Name: 目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング 2+センサーキャッチャー + (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶ CatchER+を用いたHEK293およびC2C12細胞のER/SRカルシウム動態モニタリング法。リアルタイム蛍光顕微鏡とin situ Kd測定による校正プロトコルを解説し、細胞内カルシウムシグナリングの理解と疾患診断への応用を示す。

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この研究は、NIH GM62999、NIH EB007268、NIH AG15820、B＆B種子グラント、NIH補完グラント、FR、BBフェローシップ、CM、RGへのCDTフェローシップによって資金提供されました。

1.スライドの準備<ol><li> 22cm×40mmのガラス顕微鏡スライドを6cmの細胞培養皿に置き、1皿あたり1枚のスライドを置く。 </li><li>滅菌フード内で滅菌するために、各スライドの各側面ならびに6cm皿を15〜20分間紫外線（UV）光に暴露する。 </li><li>パラフィルムでスライドを内側にしてカバーし、使用するまで4℃で保存します。 </li></ol>媒体、緩衝液、溶液および試薬の調製<ol><li>脱イオン水中のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1Lを調製し、10mM HEPES、5mM NaHCO 3 、および1mM EGTAを加える。 NaOHでpH7.2~7.3に調整する。フィルターを0.22μmフィルターでオートクレーブしたボトルに入れる。 </li><li>脱イオン水中の高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）900mLを調製する。 44mM NaHCO 3を添加し、HClでpHを7.2-7.3に調整する。オートクレーブされたボトルに0.22μmフィルターでろ過します。 100 mLの胎仔牛を加える。（FBS）を培地に添加して、FBS濃度を10％にした。 4℃で保存する。 </li><li>脱イオン水中の1Lの細胞内緩衝液（125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM CaCl 2、0.5mM EGTA、0.2mM MgCl 2 ）を調製し、pHを7.25に調整する。最終の[Ca 2+ ]は約100nMになるであろう。使用前に、0.5 mM ATPを添加する。室温で保管してください。 </li><li>脱イオン水中にリンゲル緩衝液（121mM NaCl、2.4mM K 2 HPO 4、0.4mM KH 2 PO 4、10mM HEPESおよび1.2mM MgCl 2 ）1Lを調製し、pHを7.2に調整する。室温で保管してください。使用するために、50mLチューブに50mLを分注し、1.8mM Ca 2+および10mMグルコースを加える。 </li><li>脱イオン水中のKClすすぎ溶液（125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM MgCl 2 ）1Lを調製し、pHを7.25に調整する。 </li><li>イオノマイシン5mgを1mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解する。マイクロチューブに30μLを等分し、-20℃で保存する。6; C。 </li><li> CPAをDMSOに溶解してシクロピアゾン酸（CPA）ストックを調製する。アポトーシスを防ぐために、細胞に加えたCPAのDMSOの最終パーセントが1％以下であることを確認してください。ろ過したH 2 Oに溶解し、37℃で振とうさせて一晩溶解させることにより、20 mM 4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）を調製する。濾過したH 2 Oを100mMに溶解してATPストックを調製する。 </li><li> インサイチュ K dを決定するために、100μlを用いて、KCl緩衝液中の1mM EGTA、0.2mM、0.6mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mMおよび100mMのCa 2+の各15mLを調製するmM EGTAストックおよび1M CaCl 2ストックを脱イオン水に溶解した。 </li></ol> 3.細胞培養<ol><li>培養C2C12筋芽細胞およびHEK293細胞を、無菌UVフード中の10cm細胞培養皿を用いて、ATCCプロトコールに従って培養した。 注：C2C12細胞は、筋芽細胞の分化が始まるため、〜70％以上のコンフルエンスまで増殖させてはならないteを筋管に挿入する。 HEK293細胞およびC2C12細胞はいずれも容易に増殖し、細胞の完全性を維持するために100％コンフルエンシーを超えて増殖することは許されない。さらに、細胞の健康を保つために実験に使用する前に、細胞を10倍以上継代するべきではありません。 </li></ol> 4. HEK293細胞のトランスフェクション<ol><li>滅菌した22mm×40mmのガラス顕微鏡スライド上にHEK293細胞を6cm皿でスライドさせ、トランスフェクションの日〜70％コンフルエントになるようにします。 </li><li>翌日、2μgのCatchER + cDNAおよび1：3（重量/体積）DNA：トランスフェクション試薬比を還元血清培地（ 例えば、 Opti-MEM）中で用いて、トランスフェクション試薬の製造業者のプロトコールに従って細胞をトランスフェクトする。 </li><li>ディッシュからDMEM培地を空にし、3mLの還元血清培地を加える。 DNA：トランスフェクション試薬混合物をディッシュに加え、37℃で4〜6時間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、5〜6mLのHBSSで細胞を洗浄する。 HBSS fを破棄する3 mLの新鮮なDMEMで置き換え、37℃で48時間インキュベートして、GECIの発現を可能にする。 </li><li> C2C12筋芽細胞のトランスフェクション <ol><li> C2C12筋芽細胞の場合、ディッシュの底を覆うのに十分なトリプシン（1-2 mL）を加えて細胞をトリプシン処理します。トリプシンが皿の底から細胞を緩めることができるように2-6分37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li>インキュベーションが完了したら、トリプシンを除去し、8mLのDMEM中で細胞を吸引する。細胞をDMEMで徹底的にピペットして、均一に分散させ、te細胞を再懸濁し、3mlのDMEMを含む6cmの細胞培養皿に無菌カバーグラス上に播種し、最終コンフルエントが60％になるようにする。 </li><li>ステップ4.2-4.3で概説したのと同じ日に細胞をトランスフェクションする。 37℃で24時間インキュベートする。 </li><li>ステップ4.4を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 5.スライド・蛍光顕微鏡の作製<ol><li> mをオンにするicroscopeと光源を開き、Simple PCIプログラムを開きます。顕微鏡を15-20分間またはCCDカメラが-65℃に冷えるまでウォーミングアップします。チャンバーを準備し、細胞を待ってスライドさせます。 </li><li>綿棒を使用して薄型のシーラント層で薄型オープンダイヤモンド浴イメージングチャンバの底を覆う。 </li><li>インキュベーターからトランスフェクションされた細胞を含むスライドを取り出し、37℃に予熱した10mMグルコースおよび1.8mM Ca 2+を含むリンガー緩衝液1mLで3回穏やかにすすぐ。 </li><li>細胞が乾燥しないように、ディッシュに1 mLのリンゲル緩衝液を残し、スライドを皿から取り出すために鉗子を使用します。余分な溶液を実験室の組織に吸着させるには、スライドの端に触れて実験室の組織に触れさせます。次にグリースが入ったチャンバーの側面に、細胞がグリースに向かって上になるように置き、ドライバーを使用してチャンバーをステージマウントに固定します。 </li><li> 1を加えるmLのリンガー緩衝液をチャンバーに添加して、チャンバーをステージ上に載せながら細胞が乾燥するのを防ぎ、残りの顕微鏡セットアップを完了させた。真空吸引ホースがチャンバに取り付けられると、チャンバが保持する最終容積は約450μLです。 </li><li>顕微鏡の対物レンズを40倍の油浸対物レンズに切り替えます。 </li><li>対物レンズを洗浄して乾燥させるには、レンズペーパーとレンズ洗浄液を使用してください。目的をこすらないでください。表面がきれいになるまで静かに拭きます。 </li><li> 1滴の液浸油を目的に加えます。 </li><li>マウントを顕微鏡ステージに置き、チャンバーに真空チップを追加します。真空吸引ホースがチャンバに取り付けられ、オンになると、チャンバが保持する最終容積は約450μLになります。この最終的な体積は、チャンバの側面と同じ高さである。実験中にチャンバー溶液が水平になって、オーバーフィルによる溶液の目的地への流出を防ぐことが不可欠です。 </li><li&gt;目的を上げ、目的のオイルがスライドの底に触れるまで粗調整を行います。 </li><li>明視野モードを使用して、ゲインを175に調整し、露光時間を0.03秒に設定してセルをフォーカスします。 </li><li>細胞が集束したら、488nm励起を用いて蛍光モードに切り替える。露光時間を0.07秒に変更してください。画像に適切な蛍光を発し、十分な細胞が健康である視野を探します。 </li><li>視野が選択されたら、蛍光と明視野モードで撮影します。 </li><li>細胞内の関心領域（ROI）を囲むか、選択した領域から強度を記録するために細胞全体を丸く囲みます。 </li></ol>画像化薬物誘発Ca 2+トランジェントおよびインサイチュ K d較正<ol><li>フレームレートを5秒ごとに1に設定して輝度測定を開始します。 </li><li>ベースライン強度を20〜30フレーム（100〜150秒）安定させる。必要に応じて、frを小さくするこのステップ中に、光退色を防止するために、1秒間に1回、 </li><li> 200μMの最終濃度にするために〜450μLの最終チャンバー容量に基づいて20mMストックから必要とされる4-cmcの量を計算する。必要に応じて株式を希釈する。 </li><li>慎重に、60μLのリンガー緩衝液をチャンバーから取り出し、マイクロ遠心チューブに入れます。この溶液で計算した4-cmcの量を希釈し、チャンバーに戻して、画像化されている細胞からの意図された応答を誘発する。 </li><li>計算された4-cmcの量をマイクロ遠心チューブに加え、ピペットで混合します。 </li><li>視野の上に穏やかにソリューションを追加すると同時に、強度測定でイベントマーカーを追加します。 </li><li>薬物が受容体に結合してシグナルが減少するまで時間をおいてから、1.8mM Ca 2+および10mMグルコースを含むリンゲル緩衝液3〜6mLで同時に洗浄しながら同時にイベントマーカーを加えます。チャンバ容積は450＆＃181; Lであり、真空に接続され、3〜6mLの緩衝液を添加することにより、薬物を含有する元の溶液が洗い流され、新たに添加された溶液と交換されることを確実にする。 </li><li>各アッセイにトランスフェクトされた細胞の新しいスライドを使用して、100μMATPおよび15μMCPAについて6.1-6.7を繰り返す。 </li><li>測定が完了したら、Simple PCIプログラムの強度測定ウィンドウでデータ収集を終了します。 </li><li>細胞の蛍光と明視野の写真を撮る。 </li><li>実験用のデータファイルを開きます。ここで、必要に応じて、強度値を再計算するために、細胞または関心領域を再円で囲む。 </li><li> C2C12筋芽細胞のin situ K dを決定するには 、セクション4.2およびセクション5に概説されたプロトコールに従い、0mM Ca 2+リンゲル緩衝液1mLをチャンバーに入れる。 <ol><li> 15〜30秒間、細胞内緩衝液中0.002〜0.005％サポニンで細胞を浸透させて、いずれかの細胞を空にする。CatchER +は細胞質ゾルに存在する可能性があります。 10μMイオノマイシンを含むKCl緩衝液中の1 mL EGTA 3〜6 mLで細胞を洗浄する。プラトーに達するまで強度を下げてください。 </li><li> 10μMのイオノマイシンを含む3〜6mLのKCl緩衝液ですすぎ、強度を安定させ、次いで、工程2.7で詳述した各Ca 2+溶液を加える。各添加の間に強度がプラトーに達するようにする。 </li></ol></li><li>基底[Ca 2+ ]定量のためにセンサーを較正するには、ステップ6.12に従ってください。ステップ2.7のEGTAおよび100 mM Ca 2+バッファーを使用して、最小および最大蛍光強度を取得します。 </li></ol> 7.データ処理<ol><li>強度測定データのスプレッドシートファイルをダウンロードします。 </li><li>各セルのデータをベースライン強度（F / F 0 ）に正規化する。任意のグラフ作成プログラムで時間に対する正規化データをプロットします。 </li><li> ％変化を計算するには、正規化されたピーク値1からueに100を掛けます。複数の細胞が画像化された場合の平均および標準偏差を計算します。 </li><li> SNRを計算するには、実験で保存した画像ファイルをImageJなどの画像処理ソフトウェアで開き、信号、トランスフェクトされた細胞、ノイズ、バックグラウンドを測定します。方程式SNR =信号/ノイズを使用してSNRを計算します。 </li><li>収集された蛍光イメージングデータからその場 K dを計算するために、各Ca 2+濃度およびEGTA（0mM Ca 2+ ）の添加後にプラトーを含む強度データを平均化する。 θ=（F - F min ）/（F max - F min ）を用いて分数飽和度（相対強度）を計算する。ここでθは相対強度であり、Fは任意の点での蛍光であり、F minは最小蛍光強度であり、 F maxは最大蛍光強度であり、tの強度の変化を見る彼は最小強度と比較してCa 2+の添加でプローブする。どのグラフ作成および曲線適合プログラムにおいても[Ca 2+ ]に対する相対強度データをプロットする。任意のグラフ化および曲線当てはめプログラムのために変換された1：1結合式θ= [M T ] /（K d + [M T ]）を使用してK dを計算する 。 M Tは全金属濃度である。 </li><li> 6.13に概説した較正からの基礎カルシウムを定量するために、1mM EGTA（F min ）および100mM Ca 2+ （F max ）の添加後のプラトーを含む強度データを平均する。基礎カルシウムを計算するには、較正式[Ca 2+ ] = K d （[F - F min ）/（F max - F）]を使用します。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

CatchER +のような蛍光プローブのライブシングルセルイメージングは​​、レセプターアゴニストまたはアンタゴニストに応答する各細胞の複雑なER / SR Ca 2+シグナル伝達プロセスを分析するのに有効な技術である。この技術は、Fura-2に必要なように複数の波長を同時に使用してイメージングを行う場合や、ERおよびサイトゾルカルシウムの両方の変化をそれぞれ監視するためにCatchER +とRhod-2を一緒にイメージングする場合にも役立ちます。このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。細胞トランスフェクションはイメージングの実行可能性に大きな影響を及ぼす可能性があります。トランスフェクション率が低いと、カルシウム応答をモニターするためのGECIの発現が不十分になることがあります。他方、CatchER +の過剰発現は、合成カルシウム色素に関連するER / ER Ca 2+に対する緩衝効果を有さない。 Ca 2+プローブの緩衝効果は、細胞小器官の[Ca 2+ ]、pのK ...

細胞内カルシウム（Ca 2+ ）過渡応答の時空間的な特性は、様々な生物学的機能を活性化する1 。これらのCa 2+シグナル伝達事象は、異なる刺激によって細胞外に誘発され、主要なCa 2+貯蔵オルガネラおよび多数のCa 2+ポンプ、チャネル、およびCa 2+結合タンパク質によって細胞内で制御される。 Ca 2+の過渡状態は、シグナルモジュレーションの欠陥の結果として大幅に変更され、異なる疾患2につながる可能性があります。中心にあるエンド - （ER）および筋小胞体（SR）を有するCa 2+シグナル伝達系の速度および複雑さのために、高速カイネティクスで哺乳動物発現のために最適化された遺伝子暗号化Ca 2+プローブが必要である異なる細胞における全球および局所Ca 2+変化を観察する3 。 ERとSR、筋肉細胞中のその対応物は、主要な細胞内Ca 2+貯蔵オルガネラであり、Ca 2+シグナルを増幅するのに役立つCa 2+シンクとして作用する4 。 ER / SRは、Ca 2+シグナリングの不可欠な部分であり、シグナルの送信と受信の2つの役割を担っています5 。リアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）は、Ca 2+ 6によって調節されるER / SRの膜上に位置するCa 2+放出受容体である。他の薬剤は、これらの受容体の機能を直接的または間接的に刺激する。 4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）はRyRの強力なアゴニストであり、両方ともRyR媒介性Ca 2+放出を研究するために定期的に使用されるSR Ca 2+放出を誘導するためにカフェインより10倍高い感度を有する健康な細胞と病気の細胞7 。 ATPはIP 3媒介性のCa 2+を増加させるIP 3 R 8をリースします。 ATPは、IP 3 Rに結合してER 9,10からCa 2+を放出するIP 3の産生を誘発する、プリン作動性受容体P2YR、Gタンパク質共役受容体（GPCR）に結合する。サルコ小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポンプは、細胞質Ca 2+を減少させER / SR内腔にイオンを能動的にポンピングすることによりER / SRを補充するER / SR膜上にも位置するP型ATPaseポンプである11 。 SERCAポンプの特異的阻害剤には、 アスペルギルス（Aspergillus ）およびペニシリウム（Penicillium）由来のタプシガルギン（thapsigargin ）、 タプシアガルガニカ （ Thapsia garganica）由来のタプシガルギン 、およびシクロピアゾン酸（CPA）が含まれる。 CPAはポンプに対する親和性が低く、Ca 2+アクセスポイント12を可逆的にブロックする。一方、タプシガルギンは、M3らせん中の残基F256のCa 2+遊離ポンプに不可逆的に結合するアフィニティー11 。 Ca 2+刺激事象に関与する変化を分析し、定量化することは、依然として課題であり、依然として課題である。 ER / SRは、Ca 2+シグナルの伝播における中心的機能を有する主要な細胞内Ca 2+含有区画であるので、多くの研究がER / SR Ca 2+シグナル伝達5の理解に集中している。 合成Ca 2+色素の生成は、Ca 2+イメージングの分野および実践を進歩させるのに役立った。 Mag-Fura-2のような色素は、異なる細胞（13,14,15）の区画化されたCa 2+を測定するために広く使用されているが、それらは不均一色素負荷、光退色、および特定の細胞小器官。緑色蛍光タンパク質（GFP）の発見および蛍光タンパク質 - タンパク質複合体の進歩は、Ca 2+プローブはCa 2+イメージングの分野を推進している16 。いくつかの既存のGECIは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、カルモジュリンおよびM13結合ペプチド17,18を含むフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）対である。トロポニンCに基づくGECIはまた、CFPおよびシトリンのFRET対として、および単一フルオロフォアプローブとして19,20,21として利用可能である。 GCaMP2およびR-GECOのような他のものは、カルモジュリンを含む単一のフルオロフォアセンサーである（ 22,23） 。それらのCa 2+結合ドメイン24に見られる複数のCa 2+結合部位に関連するK dおよび協同的結合の狭いチューニングの限界を克服するために、新規クラスのカルシウムセン細胞は、増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP） 25,26の発色団に感受性の高い位置で、βバレルの表面上にCa 2+結合部位を設計することによって作製された。 CatchERと呼ばれるこの高度に宣伝されたセンサーは、〜0.18mMのK d 、拡散限界近くのak、および700s -1の ak オフを有する。 CatchERは、HeLa、HEK293、およびC2C12 25のような異なる哺乳動物細胞株における受容体媒介ER / SRカルシウム放出をモニターするために使用されている。その速い動態のために、FDBにおいて2秒の脱分極の後に、より多くのCa 2+がSRに残ることを明らかにするために、若いおよび古いフレンドウイルスB NIHジャクソン（FVB）マウスのflexor digitorum brevis（FDB）筋繊維においてCatchERを使用した老齢マウスの繊維は若いマウスの繊維と比較して27 。 37℃でのその低い蛍光を克服するために、哺乳動物のカルシウムイメージングにおけるその応用を妨げているCatchER +と呼ばれるCatchERの改良版を開発しました。 CatchER +は、哺乳動物細胞でのより良い適用のために、37℃で蛍光を増強する。追加の突然変異をCatchERに組み込み、CatchER +を作製するために37℃で熱安定性および蛍光性を改善した。 CatchER +は、CatchER 30よりも信号対雑音比（SNR）が6倍に向上しています。 ここでは、CatchER +を用いたHEK293およびC2C12細胞の培養およびトランスフェクションのためのプロトコールおよびER / SRレセプター媒介カルシウム過渡状態をモニターするためのその適用が提示される。代表的な結果は、4-cmc、CPAおよびATPで処理したHEK293細胞で発現したCatchER +について示されている。本発明者らは、C2C12筋芽細胞およびQuaにおけるCatchER +の in situ K dを決定するためのプロトコールも提供する基底[Ca 2+ ]の存在化。

<table><tbody><tr><td>4-クロロ-3-メチルフェノール(4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXRダイクロイックミラー</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td>NC338059</tr><tr><td>アデノシン 5 & 三リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>EMD ミリポア</td><td>102382</td><td></td></tr> <tr><td>Σ-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>コーニング組織培養処理培養皿 (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>シクロピアゾン酸(CPA)</td><td>EMDミリポア</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニング111バルブ潤滑剤&シーラント</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>エチレンビス(オキシエチレンニトリロ) 四酢酸 (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドカバーグラス 22x40 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>ハンクスバランス塩 (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 遊離酸, 分子生物学グレード</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>自家蛍光なしの浸漬油</td><td>ライカ</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン, 遊離酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>ライカ DM6100B 倒立顕微鏡 冷却EM-CCDカメラ</td>付き <td>浜松</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>ロープロファイル オープンダイヤモンド バス イメージング チャンバー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム 六水和物</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>EMD ミリポア</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム, 二塩基性</td><td>EMD ミリポア</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム, 一塩基性</td><td>EMD ミリポア</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI 画像解析ソフトウェア</td><td>浜松</td><td>N / A</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td></td></tr>ステ<tr><td>リベックス-GV 0.22 & マイクロ;mフィルター</td><td>EMD ミリポア</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>ティル ポリクローム V キセノンランプ</td><td>ティルフォトニクス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (2.5%), フェノールレッドなし (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

目標とするcaを用いたer / srカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

細胞外刺激によって誘発される細胞内カルシウム（Ca 2+ ）過渡応答は、生体内で多数の生物学的プロセスを開始する。細胞内カルシウム放出の中心には、主要な細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ、小胞体（ER）および筋細胞におけるより特化した筋小胞体（SR）がある。これらのオルガネラからのカルシウムの動的放出は、サルコ/小胞体カルシウムATPase（SERCA）ポンプを介して再充填するリアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）によって媒介される。 ER / SRからの急速なカルシウム放出をモニターするために、CatchERと呼ばれる遺伝的にコード化されたカルシウムセンサー（GECI）を作成した。ここで、HEK293およびC2C12細胞における改善されたER / SR標的GECI CatchER +のトランスフェクションおよび発現の詳細なプロトコールおよびIP 3 R、RyRおよびSERCAポンプ媒介性カルシウム一過性のモニタリングにおけるその適用sの蛍光顕微鏡を用いたHEK293細胞の概要を概説する。選択されたレセプターアゴニストまたは阻害剤は、チャンバー溶液中に分散され、強度変化がリアルタイムで記録される。この方法では、4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）によるRyR活性化、アデノシン三リン酸（ATP）によるIP 3 Rの間接活性化、およびシクロピアゾン酸によるSERCAポンプの阻害によりERカルシウムの減少が見られる酸（CPA）。また、 in situ K dを決定し、C2C12細胞の基底[Ca 2+ ]を定量するためのプロトコールについても議論する。要約すると、CatchER +と組み合わせて使用​​されるこれらのプロトコールは、ER / SRカルシウム関連病理の研究における将来の適用と共に、ERからの受容体媒介性カルシウム放出を誘発することができる。

このセクションは、異なるレセプター媒介経路を介してER / SR Ca 2+の変化をモニターするために、最適化されたER / SR標的GECI CatchER +を用いて以前に記載された方法を用いて達成された結果を説明する。 図1は、200μMの4-cmcで刺激されたRyRを介したER排出を示す。 4-cmcはRyRのアゴニストである。薬物の添加は、CatchER +蛍光強度の減少によって測定されるように、ERカルシウムの減少を誘導する。マークされているように、ここに概説されたプロトコルは、ER Ca 2+の変化に関する情報を提供するCatchER +を使用して、受容体媒介Ca 2+過渡応答の可視化および測定を可能にする。 <p class="jove_...

我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER + in situ K d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

本実験の全体的な目的は、HEK293細胞およびC2C12細胞におけるCatchER plusの培養およびトランスフェクションのプロトコルを示し、NC2KDの測定におけるERSR受容体介在性カルシウム・トランジェントのモニタリングへの応用を提示することである。本手法は、特定の細胞のERSRにおける基底カルシウム濃度とその急速な変化など、カルシウムシグナリングおよびイメージングに関する主要な疑問への回答や、これらの測定にバイオセンサーCatchER plusをどのように適用するかに役立つ。本技術の主な利点は、単一細胞の蛍光応答を迅速なキネティクスでリアルタイムに記録できることである。CatchER plusは、カルシウムシグナル伝達因子の機能不全に起因するこれらのオルガネラ内での異常なカルシウム過渡現象をモニタリングできるため、本手法の意義はERSRカルシウム関連疾患の診断へと広がります。細胞培養と顕微鏡観察には誤りが生じやすい箇所が数多くあるため、細胞へのトランスフェクションおよび蛍光イメージングのステップを習得することは困難であり、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。本手順のデモンストレーションは、当研究室のポストドクであるFlorence Reddishが行います。本実験を開始するために、HEK293細胞を6cmディッシュ内の滅菌済みガラス顕微鏡スライド上に播種し、トランスフェクション当日までにコンフルエンシーが約70%になるまで1〜2日間培養します。次に、ディッシュからDMEMを取り除き、3mLの低血清培地を加えます。その後、DNAトランスフェクション試薬混合液をディッシュに加え、37°Cで4〜6時間インキュベートします。HEK293細胞へのトランスフェクションは、一般的に他の細胞株よりも容易ですが、過酷な条件に対する耐性は低くなっています。そのため、アポトーシスを避けるために、トランスフェクション試薬にさらす時間は4〜6時間に限定することが不可欠です。4〜6時間後、5〜6 mLのHBSSで細胞を洗浄してください。ディッシュからHBSSを除去し、3 mLの新鮮なDMEMに交換します。その後、GECIを発現させるため、細胞を37 °Cで48時間インキュベートします。C2C12筋芽細胞については、ディッシュの底面を覆うように1〜2 mLのトリプシンを加えて細胞をトリプシン処理します。次に、トリプシンによって細胞をディッシュの底面から剥離させるため、ディッシュを37 degrees Celsiusのインキュベーターに2〜6分間置きます。インキュベーション完了後、トリプシンを除去し、8 millilitersのDMEMで細胞を吸引します。DMEMを用いて細胞を十分にピペッティングし、細胞を均一に分散および再懸濁させます。次に、それらを6 cm培養皿内の滅菌済みカバースリップに播種し、3 mLのDMEMを加えて最終的なコンフルエンスを60%にします。その後、同日に細胞をトランスフェクションします。37 °Cで24時間インキュベートしてください。インキュベーション後、5～6 mLのHBSSで細胞を洗浄します。ディッシュからHBSSを除去し、3 mLの新鮮なDMEMに交換します。その後、GECIを発現させるため、37 °Cで48時間インキュベートします。この手順に合わせ、顕微鏡と光源の電源を入れ、simple PCIプログラムを起動してください。綿棒を使用して、低プロファイルオープンダイヤモンドバスイメージングチャンバーの底部をシーラントの薄い層で覆います。次に、トランスフェクションした細胞を含むスライドをインキュベーターから取り出し、37 °Cに予熱した10 mMグルコースおよび1.8 mMカルシウムを含むリンガー緩衝液約1 mLで、優しく3回洗浄します。細胞の乾燥を防ぐため、ディッシュ内にリンガー緩衝液を約1 mL残し、ピンセットでスライドをディッシュから取り出します。スライドの端をラボ用ティッシュに触れさせ、余分な溶液を吸収させます。次に、細胞がグリス側を向くようにして、チャンバーの側面に配置します。その後、ドライバーを使用してチャンバーをステージマウントに固定します。ステージへの設置および顕微鏡のセットアップを完了させる間、細胞の乾燥を防ぐため、チャンバーにRinger's bufferを約1 mL加えます。顕微鏡の対物レンズを40倍の油浸対物レンズに切り替えます。対物レンズに浸油を1滴滴下します。その後、マウントを顕微鏡ステージに設置します。次に、溶液の水平を維持し、溢れるのを防ぐために、真空チップをチャンバー内に配置します。続いて、対物レンズ上のオイルがスライドの底に触れるまで、粗動ネジを使用して対物レンズを上昇させます。明視野モードを使用し、ゲインを175に、露光時間を0.03秒に調整して細胞に焦点を合わせます。細胞に焦点が合ったら、488 nmの励起を用いる蛍光モードに切り替え、露光時間を0.07秒に変更します。イメージングに適した十分な蛍光強度を持つ健康な細胞が十分に存在する視野を探します。次に、蛍光モードおよび明視野モードで撮影します。細胞内の関心領域を囲むか、あるいは細胞全体を囲んで、選択した領域の強度を記録します。そして、フレームレートを5秒に1回に設定し、強度測定を開始します。ベースライン強度を20〜30フレームの間安定させます。次に、チャンバーの最終容量450 µLにおいて最終濃度が200 µMとなるように、20 mMストック溶液から必要な4-CMCの量を算出します。その後、チャンバーから60 µLのリンガー緩衝液をマイクロ遠心チューブに慎重に分注します。計算した量の4-CMCをこの溶液で希釈し、イメージング中の細胞に目的の反応を誘発させるためにチャンバーに戻します。薬剤が受容体に結合し、その後の信号低下が起こるまで時間を置きます。その後、イベントマーカーを同時に添加しながら、3〜6 mLのリンゲル緩衝液で細胞を洗浄します。各アッセイごとに、トランスフェクション済み細胞の新しいスライドを用いて、100 µM ATPおよび15 µM CPAに対する手順を繰り返します。測定が完了したら、simple PCIプログラムの強度測定ウィンドウでデータ収集を終了します。その後、細胞の蛍光画像および明視野画像を撮影します。次に、実験のデータファイルを開きます。必要に応じて、強度値を再計算するために、細胞または関心領域を再度囲みます。NC2KDおよびC2C12筋芽細胞を特定するには、トランスフェクションの手順を繰り返し、チャンバーに1 mLのカルシウムフリーリンゲル緩衝液を加えます。0.002〜0.005%サポニンおよび細胞内緩衝液を用いて細胞を15〜30秒間透過処理し、細胞質内に存在するCatchER plusを完全に除去します。その後、EGTAおよび10 µMイオノマイシンを含むKCL緩衝液3〜6 mLで細胞を洗浄します。強度がプラトーに達するまで低下するのを待ちます。続いて、10 µMのイオノマイシンを含むKCLバッファー3～6 mLで細胞を洗浄し、強度が安定するまで待ちます。その後、異なるカルシウム溶液を添加し、各添加の間に強度がプラトーに達するようにします。基底状態のカルシウム濃度の定量に向けてセンサーを校正するため、EGTAおよび100 mMカルシウムバッファーを用いて最小および最大の蛍光強度を測定します。ここでは、CatchER plusを導入し、透過処理を施したC2C12筋芽細胞から得られた正規化強度の代表的な特性を示します。細胞は、細胞内バッファー中の0.005%サポニンを用いて15〜30秒間透過処理されました。EGTAおよびカルシウム溶液はKCLバッファーで調製されており、Nはイメージングした細胞数を示します。これらの挿入蛍光画像は、処理前後の細胞の代表例である。10 µMのイオノマイシン存在下で、透過処理したC2C12筋芽細胞に0.2、0.6、2、5、10、20、50、および100 mMのカルシウムを添加し、3.1 ± 1.4 mMのKDを得た。この図は、1 mMのEGTAおよび10 µMのイオノマイシンを含む100 mMのカルシウムをそれぞれ添加した後の、CatchER陽性形質導入細胞における最小値および最大値の代表的な強度測定値を示している。この手法を習得すれば、イメージングには30〜60分、トランスフェクションを含める場合は3日間で完了できます。本手順を行う際は、常に無菌環境で細胞を取り扱うこと、実験前に試薬を準備しておくこと、チャンバーにグリースを均一に塗布すること、そして開始前に真空ポンプを接続しておくことが重要です。本手順の後、CatchER plusの発現レベルなどのさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロットなどの他の手法を実施することが可能です。この手法の開発により、カルシウムシグナリングおよびイメージング分野の研究者が、哺乳類細胞におけるERSRカルシウムダイナミクスを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、CatchER plusを用いて細胞にトランスフェクションを行い、イメージングする方法について十分に理解できるはずです。

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示し...

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）は、蛍光イメージングによる細胞内カルシウムストアのダイナミクスの解析をサポートしています。それは合成の低親和性のCaローカルマスキングを改善し、小胞体（ER）に換えカルボキシルエステラーゼの標的に対するメソッド拠点...

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

小胞体カルシウムの恒常性は、さまざまな病状で破壊されます。 分泌型小胞体カルシウムモニタリングタンパク質(SERCaMP)レポーターを使用して、小胞体カルシウム貯蔵の混乱を検出できます。  このプロトコルは、小胞体カルシウムの恒常性をin vitroおよびin vivoで調べるためのGaussia luciferase...

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2...

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2...

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

このプロトコルでは、ウイルスに感染したヒト腸オルガノイドでカルシウムイメージングを行うためのアプローチを説明し、分析へのアプローチを提供します。...

遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

学ぶ CatchER+を用いたHEK293およびC2C12細胞のER/SRカルシウム動態モニタリング法。リアルタイム蛍光顕微鏡とin situ Kd測定による校正プロトコルを解説し、細胞内カルシウムシグナリングの理解と疾患診断への応用を示す。

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング

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