ロ<tr><td>バ抗ニワトリIgY二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td>二次<td>抗体、1:1000</td></tr>ロ<tr><td>バ抗ヤギIgG H&L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150131</td><td>二次抗体、1:1000</td></tr><tr><td>スライド顕微鏡 スーパーフロスト</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>プロロングゴールド 退色防止封入剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ツァイ</td><td>ス ツァイス AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>蛍光共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD ウイルスベクターコアラボ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（aav9）ベクター送達

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

成体ラットおよびブタにおける亜麻痺性アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達技術の成功した開発は以前に報告されている。 AAV9送達のために下位に配置されたポリエチレンカテーテル（PE-10またはPE-5）を使用して、脊髄実質を介した潜在的なトランスジーン発現（白人および灰白質）が、浅部注射された脊髄セグメントにおいて実証されている。神経変性疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い範囲のため、成体マウスにおける強力な中枢神経系（CNS）標的化ベクター送達技術の開発に対する強い要望がある。したがって、本研究は、成体C57BL / 6Jマウスにおいて安全かつ有効な脊髄AAV9送達を可能にする脊髄小脳ベクター送達装置および技術の開発を記載する。脊椎固定化および麻酔したマウスでは、XYZマニピュレータを用いて、脊髄（頚部1および腰部1-2の脊髄分節レベル）を鋭利な34Gの針で切開した。第2のXYZma次いで、鈍い36G針を腰部および/または頸部の胸部空間に進めるために、ニプレーターを使用した。次いで、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするAAV9ベクター（3-5μL; 1.2×10 13ゲノムコピー（gc））を皮下注射した。注射後、神経機能（運動および感覚）を定期的に評価し、4％パラホルムアルデヒドでAAV9送達してから14日後に動物を灌流固定した。水平または横断脊髄切片の分析は、灰白質および白質の両方において、脊髄全体にわたって導入遺伝子発現を示した。さらに、強く逆行的に媒介されるGFP発現は、運動皮質、核破裂部および網様体における下行運動軸およびニューロンにおいて見られた。いずれの動物においても神経学的機能障害は認められなかった。これらのデータは、小児ベクター送達技術が、処置関連の脊髄損傷を引き起こすことなく、成体マウスにおいて首尾よく使用され得、非常に強力な導入遺伝子発現に関連することを示す脊髄神経叢全体にわたって

<html> 亜型AAV9注射部位における有力なトランスジーン発現： AAV9送達後14日目の脊髄切片における導入遺伝子（GFP）発現の分析は、脊髄実質全体にわたってAAV9用量依存性GFP発現を示した。第1に、上部腰椎腔に注入されたAAV9-UBI-GFPの2回の両側3μL注射は、腰部脊髄全体における白色および灰白質のほぼ完全な感染と関連し、上部胸部セグメントに及んだ（ 図2Aおよび2B 、左および中央の列）。 AAV9-UBI-GFPを上部腰椎腔に2回両側に1.5μL注射したところ、3μLの注射後に見られるように、腰部脊髄全体の白色および灰白質の同様のほぼ完全な感染と関連していた。しかし、中胸部セグメントは時折感染したニューロンのみを示した（ass = &quot;xfig&quot;&gt;図2B、右の列）。 α-motoneuron特異的（ChAT）およびニューロン特異的（NeuN）抗体による染色は、腰部α-運動ニューロン（...

本研究の目的は、成体マウスにおける新規な遺伝子サブ送達技術を用いて、脊髄アデノ随伴ウイルス9（AAV9）媒介遺伝子送達の効力および安全性を開発および検証することであった。

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

この軟膜下AAV9投与法の全体的な目的は、成マウスの脊髄全長の脊髄実質において強力なトランスジェーン発現を実現することです。この手法は、脊髄の遺伝子発現を操作することを目的とした研究を促進し、筋萎縮性側索硬化症、脊髄外傷、または慢性疼痛を含むいくつかの脊髄神経変性疾患のメカニズムの理解に役立ちます。この手法の主な利点は、軟膜下AAV9を注入したセグメントに隣接する複数の脊髄セグメントの脊髄灰白質および白質において、非常に強力なトランスジェーン発現が得られることです。硬膜開口の手順と軟膜下針の刺入は、視覚的な実演なしに習得することが困難であるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。手順の実演は、当研究室のポストドクトラルフェローであるTakahiro Tadokoroが行います。まず、手術のために動物を適切に麻酔させます。ここではイソフルランを使用します。次へ進む前に、足底圧刺激への反応がないことを確認し、眼科用軟膏で目を覆います。次に、バリカンで動物の背中を剃毛し、2%クロルヘキシジンで皮膚を清浄します。腰髄硬膜下注射を行う場合は、メスでT8からL1椎上の皮膚を切開し、その後、鋏を用いてT10からT12脊椎から傍脊柱筋を剥離します。マウス用脊髄クランプを用い、動物を標準的な脳定位固定装置に固定します。次に、歯科用ドリルを使用して、T10からT12椎骨の椎弓の両側を、亀裂が現れるまで削ります。その後、ピンセットで亀裂の入った骨片を除去し、腰髄の背面を露出させます。硬膜が見えたら、30ゲージのステンレス製針を用いて、硬膜に1～2 mmの切開を加えます。下層の軟膜を傷つけないよう、硬膜を慎重に切開することが重要です。次に、ピンセットで切開した硬膜の端を掴み、硬膜の開口部を最大5mmまで広げます。頚髄下軟膜注入を行う場合は、耳バーを用いてマウスの頭部を脳定位固定装置に固定し、ハサミで背側の頸部皮膚を1.5～2cm切開して、C1、C2分節および後頭骨を露出させます。次に、歯科用ドリルを用いて露出した後頭骨の一部を削り、ピンセットで骨片を除去します。その後、23ゲージのステンレス製針とピンセットを使用して、大後頭池の環椎後頭膜を除去します。綿棒を用いて切開部位から組織や骨の破片を清浄し、硬膜に2〜3 mmの切開を加えます。34ゲージの軟膜貫通針と36ゲージの注入針を、ガラスキャピラリーホルダーを用いて2台の独立したX, Y, ZマニピュレーターのZアームに取り付けます。次に、PE10またはPE20チューブで接続した50 µLマイクロシリンジを使用して、AAV9-UBI-GFPウイルスを充填します。ウイルスの充填後、チューブの端を注入針に接続します。次に、8～10倍に設定した手術用解剖顕微鏡で観察しながら、Xアームを使用して、軟膜貫通針を軟膜内に1 mmの深さまで刺入

subpial-adeno-associated-virus-9-aav9-vector-delivery-in-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、マウスの子犬における組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入を実演しています。この方法は、標的細胞における遺伝子発現の研究に役立ちます。...

組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入:げっ歯類モデルにおける導入遺伝子導入および心臓特異的発現のための技術

出典: Tadokoro, T., et al.成体マウスにおける軟膜下アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達J. Vis. 経験。(2017年)このビデオは、マウスの脊髄への遺伝子送達のための軟膜下注射技術を示しています。この手順には、硬膜を露出させ、軟膜に穿刺し、蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV)...

遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS...

中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

出典:Pourshafie, N., et al.げっ歯類の神経筋疾患を治療するための組換えアデノ随伴ウイルス血清型9を用いたマイクロRNAの全身送達J. Vis. Exp.

脊髄および眼球筋萎縮症マウスモデルにおける組換えアデノ随伴ベクターの注入

ここで我々 はマイクロ Rna 組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用して神経筋疾患のマウスモデルでの配信をについて説明します。単一の末梢投与マウスにおける筋と運動ニューロン、miRNA の機能を検討し、治療の潜在的なin vivoする機会を提供することで持続的な miRNA...

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1%...

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1)...

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。...

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。...

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

このレポートでは、マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子導入のための腎盂 を介した AAV...

アデノ随伴ウイルスベクターの低速逆行性腎盂注射 による マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子送達

学ぶ成体マウスにおける脊髄皮質下AAV9ベクター送達法。脊髄灰白質と白質全体に強力な遺伝子発現を誘導し、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄神経変性疾患のメカニズム解明と遺伝子治療研究を支援します。

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

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