Immunodetections または PCR の試金に適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖する迅速かつ効率的な方法

この手順の全体的な目標は、免疫検出またはPCRアッセイに適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖するための迅速かつ効率的な方法です。ここで説明する手順は、PCRアッセイまたは免疫検出プロトコルの実施に適した蛹の翼サンプルを得るための迅速かつ効率的な方法を見つけるという要求によって開発されました。濡れた絵筆を使用して、培養バイアルからゼロ時間APFの蛹を静かに取り出し、新しいバイアルに入れて開発期間を完了します。

たとえば、24時間APFの蛹を使用する場合、バイアルに22時間しか残らないことになります。22時間後、両面テープを接着した状態で蛹を顕微鏡スライドに移します。この転移は、蛹の損傷を避けるために絵筆を使用して行うことができます。

蛹は、背側を上にして頭側を同じ方向に向けて列を形成するように配置する必要があります。この後、顕微鏡スライドを一定温度に戻し、蛹が適切な発育時間を完了するのを待ちます。この場合、24 時間になります。

両面テープ付きの顕微鏡スライドは、蛹ケースを取り外すための一時的な解剖プラットフォームになります。顕微鏡スライド上の2時間の間に、蛹のケースは乾燥し、鉗子で簡単に壊れやすくなります。解剖の最初のステップは、枝肉から蛹を取り除くことです。

次に、蛹は両面テープが接着された別のスライドに移されます。死骸は残されます。この蛹は、腹側を上に向けて貼り付け、テープの中央に配置します。

ウィングカットを行う前に、免疫組織化学を用いた手順に従って蛹を溶液で覆わなければなりません。この溶液は接種性であり、翼はキューティクルから解放されます。鉗子を使用して、蛹のケースから蓋をそっと取り外します。

鉗子でケースを壊し、蛹の側面に沿ってその尾側の端まで線を引きます。適切な照明により、蛹の内部形状を視覚化することができ、蛹の翼のヒンジのすぐ上に明確なスペースを作ることができます。このスペースは、蛹を傷つけずに開口を行うためのガイドとして機能します。

ケースを横に開くと、ケースの一部を取り外し、開いた境界線で拾い上げて、両面テープで保持する反対側に運ぶことができます。解剖の終わりには、蛹はほとんど裸になります。ケースの一部だけが後部の先端を覆います。

鉗子の助けを借りて、ケースの残りの部分をそっと押し下げます。この動きにより、蛹の内側の端が上がり、頭と胸部の両方が優先位置に留まり、次のステップにくっつくことができます。両面テープで新しいスライドを取り、蛹の上で反転させます。

次に、少し押して蛹をテープにくっつけ、スライドをそっと滑らせて、残りのケースから蛹を取り除きます。顕微鏡のスライドを反転させます。蛹は、頭または胸部のレベルで背側に貼り付けられます。

免疫組織化学で使用するには、裸の蛹全体を4%パラホルムアルデヒドで覆います。アフィックスで10分後、はさみの助けを借りて、翼のヒンジ領域またはその近くで少し切開します。接辞が翼上皮に到達するのを待ちます。

次に、5分後、キューティクルの境界から鉗子で引き裂き、穴を広げて、キューティクル嚢からの翼上皮の放出を可能にします。翼組織が放出されたら、30分間の固定が完了するまでパラホルムアルデヒド溶液に入れておきます。このビデオで説明されている解剖法は、さまざまな種類の技術について、さまざまな開発段階からショウジョウバエの蛹の翅の高品質なサンプルを調製するために使用できます。

このプロトコルは、1匹の蛹または複数の蛹を同時に解剖するために実施することができる。これにより、手順が加速され、解剖された多数の翼に到達しやすくなります。開いたケースから裸の蛹を取り出すには、後端が十分に小さいことが重要です。

裸の蛹が4匹または5匹の列を同時に取り除くことは可能ですが、それは関係ないポイントであり、ケースに付着したままの蛹を1つの両面テープを使用して連続したステップで取り除くことができます。これは、24時間から30時間のAPFグライダーの共焦点画像です。染色は、パッチタンパク質、ヘッジホッグの標準的な受容体、核、アクチンフィラメントの発現を示しています。

同様の解剖プロセスを使用して、mRNAを単離するためのより大きな翼サンプルを採取できます。このmRNAは、PCR反応に使用できるcDNAの合成に使用できます。ここでは、パッチとアクチンの発現を検出するために得られた製品を示します。

このプロトコルは、翼の馴染み深い形態を保持する蛹の翼サンプルを得るための簡単な方法を提供します。これらの調製物から、2Dまたは3D画像として投影できる画像のスタックを取得し、翼の分化中のタンパク質の分布および/または濃縮を調査することができます。同様のプロトコルを使用して、PCR反応に不可欠な分子であるcDNAの合成に必要な大きな蛹の翼サンプルを収集することができます。

この手順は、すでに公開されている蛹の翼解剖の方法に代わる補完的なアプローチを提供します。