磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

これらの単離および分化プロトコルの全体的な目標は、血管周囲脂肪組織から脂肪細胞前駆細胞を取得し、成熟脂肪細胞への分化を誘導することです。この方法により、血管周囲脂肪組織から特異的で明確な脂肪細胞前駆細胞集団を解析することができ、その形態、生存率、増殖および分化の可能性への影響は最小限に抑えられます。この技術の主な利点は、蛍光活性化細胞ソーティングと比較して、脂肪組織のグラム当たりの抗原提示細胞の単離を増加させることです。

つま先のつま先つまみに対する反応の欠如を確認した後、腹腔にアクセスするために、ラットの会陰領域まで胸骨に沿って垂直な正中線切開を行います。上腸間膜動脈、小腸間膜抵抗血管、胸部大動脈を露出させ、腸間膜と大動脈へのすべての接続を切断します。性腺脂肪組織を採取し、単離した脂肪パッドをクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液またはKRBB溶液の新しい容器に移し、10ミリモルのヒープを補充します。

KRBB溶液が入ったシャーレに容器を移し、ディッシュを解剖顕微鏡下に置きます。小さな腸間膜抵抗血管と大動脈から血管周囲脂肪組織を取り除きます。バイオセーフティフードで、約50ミリグラムの組織を1ミリリットルのコラゲナーゼI型溶液が入った1.7ミリリットルのチューブに移し、組織を1〜3ミリメートルの断片にミンチします。

コラゲナーゼが結合組織に完全に浸透できるように、脂肪組織を適切にミンチすることが重要です。フラグメントを摂氏37度で1時間振とうしながらインキュベートします。次に、消化された材料を個々の100ミクロンおよび40ミクロンのセルストレーナーを介して50ミリリットルのチューブに順次ろ過します。

得られた濾液を遠心分離により回収し、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。細胞懸濁液を新しい1.7ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、室温で5分間インキュベートし、光から保護します。次に、間質血管画分細胞を別の遠心分離で収集し、ペレットを間質血管画分基礎培地に再懸濁してカウントします。

磁気活性化細胞ソーティングにより脂肪細胞前駆細胞を単離するには、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを磁気活性化細胞ソーティングブロッキングバッファーに再懸濁し、10〜6細胞/mLの濃度で4°Cで20分間インキュベートします。アイソレーションのすべてのステップは、氷上ではなく摂氏4度で行うことが不可欠です。次に、細胞を5マイクロリットルのFITC標識マウス抗CD34と30分間インキュベー

遠心分離により細胞を回収します。次に、4マイクロリットルの抗FITCマイクロビーズと96マイクロリットルの磁気活性化細胞ソーティングバッファーで細胞を暗所で5分間インキュベートします。細胞のインキュベーション中に、マルチソートカラムをマグネティックセパレーターにセットし、その下に5ミリリットルの廃液チューブを取り付けます。

500マイクロリットルの磁気活性化セルソーティングバッファーでカラムをすすぎ、廃液と廃液チューブを廃棄します。次に、カラムの下に新しいチューブを置き、細胞をカラムの上部にロードし、新しいコレクションチューブに標識されていないCD34陰性細胞を収集します。すべての細胞がカラムの上部を通過したら、脱気した500マイクロリットルの磁気活性化セルソーティングバッファーでカラムを3回洗浄し、溶出液をコレクションチューブにプールし続けます。

最後の洗浄後、カラムを新しい収集チューブに移し、カラムプランジャーを使用して1ミリリットルの磁気活性化細胞ソーティングバッファーをカラムからチューブに洗い流し、CD34陽性細胞を収集します。脂肪細胞前駆細胞を遠心分離により採取します。次に、CD34陽性画分を10マイクロリットルのウサギ抗血小板由来成長因子受容体αに30分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、細胞を再度遠心分離し、ペレットを4マイクロリットルの抗ウサギIgG Microビーズにインキュベートし、96マイクロリットルの磁気活性化細胞ソーティングバッファーでインキュベートして、血小板由来成長因子受容体アルファ陽性細胞の磁気ビーズを分離します。CD34陽性血小板由来成長因子受容体α陽性脂肪細胞前駆細胞を培養するには、基礎培地中の個々の6ウェル組織培養プレートに細胞を播種し、プレートを摂氏37度および5%二酸化炭素細胞培養インキュベーターに入れます。3回の連続継代後、細胞を黒色の96ウェル組織培養プレートに1×10〜2細胞/ウェルで播種し、8時間、24時間、48時間、96時間、1ウェルあたり10倍から4細胞目の5倍で、標準的な増殖アッセイプロトコルに従って24ウェルアッセイプレートで増殖を評価します。

脂肪形成を誘導するためには、脂肪細胞前駆細胞培養物がコンフルエントに達したら、脂肪細胞前駆細胞基礎培地を細胞に48時間供給し、次いで骨形態形成タンパク質4で培養物をさらに48時間処理する。3日目に、培地を脂肪細胞前駆細胞誘導培地に交換し、IBMXとエキサメタゾンを14日間使用しません。その後、培養物中の脂肪形成の程度は、標準的な脂肪生成アッセイプロトコルに従って、48ウェル組織培養プレートのウェルあたり10倍から4番目の細胞で評価できます。

どちらの方法も同様の細胞集団分布と生存率を示していますが、磁気活性化セルソーティング単離は、蛍光活性化セルソーティングと比較して、培養用の細胞数が多くなります。この代表的な実験では、雄ラットの胸部大動脈、腸間膜小血管、性腺脂肪組織から単離された磁気活性化細胞選別間質血管画分および脂肪細胞前駆細胞のin vitro増殖を、播種後8時間、24時間、48時間、96時間後に定量的DNAアッセイを用いて評価しました。胸部大動脈の脂肪細胞前駆細胞を除き、どの時点でも間質血管分率の増殖率に部位差は認められませんでした。ただし、胸部大動脈の脂肪細胞前駆細胞は、同じ部位の間質血管細胞と比較して96時間で増殖が少なかった。

骨形態形成タンパク質4によるコンフルエント脂肪細胞前駆細胞の48時間刺激は、蛍光脂質取り込みアッセイとオイルレッドO染色の両方によって評価されるように、液滴中のより大きな脂質蓄積によって証明される脂肪細胞の分化を誘導します。一度習得すると、このテクニックは正しく実行されれば、8時間で完了することができます。この手順を試行する際は、分離手順中に摂氏4度の温度を維持することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、脂肪細胞前駆細胞を単離し、分化させる方法についてよく理解できるはずです。