目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング ²⁺センサーキャッチャー ⁺

この実験の全体的な目標は、CatchER plusを使用したHEK293およびC2C12細胞の培養とトランスフェクション、およびNC2KDの測定におけるERSR受容体を介したカルシウム過渡現象のモニタリングへの応用に関する当社のプロトコルを表示することです。この方法は、基礎カルシウム濃度や特定細胞のERSRにおけるその急速な変化、これらの測定にバイオセンサーCatchER plusをどのように適用するかなど、カルシウムシグナル伝達とイメージングにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一細胞の蛍光応答を迅速な速度論でリアルタイムに記録できることです。

CatchER plusは、機能不全のカルシウムシグナル伝達要素から生じるこれらの細胞小器官の異常なカルシウム過渡現象を監視できるため、この技術の意味はERSRカルシウム関連疾患の診断にまで及びます。細胞培養と顕微鏡法には複数のエラー領域があるため、細胞トランスフェクションと蛍光イメージングのステップを学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるFlorence Reddishです。

この実験を開始するには、HEK293細胞を滅菌したガラス顕微鏡スライドの6cm皿に播種し、トランスフェクションの日に約70%コンフルエントになるまで1〜2日間培養します。次に、皿からDMEMを空にし、還元された血清培地を3ミリリットル加えます。次に、DNAトランスフェクション試薬混合物をディッシュに加え、摂氏37度で4〜6時間インキュベートします。

HEK293細胞のトランスフェクションは、一般的に他の細胞株よりも容易ですが、細胞は過酷な条件に対する回復力が低くなります。したがって、アポトーシスを避けるためには、トランスフェクション試薬に4〜6時間だけさらすことが重要です。4〜6時間後、5〜6ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄します。

HBSSを皿から捨て、3ミリリットルの新鮮なDMEMと交換します。その後、細胞を摂氏37度で48時間インキュベートして、GECIの発現を可能にします。C2C12筋芽細胞の場合は、皿の底を覆うために1〜2ミリリットルのトリプシンを追加して細胞をトリプシン化します。

次に、トリプシンが皿の底から細胞を緩めることができるように、皿を摂氏37度のインキュベーターに2〜6分間置きます。インキュベーションが完了したら、トリプシンを除去し、8ミリリットルのDMEMで細胞を吸引します。DMEMで細胞を完全にピペットで動かし、細胞を均一に分散させ、再懸濁します。

次に、それらを6cmの培養皿の滅菌カバースリップに播種し、次に3ミリリットルのDMEMを追加して60%の最終コンフルエンスを達成します。摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を5〜6ミリリットルのHBSSで洗浄します。

HBSSを皿から捨て、3ミリリットルの新鮮なDMEMと交換します。その後、摂氏37度で48時間インキュベートし、GECIを発現させます。この手順では、顕微鏡と光源の電源を入れてから、簡単なPCIプログラムを開きます。

綿棒を使用して、薄型のオープンダイヤモンドバスイメージングチャンバーの底をシーラントの薄層で覆います。次に、トランスフェクションされた細胞を含むスライドをインキュベーターから取り出し、摂氏37度に予熱した10ミリモルグルコースと1.8ミリモルカルシウムを含む約1ミリリットルのリンゲル緩衝液で3回穏やかですすいでください。細胞が乾燥するのを防ぐために、約1ミリリットルのリンガー緩衝液を皿に残し、鉗子を使用してスライドを皿から取り出します。

スライドの端を実験室の組織に触れて、余分な溶液を吸収します。次に、セルをグリースに向けてチャンバーの側面に置きます。その後、ドライバーを使用してチャンバーをステージマウントに固定します。

約1ミリリットルのリンガーバッファーをチャンバーに追加して、細胞が乾燥するのを防ぎながらステージに取り付けて顕微鏡のセットアップを完了します。顕微鏡対物レンズを40倍油浸対物レンズに切り替えます。対物レンズにイマージョンオイルを1滴加えます。

その後、マウントを顕微鏡ステージに置きます。次に、バキュームチップをチャンバーに入れて、溶液を水平に保ち、過剰に充填されないようにします。次に、コース調整を使用して、対物レンズのオイルがスライドの底に触れるまで対物レンズを上げます。

明視野モードを使用して、ゲインを175に、露光時間を0.03秒に調整して、セルに焦点を合わせます。細胞の焦点が合ったら、488ナノメートルの励起を使用して蛍光モードに切り替え、露光時間を0.07秒に変更します。イメージングに適した蛍光を発する健康な細胞が十分に存在する視野を見つけます。

次に、蛍光モードと明視野モードで写真を撮ります。セル内の関心領域を丸で囲むか、セル全体を円で囲んで、選択した領域からの強度を記録します。次に、フレームレートを5秒ごとに1に設定して強度測定を開始します。

ベースライン強度が 20 から 30 フレーム安定するまで待ちます。次に、最終濃度を200マイクロモルにするために必要な4-CMCの量を、450マイクロリットルの最終チャンバー容量に基づいて、20ミリモルストックから計算します。次に、60マイクロリットルのリンガー緩衝液をチャンバーから微量遠心チューブに慎重に移します。

計算された量の4-CMCをこの溶液で希釈し、チャンバーに戻して、イメージングする細胞から意図した応答を呼び起こします。薬物が受容体に結合し、その後のシグナルが減少するのを待ちます。.次に、3〜6ミリリットルのリンゲル緩衝液で細胞を洗浄すると同時に、イベントマーカーを添加します。

100マイクロモルATPおよび15マイクロモルCPAの手順を、各アッセイのトランスフェクション細胞の新しいスライドを使用して繰り返します。測定が完了したら、簡単なPCIプログラムの強度測定ウィンドウでデータ収集を終了します。続いて、細胞の蛍光および明視野写真を撮影します。

次に、実験のデータファイルを開きます。必要に応じて、関心のあるセルまたは領域を再丸で囲み、強度値を再計算します。NC2KDおよびC2C12筋芽細胞を測定するには、トランスフェクション手順を繰り返し、チャンバー内に1ミリリットルのカルシウムフリーリンゲル緩衝液を追加します。

0.002〜0.005%サポニンと細胞内バッファーで細胞を15〜30秒間透過処理し、サイトゾルにある可能性のあるCatchERプラスの細胞を空にします。次に、EGTAと10マイクロモルのイオノマイシンを含む3〜6ミリリットルのKCL緩衝液で細胞を洗浄します。プラトーに達するまで強度を下げます。

その後、10マイクロモルのイオノマイシンを含む3〜6ミリリットルのKCLバッファーで細胞をすすぎ、強度が安定するまで待ちます。その後、異なるカルシウム溶液を追加して、各追加の間に強度がプラトーに達するようにします。基礎カルシウム濃度定量用にセンサーを校正するには、EGTAと100ミリモルカルシウムバッファーを使用して、最小および最大の蛍光強度を取得します。

ここに示されているのは、CatchER plusをトランスフェクトした透過処理されたC2C12筋芽細胞から収集された正規化された強度の代表的な形質です。細胞を細胞内バッファー中の0.005%サポニンで15〜30秒間透過処理しました。EGTA溶液とカルシウム溶液はKCLバッファーで調製し、Nはイメージングされた細胞数を示します。

0.2、0.6、2、5、10、20、50、および100ミリモルのカルシウムを透過処理したC2C12筋芽細胞に10マイクロモルのイオノマイシンの存在下で添加し、3.1±1.4ミリモルのKDを得た。この図は、1ミリモルのEGTAと100ミリモルのカルシウムとそれぞれ10マイクロモルのイオノマイシンを添加した後の最小値と最大値でのCatchERとトランスフェクション細胞の代表的な強度測定値を示しています。

この技術を習得すると、イメージングには30〜60分、トランスフェクションを含めると3日で完了します。この手順を試みる際には、常に無菌環境で細胞を取り扱うこと、実験前に試薬を準備すること、チャンバーに均一なグリースの層を塗布すること、開始する前にバキュームを取り付けることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ウェスタンブロットなどの他の方法を実行して、CatchER plusの発現レベルなどの追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、カルシウムシグナル伝達およびイメージングの分野の研究者が哺乳類細胞におけるERSRカルシウム動態を調査する道を開きました。このビデオを見れば、CatchER plusを使用して細胞をトランスフェクションし、画像化する方法について十分に理解できるはずです。