Name: 磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ磁気活性化細胞選別法による血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体単離と増殖・分化誘導法。この技術はFACSよりも高収率で細胞を得られ、形態と生存性を保ちながら成熟脂肪細胞への分化が可能です。

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Contreras and Watts Laboratoriesとウィリアム・ラファエル博士。これらの実験は、NHLBI F31 HL128035-01（組織消化プロトコル標準化）、NHLBI 5R01HL117847-02および2P01HL070687-11A1（動物）およびNHLBI 5R01HL117847-02（細胞単離および培養）によって支持された。

本書に記載されているすべての手順は、ミシガン州立大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）によって制定されたガイドラインに従います。すべてのバッファーとメディアを光から保護する必要があります。 緩衝液、培地および器具の調製<ol><li> （KRBB）：135mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、1mM硫酸マグネシウム、0.4mMリン酸二水素カリウム、5.5mMグルコース、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg / mLのストレプトマイシン、25μg/ mLのアンホテリシンB）、および10mMのHEPES（pH = 7.4）。この溶液は、4℃で滅菌した場合、3週間安定です。 </li><li>コラゲナーゼタイプ1溶液を調製する：4％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むKRBB中に1mg / mL。この溶液は37℃で保存し、4時間安定です。 </li><li>赤血球溶解緩衝溶液の調製：154mM塩化アンモニウム、10mM重炭酸カリウム、および0.1mMのEDTAを含む。 4℃で1ヶ月間保管してください。 </li><li> DMEM / F12培地、10％ウシ胎仔血清（FBS）、5％正常ロバ血清、40μL/ mL F（ab）断片ロバ抗ラットIgGを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。 </li><li> MCS緩衝溶液：リン酸緩衝食塩水（PBS、pH = 7.5）、0.5％BSA、および2mM EDTAを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。ガラス容器内で37℃に加熱し、次いで15秒間真空を適用することによって、脱ガス溶液。使用しないでください。 </li><li> （DMEM）：F12,15％ウシ胎児血清（FCS）、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg/ mLストレプトマイシン、25μgのストレプトマイシン、 / mLアンホテリシンB）、44.05mM重炭酸ナトリウム、100μMアスコルビン酸、33μMビオチン、17μMパントテン酸塩、2mM L-グルタミン、および20mM HEPES。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li><li> APC＆白血病抑制因子（10 ng / mL）、血小板由来増殖因子BB（10 ng / mL）、および塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎増殖培地（＃160;培地： 5ng / mL）。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li><li> APC誘導培地：10％FBS、2.5μg/ mLインスリン、0.5mM 2-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、1μMデキサメタゾン、および200μMT3（トリヨードチロニン甲状腺ホルモン）を含むAPC培地を調製する。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li></ol> 2.脂肪細胞前駆細胞の単離<ol><li>施設ガイドラインに従ってラットを麻酔する。ラットを背臥位に置く。つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、この痛みを伴う刺激に対する反射応答の喪失を確認します。 注：このプロトコールは、10週齢のSprague Dawleyラットおよび70mg / kgのペントバルビタールを腹腔内注射によって送達する。 </li><li> 垂直正中線切開を作る胸骨領域の胸骨に沿って、および会陰領域にi番目のはさみ。腹腔に入り、上腸間膜動脈、小腸腸間膜抵抗性血管（mPVAT）および胸部大動脈（aPVAT）を暴露する。 <ol><li>腸間膜および大動脈への接続をすべて切断し、動物から血管を取り除く。解剖顕微鏡とKRBBで満たされたペトリ皿を用いてPVATを分離し、血管を観察し、PVATを単離する。 </li><li>この実験では、非PVAT脂肪蓄積を表す生殖腺（GON）脂肪を収集する。 10mMのHEPES（pH = 7.4）を含むKRBBの氷上に単離された脂肪パッドを置く。 </li><li>バイオセーフティフードでは、約50mgの組織を、1mLのコラゲナーゼI型溶液を含む1.7mLチューブに移し、組織はさみ（1〜3mm片）で切ります。 </li></ol></li><li> Rotisserieインキュベーター（またはオービタルシェーカーを備えたインキュベーター）で37℃で1時間インキュベートしてサンプルを消化する。バイオセーフティフードでは、消化した物質を100および40<html> 50mLのチューブに移した。得られたろ液を4℃で10分間、300×gで遠心分離する。 注記：ここからのプロトコールの全てのステップは、細胞を無菌状態に保つためにバイオセーフティフード内で実施するものとする。 </li><li>上清を除去し、SVF細胞を含むペレットを1×赤血球溶解緩衝溶液1mLに再懸濁し、1.7mLの微量遠心管に移す。光から保護されたRTで5分間細胞をインキュベートし、4℃で300xgで5分間遠心分離する。 </li><li> SVF Basal Mediaに上清を残し、残りの細胞ペレットを再懸濁する。トリパンブルー溶液を用いて生細胞を計数するために20μLのサブサンプルを収集する。 注：隔離可能なSVF細胞の数は、サイトによって異なります。組織1mg当たりに採取されたSVFの平均数は、aPVAT = 5.0±2.0×10 3 、mPVAT = 1.04±0.62×10 4 、GON = 2.4±1.2× 10 5である 。 </li></ol> 3.磁気活性セルソーティング_content &quot;&gt;注：4℃ですべてのステップを実行することにより、CD34およびPDGFRα細胞表面マーカーに基づいてSVFからAPCを単離します。 <ol><li>細胞を300 x gで5分間スピンします。上清を捨て、細胞ペレットを1×10 6細胞/ mLでMCSブロッキング緩衝液に再懸濁し、20分間インキュベートする。 注：1×10 6〜2×10 8細胞/ mLの細胞懸濁液を効果的に分離することができます。 </li><li> 細胞を5μLのFITC結合マウス抗CD34（1μg/ 1×10 6細胞）と共に4℃で30分間インキュベートする。 300 xgおよび4℃で5分間細胞をスピンします。 <ol><li> 4μLの抗FITCマイクロビーズと96μLのMCSバッファー（全量100μL）と4℃で5分間、暗所でインキュベートし、CD34 +およびCD34 -細胞を分離する。 </li></ol></li><li>磁気分離器をスタンドに取り付け、列翼を前面に向けてMultiSort（MS）Columnをセパレータに置きます。 5 mL上部チューブホルダー内のMSカラムの下に置いてください。 </li><li> MCS Buffer SolutionでリンスしてMSカラムを調製します。カラムの上に500μLのMCS Bufferをアプライし、バッファを通過させます。流出液を廃棄し、回収チューブを交換する。 </li><li>抗体標識された細胞懸濁液を調製したMSカラムにロードする。未標識細胞を含むフロースルーを収集する。 </li><li>脱気したMCS緩衝液3×500μLでMSカラムを洗浄する。前のステップからの流れを通過して結合する非標識細胞を収集する。 </li><li>磁気分離器からMSカラムを取り外し、新しいコレクションチューブ上に置きます。 1mLのMCS緩衝液をMSカラムに注ぎます。直ちに磁気標識した細胞でフラクションをただちに洗い流しますが、カラムに供給されたプランジャーをゆっくりと加えて、余分なガスがカラムに入らないようにしてください。 注：単離された細胞数はサイトによって異なります。 SVF集団から単離されたCD34 + APCの平均数組織のmgは、aPVAT = 2.6±0.43x10 2 、mPVAT = 9.6±1.4x10 2 、GON = 1.3±0.22x10 3である 。 </li><li> 細胞を300×gおよび4℃で5分間スピンさせる。 1：200溶液/ 1×10 6細胞ウサギ抗PDGFRα10μL中に集めたCD34 +画分を4℃で30分間インキュベートする。 <ol><li> 300 xgおよび4℃で5分間細胞を再度遠心する。標識された細胞を抗ウサギIgGマイクロビーズ4μLおよびMCS緩衝液96μLとインキュベートし、3.3から3.7のステップを繰り返して単離する。 注：単離された細胞数はサイトによって異なります。組織1mgあたりのCD34 +集団から単離されたPDGFRα + APCの平均数は、aPVAT = 2.4±0.64、mPVAT = 8.4±2.4、GON = 10.4±1.9であり、これは以前に単離された集団の0.5~10％である。 </li></ol></li></ol> 4.細胞培養および脂肪生成誘導<ol><li> SVFの文化および2日間毎に交換する基礎培地中の6ウェル組織培養プレート中のAPCを含む。 3回の連続継代後、8ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、24ウェルプレートで50,000細胞/ウェルで評価される増殖アッセイのために1×10 2細胞/ウェルの黒色96ウェル組織培養プレートにプレートするか、定性的および定量的である脂肪生成アッセイのための48ウェル組織培養プレート中の10,000細胞/ウェル。 </li><li>分化のために示されたように、骨形成タンパク質4（3.3nmol / L）によるコンフルエント後48時間および誘導前のAPC基礎培地の補充。細胞をインキュベートするためにAPC誘導培地を用いて100％コンフルエンシー（0日目）の48時間後に細胞を誘導する。 </li><li> 48時間後、培地を交換して、IBMXおよびデキサメタゾンを含まないAPC誘導培地中で、14時間毎に培地を交換し、48時間ごとに細胞を維持する。 </li><li> FACSによって検証されたMCS分離。 <ol><li>磁気的に分離した50μL（50,000セル）のサブサンプルを取るFACS溶液で洗浄する。 </li><li>細胞を遠心分離し、PDGFRα +細胞を標識するロバ抗ウサギIgG Dylight 405の1：1,000溶液100μL中に再懸濁する。軽く、4℃で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメーターで488 nm（FITC）および405 nm（Dylight 405）フィルターを使用して解析するまで、細胞を洗浄し、2％ホルムアルデヒド溶液200μLで再懸濁します。 注：培養細胞による脂質蓄積は、蛍光を測定するマイクロプレートリーダーで脂質親和性脂肪生成蛍光アッセイを使用し、脂質蓄積のキャリブレーターとして前脂肪細胞を使用して定量的に評価する。脂質蓄積はまた、脂質色素を染色するかまたは含まない全細胞のパーセンテージを観察可能にする、カメラを備えた倒立顕微鏡で行われる脂質色素染色およびイメージングによって定性的に測定される。 485nmでの励起および572nmでの発光で蛍光を測定することができる任意のプレートリーダーnmは、デジタル画像を取り込むことができるカメラを備えた顕微鏡と同様に、分析にも適しています。 </li></ol></li></ol>

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<li>Bowers, R. R., Lane, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+bone+morphogenetic+protein-4+in+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development.</a> Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

本実験の中心的な焦点は、PVATデポからのAPCの単離、拡大、および脂肪生成誘発である。ここでは、表面マーカーCD34およびPDGFRαを発現する細胞の同定に基づいて、APCの単離のためのプロトコールを提示する。これらの表面タンパク質は、APC上で、高い増殖速度および様々な脂肪貯蔵庫14,15中の白色または褐色脂肪細胞に分化する可能性を伴って以前に同定された。これらの特異的マーカーに基づいて細胞を選択することにより、我々は選択されたPVATで観察される脂肪細胞表現型と一致する複数の脂肪蓄積から同様のAPC集団を単離することができた。我々の実験では、成長因子BMP4を補充することによってAPCの分化を改善した。これまで、Macotelaらは、内臓脂肪細胞由来の特定のAPC集団が、培養培地に脂肪増殖性成長因子BMP2またはBMP4が補充されない限り、分化した場合の皮下デポー12,16,17,18。 脂肪組織からの個々の細胞の単離は細胞の脆弱性のため困難であるため、MCSを使用することにより、消耗品、機器、およびトレーニングリソースのより少...

脈管周囲脂肪組織（PVAT）は、血管に近接しているため、脈管機能1における主要なパラクリンシグナル伝達成分である。この脂肪組織の拡大は、存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）の表現型に依存する2,3 。脂肪組織からの細胞の単離は、主要な脂肪細胞が壊れやすく、浮力があり、大きさの範囲があるため、困難である。特定の単離技術はまた、炎症性タンパク質合成を増加させ、脂肪生成遺伝子発現を減少させることによって細胞表現型および形態を変えることができ、細胞の完全性を維持するプロトコルの重要性を強調する。 初代細胞および特異的前脂肪細胞亜集団の培養は、インビボ増殖に対する還元主義的アプローチを提供し、同等の細胞遺伝的メイクアップ5を維持するが、これらの細胞の私は、老化や老化による劣化のために制限されています6 。皮下および大網デポーを含む様々な脂肪デポーからの前脂肪細胞もまた、特定の解剖学的部位から細胞を集めることの重要性を強調する増殖の差異7を示す。非PVAT白色脂肪細胞由来の前駆細胞は、以前の研究7,8,9において特徴付けられてきたが、PVAT APC表現型についてはあまり知られていない。 ここに記載された技術は、形態学、生存能力、および増殖および分化の可能性に最小限の影響を及ぼしながら、特異的および限定されたAPC集団の分析を可能にする。ビーズが細胞を変えずに溶解するので、磁気活性化細胞選別（MCS）は、培養などの下流の適用に適している。 MCSもまた経済的であり、一旦、抗体の欠点フローサイトメトリーアッセイの必要性は最小限に抑えられています。 PVAT前駆体を用いたインビトロ研究はまた、これらの初代細胞が有する可能性を垣間見ることができる。

<table><tbody><tr><td>組織解剖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>シリコン</td><td></td><td></td>で手作り</tr><tr><td>培養ペトリ皿</td><td>パイレックス</td><td></td><td>7740ガラス</td></tr><tr><td>シリコーンエラストマー</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード170</td><td>キット</td></tr><tr><td>編組シルク縫合</td><td>ハーバード装置</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>実体顕微鏡 MZ6</td><td>ライカ</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>ステレオマスター顕微鏡 光ファイバー光源</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>バンナスハサミ</td><td>ジョージ・ティーマン &Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>スプリンター鉗子</td><td>ジョージティーマン&Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュはさみ</td><td>ジョージティーマン&Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td>KRBB Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌</td><td>コーニング</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>コーニング</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><<tr><td>ストロング>ティッシュ 消化</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1 型</td><td>ワージントン 生化学</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解</td><td>バッファーBioLegend</td><td>420301</td><td>1Xワーキングソリューション</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2876</td>相互<td>振とうバス</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>ロティサリーインキュベーターダイ</td><td>ガー</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 &マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>イエロー40&micro;m Cell Strainer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Blue</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Cell Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Kit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM):F12 Medium</td><td>Corning</td><td>90-090</td><td>ミディアムベース</td></tr><tr><td>フェタル ウシ セラム (FBS)</td><td>コーニング</td><td>35016CV</td><td>USA オリジンズ</td></tr><tr><td>ノーマル ロバ セラム</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>アンチ CD34</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-7324</td><td>FITC 標識</td></tr><tr><td>抗 PDGFR&α;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr>ロ<tr><td>バ抗ウサギIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10X</td><td>コーニング</td><td>46-013-CM</td><td>1Xワーキングソリューション</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 セルインキュベータ</td>ー <td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&nbsp;</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td>TC 処理</td></tr><tr><td>48 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3548</td><td>TC 処理</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、黒壁</td><td>コーニング</td><td>353376</td><td>TC 処理</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>TC 処理</td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>コーニング</td><td>35011CV</td><td>米国原産</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>パントテーネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Corning</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>骨形態形成タンパク質 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>血小板由来成長因子 BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>コーニング</td><td>25-800-CR</td><td>ITS Solution</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (トリヨードチロニン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>Cell Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT Proliferation Assay Assay</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed Fluorescence Assay Reagent</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O Lipid Dye 試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>In Solution</td></tr><tr><td>M1000 マイクロプレート リーダー</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Sight DS-Qil カメラ</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

パラクラインシグナリングを介した血管機能の主要調節因子である血管周囲脂肪組織（PVAT）の拡大は、肥満時の高血圧の発症に直接関連する。肥大および過形成の程度は、デポの位置、性別、および存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）表現型のタイプに依存する。過去10年間のAPCおよび前脂肪細胞分離のために使用された技術は、個々の細胞が特定の細胞表面マーカーに基づいて同定され得る正確さを大幅に改善した。しかしながら、APCおよび脂肪細胞の単離は、特にインタクトな細胞を細胞培養適用のために保持しなければならない場合、細胞の脆弱性のために困難であり得る。 磁気活性化細胞選別（ MCS）は、脂肪組織の重量単位あたりより多くの生存APCを単離する方法を提供する。 MCSによって回収されたAPCは、インビトロプロトコールでプレア成長因子カクテルを使用してそれらを脂肪細胞に分化させ、細胞によって保持された多分性および脂肪生成能の分析を可能にする。この実験は、拡張中の心臓血管疾患の発症において重要な役割を果たす大動脈および腸間膜のPVATデポーに焦点を当てた。これらのプロトコルは、定義されたAPC集団を分離し、拡大し、そして区別するための方法を記載する。このMCSプロトコルは、最小限の設備またはトレーニングで細胞選別が必要なあらゆる実験で分離を使用することを可能にする。これらの技術は、細胞表面マーカーの存在に基づいて特定の細胞集団の機能性を決定するさらなる実験を助けることができる。

前脂肪細胞の増殖能力および脂肪細胞前駆体の脂肪生成能は、インビトロで維持される特性である11 。定量的DNAアッセイを用いてプレーティングした8,24,48および96時間後に、雄ラットのaPVAT、mPVAT、およびGONから単離したSVFおよびAPCのin vitro増殖を評価した。同じサイトのSVF細胞（ 図1 ）と比較して96時間の増殖が少ないaPVAT由来のAPCを除いて、SVF増殖率の部位差は、いかなる時点においても観察されなかった。 Bone Morphogenic Protein 4（BMP4）で刺激されたコンフルエントなAPCは、標準的な誘導の48時間前に分化を示した。これは、蛍光脂質取り込みアッセイ（ 図2A</st...

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

これらの単離および分化プロトコルの全体的な目的は、血管周囲脂肪組織から脂肪細胞前駆細胞を得て、それらを成熟脂肪細胞へと分化誘導することです。本手法により、血管周囲脂肪組織から、形態、生存率、および増殖・分化能への影響を最小限に抑えつつ、特異的かつ定義された脂肪細胞前駆細胞集団を解析することが可能になります。本技術の主な利点は、蛍光活性化細胞分取法（FACS）と比較して、脂肪組織1グラムあたりに単離できる抗原提示細胞の数を増加させられる点にあります。足趾つまみ刺激への反応がないことを確認した後、ラットの胸骨から会陰領域にかけて正中線に沿って垂直に切開し、腹腔に到達させます。上腸間膜動脈、小腸の腸間膜抵抗血管、および胸部大動脈を露出し、腸間膜および大動脈へのすべての接続を遮断します。生殖腺脂肪組織を採取し、分離した脂肪組織を10 mM HEPESを添加したKrebs-Ringer重炭酸緩衝液（KRBB溶液）の新しい容器に移します。血管をKRBB溶液を含むペトリ皿に移し、皿を解剖顕微鏡の下に置く。小腸腸間膜抵抗血管および大動脈から血管周囲脂肪組織を除去する。バイオセーフティフード内で、約50ミリグラムの組織を1ミリリットルのコラゲナーゼtype I溶液を含む1.7ミリリットルチューブに移し、組織を1〜3ミリメートルの大きさに細切する。コラゲナーゼが結合組織に十分に浸透するように、脂肪組織を適切に細切することが重要です。断片を37 °Cで1時間振盪しながらインキュベートします。その後、消化した材料を100 µmおよび40 µmのセルストレーナーで順にろ過し、50 mLチューブに回収します。遠心分離によって得られたろ液を回収し、ペレットを1 milliliterの赤血球溶解バッファーで再懸濁します。細胞懸濁液を新しい1.7 milliliterのマイクロチューブに移し、遮光した状態で室温で5分間インキュベートします。その後、再度遠心分離を行ってストローマ血管分画細胞を回収し、ペレットをストローマ血管分画基礎培地で再懸濁して計数します。磁気活性化細胞分取（MACS）により脂肪細胞前駆細胞を単離するため、遠心分離で細胞を回収し、細胞濃度 1 × 10⁶ cells/mL となるように磁気活性化細胞分取ブロッキングバッファーで再懸濁し、4 °C で20分間インキュベートします。単離の全工程は、氷上ではなく 4 °C で行うことが不可欠です。次に、5 µL の FITC 標識マウス抗 CD34 を加え、細胞を30分間インキュベートします。遠心分離により細胞を回収します。次に、細胞を96 µLの磁気活性化細胞分取（MACS）バッファーに懸濁し、4 µLのanti-FITC MicroBeadsを加えて、暗所で5分間インキュベートします。インキュベートしている間に、マルチソートカラムを磁気セパレーターにセットし、カラムの下に5 mLの廃液チューブを配置します。カラムを500 µLの磁気活性化細胞分取（MACS）バッファーで洗浄し、流出液と廃棄チューブを捨てます。次に、カラムの下に新しいチューブを設置し、カラムの上部に細胞をロードして、ラベルされていないCD34陰性細胞を新しい回収チューブに回収します。すべての細胞がカラムの上部を通過した後、脱気した500 µLの磁気活性化細胞分取（MACS）バッファーでカラムを3回洗浄し、溶出液を回収チューブにまとめ続けます。最後の洗浄後、カラムを新しい回収チューブに移し、カラムプランジャーを用いて1 milliliterの磁気活性化細胞分離（MACS）バッファーをカラムからチューブへと流し、CD34陽性細胞を回収します。遠心分離により脂肪細胞前駆細胞を回収してください。その後、CD34陽性画分を10 microlitersのウサギ抗血小板由来成長因子受容体α（anti-platelet-derived growth factor receptor alpha）とともに30分間インキュベートします。インキュベーションの終了後、細胞を再度遠心分離し、先ほど示した方法で血小板由来成長因子受容体α陽性細胞を磁気ビーズで単離するため、ペレットを96 µLの磁気活性化細胞分離バッファーに懸濁した4 µLのanti-rabbit IgG MicroBeads中でインキュベートします。CD34陽性かつ血小板由来成長因子受容体α陽性の脂肪細胞前駆細胞を培養するには、細胞を基礎培地を用いて個別の6ウェル組織培養プレートに播種し、プレートを37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに入れます。3回連続で継代した後、細胞を黒色の96ウェル組織培養プレートに1 × 10² cells/wellの密度で播種し、標準的な増殖アッセイプロトコルに従って、24ウェルアッセイプレートを用いて5 × 10⁴ cells/wellの密度で、8、24、48、および96時間後の増殖を評価します。脂肪細胞分化を誘導するため、脂肪細胞前駆細胞の培養がコンフルエントに達した時点で、脂肪細胞前駆細胞基礎培地を48時間添加し、その後、骨形成タンパク質4（bone morphogenic protein 4）でさらに48時間処理します。3日目に、培地をIBMXおよびエキサメサゾンを含まない脂肪細胞前駆細胞誘導培地に交換し、14日間培養します。その後、標準的な脂肪細胞分化アッセイプロトコルに従い、48ウェル組織培養プレートを用いて1ウェルあたり1×10⁴個の細胞で、培養物における脂肪細胞分化の程度を評価することができます。どちらの手法でも同様の細胞集団分布と生存率が示されましたが、磁気活性化細胞分離法は、蛍光活性化細胞分離法と比較して、培養に適したより多くの細胞を回収することができました。この代表的な実験では、雄ラットの胸部大動脈、小腸腸間膜抵抗血管、および生殖腺脂肪組織から分離した、磁気活性化細胞分離法によるストローマ血管分画および脂肪細胞前駆細胞のin vitro増殖を、播種後8、24、48、および96時間において定量DNAアッセイを用いて評価しました。ストローマ血管分画の増殖率に部位による差はどの時点でも認められませんでしたが、胸部大動脈由来の脂肪細胞前駆細胞のみ、同部位のストローマ血管細胞と比較して96時間時点での増殖が低いことが示されました。コンフルエントな脂肪細胞前駆細胞をbone morphogenic protein 4で48時間刺激すると、脂肪細胞への分化が誘導されます。これは、蛍光脂質取り込みアッセイおよびOil Red O染色の両方による評価で、液滴内への脂質蓄積の増加によって確認されます。この手法を習得すれば、正しく実施した場合、8時間で完了させることができます。本手順を行う際は、単離ステップの間、温度を4 degree Celsiusに維持することが重要です。このビデオを視聴することで、脂肪細胞前駆細胞の単離および分化誘導の方法について十分に理解することができます。

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

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マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

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磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

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