双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

この手順の全体的な目標は、宿主ゲノム内のレトロウイルスベクター組み込み部位を特定し、それぞれが同じ組み込み部位を共有するクローン細胞集団の相対頻度を定量化することです。この方法は、宿主ゲノムベクターのどの部分が組み込まれているか、遺伝子操作された細胞が移植後にどのように再増殖するか、機能的にどのように異なるかなど、レトロウイルス遺伝子治療における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、上流と下流の両方のベクター宿主DNAジャンクションを同時にシーケンシングすることにより、レトロインテグレーション部位の配列をより高い精度と感度で解析できることです。

この方法は、遺伝子治療研究におけるベクターや遺伝子改変細胞の安全性に関する洞察を提供しますが、in vivoでの個々の細胞の挙動を調査するための他の基礎生物学研究にも適用できます。この手順の最初のステップは、解析対象のゲノムDNAの260ナノメートルと280ナノメートルでのDNA濃度と吸光度の比を決定することです。この後、ヌクレアーゼフリー水を使用して、サンプルゲノムDNAの1〜2マイクログラムを最終容量の170マイクロリットルのゲノムDNA溶液に希釈します。

200マイクロリットルのPCR反応を調製するには、以下のものを微量遠心チューブで混合します。各2.5マイクロリットルのHIV-1特異的ビオチンプライマー、または4つのレンチウイルス特異的プライマーの合計10マイクロリットル、20マイクロリットルの10倍耐熱性DNAポリメラーゼバッファー、4マイクロリットルの10ミリモルドーリンドNTP、3マイクロリットルの耐熱性DNAポリメラーゼ、および163マイクロリットルのゲノムDNAを混合します。溶液を4本のPCRチューブに均等に分割し、以下の条件下で1回の延長サイクルを行います。

5分間、56°Cで3分間、72°Cで5分間、保管は4°C。4つのPCR反応すべてを2ミリリットルの微量遠心チューブにプールします。PCR精製キットの製造元の手順に従って、50マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。

100マイクロリットルの消化に備えるために、50マイクロリットルのDNA、10XバッファーA10マイクロリットル、2マイクロリットルのRSAI酵素、および38マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。37°Cでサーマルサイクラーで1時間インキュベートします。

次に、1マイクロリットルのCviQI酵素を反応に加え、摂氏25度で30分間インキュベートします。RSAIとCviQIの消化が完了したら、すぐに鈍いエンディングで進めます。2.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼI、ラージフラグメント、および2マイクロリットルの10ミリモルdNTPを含む4.5マイクロリットルの混合物を調製します。

1マイクロリットルの混合物をDNAサンプルに移します。総容量は102マイクロリットルになります。ボルテックスでよく混ぜ合わせ、摂氏25度で1時間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、すぐにストレプトアビジンビーズ結合を進めてください。ビーズ溶液を短時間ボルテックスし、50マイクロリットルを新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに移すことにより、ストレプトアビジンビーズを調製します。磁気スタンドを使用して上清を取り除き、豆を200マイクロリットルの結合液で洗います。

ビーズを100マイクロリットルの結合溶液に再懸濁し、チューブを磁気スタンドから離して置きます。100マイクロリットルのサンプルDNAを100マイクロリットルの再懸濁ビーズ溶液に移し、溶液の泡立ちを避けるためにピペッティングで慎重に混合します。チューブを室温で3時間、回転ホイールでインキュベートします。

磁気スタンドを使用してビーズを捕捉し、上清を捨てます。ビーズを400マイクロリットルの洗浄液で2回、1X T4 DNAリガーゼ緩衝液の400マイクロリットルで2回洗浄します。ビーズを200マイクロリットルの1X T4 DNAリガーゼバッファーに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。

リンカーライゲーションは、ストレプトアビジンビーズ結合の直後に行う必要があります。2ミリリットルの微量遠心チューブで以下を混合することにより、400マイクロリットルのライゲーション反応溶液を調製します。0.5マイクロリットルのDNAリンカー、10マイクロリットルの10X T4 DNAリガーゼ緩衝液、20マイクロリットルの5X T4 DNAリガーゼ緩衝液、5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ、164.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、および200マイクロリットルの再懸濁ビーズ。

反応チューブを回転ホイールに室温で3時間置きます。ビーズを洗浄液で2回、1X耐熱性DNAポリメラーゼバッファーで2回洗浄します。ビーズを50マイクロリットルの1X耐熱性DNAポリメラーゼPCRバッファーに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。

この手順を開始するには、再懸濁したビーズに以下を添加して200マイクロリットルのPCR反応を準備します。10マイクロリットルの1Lプライマー、10マイクロリットルの1Rプライマー、20マイクロリットルのプライマーLink1、10マイクロリットルの10倍耐熱性DNAポリメラーゼ緩衝液、4マイクロリットルの10ミリモルドットNTPs、8マイクロリットルの耐熱性DNAポリメラーゼ、および88マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水。反応混合物を4本のPCRチューブに分注し、以下の条件でPCRを実施します。

94°Cで2分間、94°Cで20秒間、56°Cで25秒間、72°Cで2分間の25サイクル、最後に72°Cで5分間の延長を行います。4つのPCR反応すべてを2 mLの微量遠心チューブにプールします。PCR精製キットの手順に従って、50マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。

UV可視分光光度計を使用して、260ナノメートルと280ナノメートルでのDNA濃度と吸光度の比率を決定します。DNAは、次のステップに進む準備ができるまで、摂氏マイナス20度で保存できるようになりました。左接合部と右接合部特異的増幅の手順は、PCR で使用されるプライマーを除いて同一であるため、左接合部増幅のみを示します。

PCRチューブ内で以下を混合することにより、50マイクロリットルのPCR反応を調製します。5マイクロリットルのDNA、5マイクロリットルの10マイクロモル2Lプライマー、5マイクロリットルの10マイクロモルプライマーLink2、5マイクロリットルの10X耐熱性DNAポリメラーゼバッファー、1マイクロリットルの10ミリモルダーdNTPs、2マイクロリットルの耐熱性DNAポリメラーゼ、および27マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水。以下の条件でPCRを実施します。

94°Cで3分間、94°Cで20秒間、56°Cで25秒間、72°Cで2分間、最後に72°Cで5分間延長する8〜15サイクル。PCR精製キットを使用してDNAを精製し、50マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。260ナノメートルと280ナノメートルでのDNA濃度と吸光度の比率を決定します。

左右のジャンクション配列ライブラリを生成するための最後のステップは、キャピラリー電気泳動を行うことにより、PCRアンプリコンの長さの変動を分析することです。この代表的な結果は、上流および下流のベクターホストジャンクションの両方について、レンチウイルスベクターインテグレーション部位におけるPCRアンプリコンの長さが異なることを示しています。DNAサイズマーカーはMレーンにあります。

PCRアンプリコンのシーケンシング後、社内のプログラミングスクリプトを使用して、コンピュテーショナルインテグレーションサイトシーケンス解析を行います。双方向の組み込み部位アッセイは、キャピラリー電気泳動によって視覚化された上流と下流の両方のベクターホストジャンクションに対して、異なるサイズのPCRアンプリコンを生成します。ヒト化マウス再増殖細胞内のレンチウイルスベクターの遺伝子AluおよびL1リピートにおける遺伝子AluおよびL1リピートの共和率の比較により、ランダムに共和化イベントが生成され、共和部位が遺伝子に有意に濃縮されていることが明らかになりました。

ベクターインテグロームの相対検出頻度は、500bp 未満の PCR アンプリコンを生成するインテグレーションサイトジャンクションのシーケンスカウントのみを使用して計算しました。ベクトルの約77%は、双方向アプローチによって定量的に分析できました。クローン定量法では、個々のクローンが同じベクターインテグロームを共有していると仮定します。

左右の接合の相対周波数は、クローン集団の相対量、つまりQVIを表すために組み合わされます。この配色は、ヒト化マウス再増殖細胞における44個のQVIクローンの相対頻度を示しています。in silico 10, 000ランダム積分解析に基づくと、GTACモチーフ酵素を使用する場合はクローン周波数の1.25倍の過大評価が予想され、TCGAモチーフ酵素を使用する場合は2.56倍の過大評価が予想されます。

一度習得すると、このテクニックはパーツに分割し、適切に実行すれば2日で完了することができます。この手順を試みる際には、PCRステップは非常に感度が高く、汚染を避けるための予防策を講じる必要があることを覚えておくことが重要です。この技術は、治療用レトロウイルスベクターの安全性を調べ、アカゲザルへの移植後の造血幹細胞クローンの長期的な再増殖パターンを調査する道を開きました。