単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル
2017年6月20日
このプロトコルは、単離され、灌流されたラット心臓から心臓間質液を収集する方法を記載している。冠状静脈流出液灌流液から間質液透過液を物理的に分離するために、Langendorff灌流心臓を反転させ、心臓表面上に形成された経液透過液（間質液）を軟質ラテックスキャップを用いて収集する。
この倒立心臓モデルの全体的な目標は、孤立したラットの心臓から心臓間質性滲出液を収集することです。鼓動する心臓の中で、心臓の個々の感覚がパラクリン因子を放出し、それらを周囲の間質液空間に放出します。これは重要です、なぜなら間質液空間は、心臓細胞間の通信のための情報を運ぶからです。
そして、それは梗塞性心筋の炎症と再生の条件下では特に重要です。このビデオでは、私の共同研究者であるDr.DingとTanが、この愛で、孤立した灌流されたラットの心臓の表面から間質液を収集する技術を紹介します。ラテックス製の心臓カバー、またはキャップを作るには、ラットの心臓の平均サイズに一致するアルミニウム型があり、超微細なエメリー紙で磨かれています。
金型のネックをフライス盤に垂直に固定し、金型をゆっくりと回転させ始めます。次に、20ミリリットルの液体ラテックスを50ミリリットルのガラスビーカーに注ぎ、回転する型をラテックスに浸るまで下げます。次に、ゆっくりと持ち上げて、ラテックスが固まるまでさらに15分間金型を回転させ続けます。
回転は、このムースを作り、液体ラテックスの層を金型の表面に均一に分配するために不可欠です。したがって、金型がラテックスから持ち上げられるときに回転していることを確認してください。ラテックスが乾いたら、ラテックスへの損傷を防ぐためにラテックスをタルカムパウダーでコーティングします。
回転を止めてから、金型を機械からそっと取り外します。ラテックスを型から慎重に取り出します。次に、長さ25センチメートルのシリコンチューブをラテックスキャップの出口に取り付けます。
このチューブは、間質性心臓滲出液(CT)を採取するために使用されます。次に、ラットサイズの心室バルーンをL字型の金属カニューレにしっかりと取り付け、1ミリリットルの水入り注射器に接続します。そして、ラットサイズの心室バルーンに水を入れます。シリンジを使用してバルーンを数回膨らませたり下げたりして、バルーンが気密であることを確認します。
次に、カニューレを3方向ストップを介して圧力トランスデューサーに接続します。最後に、脳室内圧の測定のためにバルーンが心室腔を満たすシリンジに印を付けます。心臓の準備を進める前に、テキストプロトコルに従ってランゲンドルフ灌流システムを準備します。
次に、300〜350グラムの雄のWistarラットを完全に麻酔した後、室温の手術台に移します。経験を積めば、心臓のカニューレ挿入につながる次のステップは約3分しかかからないはずです。鉗子を使って胸骨のすぐ下の皮膚と筋肉を持ち上げ、重いハサミで肋骨の下縁の周りを切ります。
次に、細いハサミで横隔膜のリブ縁に小さな切り込みを入れます。次に、肋骨の尾側を切って、腹側胸壁全体のフラップを作ります。次に、心臓をそっとつかみ、心臓血管が伸び始めるまでゆっくりと心臓を動かします。
次に、大動脈が完全に露出するまで心臓を切除し、50ミリリットルの氷冷KHBを含む100ミリリットルのビーカーに心臓を移します。次に、すぐに心臓を増殖装置に持っていき、大動脈を滴下するカニューレに取り付けます。気泡が心臓に入らないように、4-0縫合糸でしっかりと固定します。
次に、一定の滲出圧力または滲出流のいずれかを適用します。逆転した心臓のセットアップを確立するには、まず大動脈カニューレをゆっくりと回転させて、ハートの後壁が正面になるようにします。次に、結合組織を切り取り、左心房の開口部を露出させます。
次に、心臓を優しくつかみ、逆さまにします。準備した心室バルーンに心臓を取り付け、バルーンを収縮させ、左心室に送り込みます。心臓は、バルーンカテーテルアセンブリをサポートとして使用して、直立した状態で機械的に安定します。
プランジャーをフィルマークまで進めて、バルーンが心室腔全体を満たすまでバルーンを膨らませます。大動脈基部へのストレスが最小限になるように心臓を固定します。手順のこの部分には練習が必要です。
次に、バルーンのゲージを観察し、拡張期血圧を水銀柱の3〜5ミリメートルに調整します。圧力が正しく設定されている場合、心外膜に小さな液滴が形成されるはずです。次に、ラテックスキャップを心臓の上にそっと引っ張ります。
最も心室的な表面でさえも覆うべきです。先に進む前に、キャップ内部に気泡がないか確認してください。気泡を取り除くには、シリンジから穏やかに吸引します。
次に、レットチューブの端を心臓の10センチ下に配置します。滴下するCTを1.5ミリリットルのチューブに集め、氷と塩化ナトリウムの1:1の混合物にチューブを埋め込むことにより、チューブを摂氏4度未満に保ちます。0.15〜1.5ミリリットルのCTを採取し、サンプルを秤量して液体窒素でスナップ凍結します。
加工できるようになるまでマイナス80°Cで保管してください。逆転心臓モデルを100cmの水の一定圧力で後灌流すると、冠状静脈流出液の1/10〜1%を収集できます。CTのタンパク質含有量はBCAアッセイで測定され、平均1.1ミリグラム/ミリリットルでした。
単純なゲル電気泳動により、広範囲のタンパク質が明らかになりました。正常なサンプルを、2D DIGEを使用して50分間の虚血再灌流を行った心臓のサンプルと比較しました。虚血性心のCTでは、いくつかのタンパク質がアップレギュレーションされていることがわかった。
プロテオミクス解析は、アップレギュレーションされたタンパク質に対して行われました。プリン体も非常に興味深いものでした。プリン体は、特に虚血性損傷後に、心の免疫応答、血管運動緊張、および心機能を調節する極めて重要なシグナル伝達分子です。
CTのHPLC分析では、損傷した心臓に多くのプリン体濃度が高いことが示されました。この手順を試行する際には、孤立した心臓で形成される心臓トランスインデートが、インビーブフ状態の真の組成を完全に模倣するわけではないことを覚えておくことが重要です。
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概要
本プロトコルでは、摘出して灌流させたラット心臓から心腔間質液を回収する方法について説明します。この手法では、Langendorff灌流心臓を反転させることで、間質浸出液を冠静脈流出灌流液から分離させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心臓生理学
- 流体力学
- パラクリンシグナル伝達
背景
- 心臓は周囲の間質液にパラクリン因子を放出します。
- この液体は心筋細胞間のコミュニケーションにおいて極めて重要です。
- 間質液のダイナミクスを理解することは、炎症や心筋再生において重要です。
- 本研究では、液体回収のために心臓の反転モデルを利用しています。
研究目的
- 分離したラット心臓から心室間質浸出液を回収する。
- 心細胞間コミュニケーションにおける間質液の役割を調査する。
- 特定の条件下で心臓生理学を研究するための手法を開発する。
使用された手法
- Langendorff灌流法を用いたラット心臓の摘出。
- 液体回収を容易にするための心臓の反転。
- 間質液回収のためのソフトラテックスキャップの使用。
- ラット心臓のサイズに合わせたラテックスキャップ用アルミニウム型の手製。
主な結果
- 心表面からの間質液の回収に成功したこと。
- 実験室環境における本手法の有効性の実証。
- 心臓の健康および疾患における間質液の役割に関する知見。
- 心筋の炎症および再生の研究における潜在的な応用。
結論
- 本手法は、心臓の間質液を回収するための信頼性の高い方法を提供します。
- 間質液のダイナミクスを理解することで、心臓研究を深化させることができます。
- このプロトコールは、心筋細胞間のコミュニケーションに関するさらなる研究に応用可能です。
よくある質問
業界における重要性
本手法により、心臓の間質浸出液の直接サンプリングが可能となり、心機能や免疫応答を調節するパラクリンシグナル分子へのアクセスが得られます。冠静脈流出液から間質液を分離することで、疾患に関連するシグナル環境に関する機序的な知見が得られ、心血管系薬剤開発におけるターゲットバリデーションのリスクを低減できます。このアプローチは、虚血再灌流障害や炎症時に放出される内因性バイオマーカーを捕捉することで、リード化合物同定における予測精度を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：間質空間に放出される内因性パラクリン因子のサンプリングにより、治療仮説の検証が可能になる。
- 運用の価値：制御されたex vivo条件下で、機能的なターゲット検証を行うための疾患関連システムを提供する。
- 科学的価値：虚血性損傷に関連するプリン作動性代謝物およびタンパク質バイオマーカーの直接測定を通じて、メカニズムのデリスキング（リスク低減）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：心臓のシグナル伝達経路を標的とした下流のアッセイ開発に向け、バリデーション済みの生物学的試料を調製します。
- 運用的価値：HPLCおよびプロテオーム解析を通じて、化合物スクリーニングへの適用が可能な、標準化され再現性のある定量的な出力データを提供します。
- 科学的価値：制御された間質液微小環境において、内因性バイオマーカーの放出に対する化合物の影響を信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：虚血心臓浸出液において発現が上昇しているタンパク質およびプリン類を同定することで、トランスレーショナルなバイオマーカー探索と整合させる。
- 運用的価値：分離心臓モデルの生理学的妥当性を維持することにより、探索から前臨床検証までの連続性を確保する。
- 科学的価値：間質液の組成を心筋の炎症および再生プロセスに関連付けることで、リスク調整済みの進展判断を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
倒立心臓モデルは、表現型スクリーニングキャンペーンに先立ち、ターゲット選定やリード最適化の決定に資するメカニズム的な知見を提供することで、初期探索ワークフローに統合されます。
- 探索生物学：シグナル分子を含む間質液を直接サンプリングすることにより、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：プリン作動性代謝物のHPLCによる定量に適した標準化された浸出液サンプルを生成し、アッセイへの適用を可能にします。
- 分析：対照群と疾患状態との比較分析を可能にする、タンパク質および代謝物の定量的な測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：心筋梗塞および再灌流傷害モデルに関連するバイオマーカーを捕捉することで、前臨床研究との連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：パラクリンシグナルが関与する複数の治療領域にわたる、心血管標的バリデーションのための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：心臓のパラクリンシグナリングネットワークにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、予測の信頼性を高める。
- 運用上の価値：定義された灌流条件下での制御された流体回収により、標準化と再現性を向上させる。
- 戦略的価値：疾患関連システムにおけるターゲットエンゲージメントを反映する内因性バイオマーカーへの直接的なアクセスを提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：間質液におけるメカニズム的なバイオマーカー変調に基づいた、心血管系候補化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 心臓の摘出および逆行性カニューレ挿入には、ランゲンドルフ灌流および心臓外科手術の専門知識が必要です。
- 圧力トランスデューサー、バルーンカテーテル、温度制御回収システムなどの特殊な器具に依存します。
- 再現性のある結果を得るためには、液体ハンドリング、処理、および分析プロトコル（BCA、HPLC、2D DIGEなど）のチーム間での標準化が必要です。
- 生理学的な妥当性を維持するために、異なる心疾患状態（虚血再灌流、炎症など）に本モデルを適用する際の適応上の検討事項が含まれます。
- 浸出液の回収率の変動（17–147 µL/min）や、冠静脈流出液に対する希釈率（0.1–1%）といった実用上の制限があり、これらが分析物の検出感度に影響を与える可能性があります。
