Name: 培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ 培養海馬神経細胞におけるシナプス小胞エンドサイトーシスの測定法。高解像度の光顕微鏡と電子顕微鏡を用いて、小胞動態と神経伝達の機構を詳細に可視化する手法を解説します。

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朱永陵先生にありがとう VAMP2 phluorin を提供するため、シナプトフィジン pHluorin2x 構造と博士ジェームズ e. ロスマンを提供します。彼らのテクニカル サポートおよびヘルプ、博士スーザン ・ チェンと組織プラスミノーゲンアクテベータ電子顕微鏡施設のバージニア クロッカーに感謝します。この作品は国立研究所の神経疾患と脳卒中学内研究プログラム米国の生命研究イニシアティブ プログラム (韓国生物医学科学者フェローシップ プログラム)、韓国研究所からの助成金によって支持されました。バイオ サイエンスとバイオ テクノロジー、大韓民国。

注: 次のプロトコルは、pHluorin イメージング法と培養海馬ニューロン pHluorin モニター シナプス小胞タンパク質吸収細胞内で使用されている EM 方法を説明しますと、EM はシナプス小胞の取り込みを検出し、。微細構造変化します。
 動物のケアとプロシージャの NIH ガイドラインに従った NIH 動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
 1 です。 pHluorin イメージング <ol><li>海馬ニューロンの文化 <ol><li>4 mM NaHCO 3 と 5 mM HEPES を組み合わせることによって準備海馬バッファー (HB) 5 M NaOH で pH 7.3 に調整。Neurobasal、中 2 %b27、0.5 mM L グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを混合することによって培養液を作る。さらに、HB バッファーと 20% の混合物を準備ウシ胎児血清 (FBS HB/20%). 
		注: この養殖のプロトコルは、Sankaranarayanan、ら に基づいてください。 29 日 呉 、ら 24</li> <li>培養液に 2 日目に生後 0 日間マウスの子犬の首をはねるし、4 ° C HB/20% FBS に脳を抽出します。脳幹、視床、なったを公開するを削除します。脳幹と視床の除去によってそれを公開した後、なったを分析し、新鮮な 4 ° C HB/20% FBS に転送します 。
		注: 通常、利回りは約 4 x 10 5 セル/mL 1 匹の子犬 (2 つなった) のです。ピンセットやはさみを使用して付着膜をきれいにし、新鮮な 4 ° C HB/20% FBS に転送します。海馬歯状回を引っ張り出すと、はさみで切断することによって、subiculum を分離し、新鮮な 4 ° C HB/20% FBS に転送します</li>。
		<li>約 10 スライスに端から端までを切断することによって各海馬を分割し、15 mL のポリプロピレンの円錐管にそれらを転送します</li>。
		<li>を解決する組織を可能にした後 HB/20% FBS の 10 mL で洗浄し、HB の 10 mL で 3 回洗う</li>。
		<li>は 137 mM の NaCl、KCl 5 mM、7 mM Na2HPO 4 25 mM HEPES、消化ソリューションを準備し、5 M NaOH で pH 7.2 に調整します。なったから上澄みを削除します。トリプシンの 10 mg と 1 mg DNase の消化液 2 mL を加えるし、サンプル ペレットに直接滅菌 0.22 μ m 膜を介してフィルターします</li>。
		<li>なった 37 ° C で 5 分間インキュベートし、HB/20% FBS の 10 mL で 2 回洗浄し、HB の 10 mL で 1 回洗浄.</li>
		<li>解離 MgSO 4 mg を 6 セル &#8729; 7 H 2 O と DNase の 1 mg 2 mL HB と、なった上に滅菌フィルター滅菌 0.22 μ m のフィルターを通してペレットします。軽く気泡を導入することを避けるために世話をしながらの慎重な triturating によって細胞を切り離します。2 分のために解決する組織微粒子を許可し、別のチューブに上清をゆっくり転送します</li>。
		<li>追加 3 mL HB/20% FBS に細胞懸濁液、および遠心分離、または 1,000 rpm、4 ° C で 10 分。上澄みを廃棄し、培地の再懸濁します</li>。
		<li>プレート 60,000 セル、coverslip オフ流出なしのポリ-D-リジン コーティングされた直径 25 mm coverslip の 150 μ L の培地の中断します。めっき後に予め温めておいた培 2 h の 2 mL を追加します。Coverslips 6 ウェル培養プレートまたは滅菌シャーレに保持されます</li>。
		<li>37 ° c 5% で維持する細胞の CO 2 は、14-21 日録音前の培地のインキュベーターを加湿しました。培地の上半分を週に 2 回変更文化成長中です</li>。
	</ol></li> <li>トランスフェクション <ol><li>メッキ後、6-7 日 transfect シナプトフィジン pHluorin 2 X (SpH) または海馬ニューロンに VAMP2 pHluorin。SpH、サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターは、pcDNA3 ベクトル 30 に挿入を使用します。VAMP2-pHluorin を使用して pCI ベクトル 31 挿入 CMV プロモーター</li>。
		<li>は、1 μ g のプラスミドを用いた標的細胞に脂質キャリアを使用していずれかのベクトルを transfect します。Transfection のため血清を欠いている、プロトコル手順 1.1.1 から培を使用します。毒性を軽減するトランスフェクション後中 2 h を変更します 。
		注: ボタンで、SpH の低式の場合細胞が健康でない限り、DNA 濃度を脂質キャリアと 2 μ g または培養時間を増加します。通常、4-10 セル (0.006 0.008%) 神経細胞のトランスフェクションした</li>。
	</ol></li> <li>光顕微鏡 <ol><li>119 mM 2 mM の CaCl 2、2.5 mM KCl、25 mM HEPES (pH 7.4) 30 mM グルコース 2 mM MgCl 2、0.01 mM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (塩化ナトリウムから成る生理食塩水の準備CNQX) は、0.05 mM DL-2-アミノ-5-phosphonovaleric 酸 (AP5)。刺激、潤滑剤、シール剤を使用してリークを回避することができるイメージング室培養培地プレートと場所から観察を取る。ガラス、カバーガラスのプレートから商工会議所への転送中にすぐに食塩通常 750 μ L を追加して乾燥させない 。
		注: CNQX と AP5 再発活動の可能性のあるシナプスの活動をブロックするために使用されました。配置する前に倒立蛍光顕微鏡の商工会議所は商工会議所が漏れていないことを確認するのに洗浄ティッシュを使用します。屈折率の変化の結果通常生理食塩水および水浸オイルの混合によって記録中にフォーカスの変更を引き起こす遅い漏れ</li>。
		<li>メタルハライド ランプとレンズの刺激と <ol><li>画像 60 X で広視野倒立顕微鏡上 (1.4 開口) オイルの液浸を記録します。480 の励起ピーク設定フィルター pHluorin を視覚化するフリップ マニュアル 500 550 nm 発光フィルター、490 nm ロングパス鏡 nm。電子乗算電荷結合デバイス (EMCCD) カメラを使用して 2 x 2 のビニングと 100 ms 毎の画像をキャプチャします 。
			注: いくつかの機能は、退色、画像キャプチャ間隔を含むを避けるために適切な条件を達成してフィルター処理に考慮すべき、ビニング、機器に依存しています。共焦点レーザー顕微鏡の場合、レーザー パワーと暴露時間退色を避けるために見なす必要があります。刺激がなければ、少なくとも 3 分を記録した後セットアップを決定し、少なくとも 10 の記録を行った退色をチェックするための刺激がなければ s.</li>
			<li>は、各実験の研究分析の容易さのための高密度エリアを選択します。ブートン、ボタン間の連続式の円形または楕円形の表現パターンに重点を置いて、緑の蛍光性信号によって transfected セルを識別します</li>。
			<li>を使用して 1 刺激による誘発エンドサイトーシス ms パルス、20 mA 活動電位 (AP) パルス刺激装置から供給および白金電極刺激・ アイソレーション ・ ユニット内で配信。刺激と細胞回復中にわたって蛍光活性をイメージします 。
			注: 死んでいるセルの場合式生活研究より強かったし、ボタン間斑点状のパターンを示した</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>画像解析 <ol><li>単一のブートンで蛍光強度を分析するため設定を地域の関心 (ROI) 1.5 倍の 1.5 μ m 正方形;ブートンのサイズは約 1.5 μ m 使用退色を確認し、背景として減算への刺激の前にトレース内です</li>。
		<li>正規化蛍光式 (ΔF) を変更: <img alt="Equation"height="11"src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg"width="172"/> 、F 最大 F 0 を参照してください最大増加刺激後・ ベースライン蛍光、それぞれ。として測定するエンドサイトーシス速度減衰率最初 4-10 s pHluorin 蛍光の最大のポイントの後。エンドサイトーシスの継手ベースライン モノラル指数関数にするピーク増加から pHluorin 蛍光減衰時定数 (τ) を取得します</li>。
	</ol></li></ol> 2。電子顕微鏡 <ol><li>準備ポリ-D-リジン コーティング 6 ウェル プレート、常温で 1 h の各ウェルに 0.01% 無菌ろ過ポリ-D-リジン溶液 1.5 mL を適用し、滅菌水で 3 回を洗浄します。分析、文化、1.1.1、1.1.2、1.1.3 の手順のように海馬ニューロンをそれぞれ保持します</li>。
	<li>準備 31.5 mM の NaCl、2 mM CaCl 2、90 mM KCl、25 mM HEPES (pH 7.4) 30 mM グルコースとして HRP に高 K + 刺激ソリューション pH 5 m 7.4 に調整する 2 mM MgCl 2、CNQX 0.01 mM、0.05 mM AP5、5 mg/mL HRP、NaOH。
	<ol><li>1.5 ml の高い海馬ニューロンの文化を刺激するため K + 刺激ソリューション室温 (呼ばれる K +) 各ウェルに 1.5 mL の添加により 90 で s。90 の HRP を 5 mg/mL の同じ濃度を適用 (R と呼ばれる) 静止状態で s、生理食塩水で。回収サンプルの K + サンプル高 K + 刺激ソリューションを適用し、急速に洗って食塩に置き換えるし、10 分間インキュベート</li>
	</ol></li> <li>固定および汚損 <ol><li>pH 7.4 で 21.4 グラム/L の Na cacodylate を使用して 0.1 M Na cacodylate バッファーを準備します。室温で少なくとも 1 時間 0.1 M Na cacodylate バッファーの 4% グルタルアルデヒドでセルを修復します。7 分の 0.1 M Na cacodylate バッファーで 3 回洗って</li>。
		<li>準備ジアミノベンジジン (軽打) ソリューションでは、0.5 mg/mL から成る軽く H 2 O 2 ddH 2 O、0.22 μ m フィルターでフィルターで 0.3%。3 回 7 分の 0.1 M Na cacodylate バッファーを 37 ° c. の洗浄で 30 分の 1.5 mL DAB ソリューションを適用します 。
		注意: DAB は有害と疑われる発がん性物質です。手袋、白衣を使用してください 。
		注: 軽打とラベリング H 2 O 2、その酸化による HRP により触媒とに発生します。サンプルでは、増加する信号のコンポーネントの結果に小さな増加。HRP の濃度を増加させる、触媒の効果がスピードアップします。H 2 O 2 の十分に大きい濃度 32 をラベリングの効果を阻害すると HRP、副反応を衰弱させるを可能にします。今回、このラベリング システムの濃度は現在利用可能な研究 33 , 34 に基づいて選ばれた</li>。
		<li>では、0.1 M Na cacodylate 緩衝固定の記事、4 ° C で 1 時間に 1% OsO 4 の 1.5 mL でニューロンを孵化させなさい。7 分の 0.1 M Na cacodylate バッファーの 1.5 mL で 3 回洗って 。
		注意: 毒性と OsO 4 の反応性のため氷のサンプルをおいて化学フードは孵化に冷蔵庫を使用する多くの場合望ましい</li>。
		<li>準備 0.1 M 酢酸緩衝液 13.61 グラム/L のナトリウム酢酸と 11.43 mL/L 氷酢酸で ph 5.0。1.5 mL の 0.1 M 酢酸緩衝液 pH 5.0 7 分間で 3 回洗浄し、pH 5.0 4 で 1 時間で 0.1 M 酢酸緩衝液で 1.5 mL 1 %005. incubate ° C. 洗浄 3 回 7 分の 1.5 mL の 0.1 M 酢酸緩衝液と</li>。
	</ol></li> <li>エポキシを埋め込む <ol><li>シングル 1.5 mL 各 7 分、50%、70%、90% のエタノールの洗浄とニューロンの文化を脱水し、3 は発煙のフード 7 分 1.5 mL 100% エタノールの洗浄です</li>。
		<li>ミックス 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) エポキシ樹脂、160 mL/L ドデセニル無水コハク酸 (性)、340 mL/L メチル-5-ノルボルネン-2, 3-ジカルボン酸 (NMA) と 15 mL/L 2,4,6-トリス (dimethylaminomethyl) フェノール (DMP 30) エポキシを作成するには樹脂です。ミックスが徹底的に、空気の泡を削除する真空下で格納します 。
		注: それは特にそれらが肉眼に目に見えるよりも小さい樹脂に空気の泡を削除する重要なので断面中に樹脂のキャビティを引き起こす可能性が</li>。
		<li>50% エポキシとエタノールを置き換えることによってサンプル樹脂、シェーカーで室温で 30 分間エタノールを 70% エタノール シェーカーで室温で 30 分間のエポキシ樹脂そして潜入</li>。
		<li>スイッチ エポキシ 100% エポキシ樹脂でソリューションを樹脂し、50 ° C 追加新鮮な 100% エポキシで 1 時間孵化と新鮮な 100% エポキシ樹脂の 50 ° C の実行の 2 つの取引所で 10 分間インキュベート樹脂し、50 ° c 夜間、60 ・ #17 でのセキュリティを強化することができます。6;36 h 以上を強化するための C.</li>
	</ol></li> <li>ムーティ ウェル プレートから宝石商の各サンプルを削除 &#39; s ハンドソー。密な濃度は、倒立顕微鏡を使用し、ミクロトームによる区分のための 70 に 80 nm ブロックのセルの関心の領域を選択します。ミクロトーム チャック内カットの領域をマウントし、ミクロトームをロードします。ミクロトームでチャックを置き、エッジ ブロックの表面に平行にダイヤモンド ナイフをマウントします。個々 のグリッドに直接 70 に 80 nm 厚のセクションを収集します</li>。
	<li>は、重量、1% 溶液を水に酢酸ウランを溶解し、個別に重量によって 3% の解決のため水にクエン酸鉛を溶解します。15 分間の 1% 水溶液 005. とし、試料のコントラストを改善するために 5 分間 3% 水溶液鉛クエン酸によるセクションを counterstain</li>。
	<li>EM イメージング <ol><li>電子顕微鏡セクションと 10,000-20, 000 × 3 の主な倍率で CCD のデジタル カメラ画像を記録確認します</li>。
	</ol></li> <li>統計 <ol><li>t を実行-制御と実験サンプル平均と標準誤差測定 (s.e.m.) を比較することによって大きな違いを識別するためにテストします</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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ここでは、シナプス小胞エンドサイトーシスを監視するための 2 つの方法を示します。最初のメソッドでは、pHluorin transfected ニューロンのシナプス小胞タンパク質と融合し、その後電気刺激を監視しました。第二に、kcl と HRP 取り込みの EM イメージングを使用しました。2 つの理由のためにさまざまな刺激を使いました。まず、高カリウム施肥は文化のすべてのニューロンの脱分極を誘導します。これは EM 検討を促進する私たち EM 法非刺激と刺激ニューロン間区別することがないことを考える。第二に、超構造の形態学的変化より確実にみ高カリウム刺激などの強烈な刺激の後の活動電位または単一のアクションも簡単な鉄道後 pHluorin 蛍光の変化を観察できるに対し可能性があります。
PHluorin を用いたイメージング光学顕微鏡は、生きている細胞のシナプス小胞タンパク質融合と高時間分解能の吸収を示しています。エンドサイトーシスの経過とシナプス小胞のプールのサイズを調節する機構を研究対象に使用できます。pHluorin イメージングのみ使用されていないシナプス蛋白質のエンドサイ...

神経伝達物質は、シナプス小胞に格納され、エキソサイトーシスによってリリースされました。シナプス小胞膜および蛋白質は、エンドサイトーシス、によって、開口放出の次のラウンドで再利用します。シナプス小胞エンドサイトーシスは、細胞膜から突き出た小胞を削除しますシナプス小胞のプールを維持するため重要です。酸性情況で急冷、中性 pH で蛍光 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 pHluorin は、エンドサイトーシス時間コース ライブ セル1,2,3を測定する使用されています。PHluorin 蛋白質は通常シナプトフィジンや VAMP2/シナプトブレビンなどのシナプス小胞タンパク質の内腔側に接続されています。でも、pHluorin はシナプス小胞の 5.5 の pH ルーメンで急冷され。細胞膜に小胞の融合を公開、pH が 7.3 〜 細胞外の溶液に小胞の内腔 pHluorin 蛍光性の増加の結果します。エキソサイトーシス後、シナプス小胞蛋白質それら回復小胞内小胞再酸性化に続いてのエンドサイトーシスによる増加の蛍光が崩壊します。崩壊は、エンドサイトーシスと小胞の再酸性化を反映しているが、再酸性化がほとんど条件1,4エンドサイトーシスよりも速いのでそれ主のエンドサイトーシスを反映します。再酸性の時定数は 3-4 秒または 10 よりも一般に高速は5,6に少ない s 以上の小胞エンドサイトーシス4,5に必要な。シナプス小胞タンパク質を取得するかどうかを決定する 5.5 の pH の 4 Morpholineethanesulfonic 酸 (MES) 溶液 (25 mM) を用いた酸焼入れ実験を使用ことができます実験が再酸性からエンドサイトーシスを区別するために必要な場合エンドサイトーシス1,3,4を介して原形質膜。したがって、pHluorin 蛍光強度増加エキソおよびエンドサイトーシス、残高反映して反映されます神経刺激後減少特にエンドサイトーシス。
確率誘発リリースと自発的な解放9および pHluorin イメージングがエンドサイトーシスの時間のコースもシナプス小胞プール7、8サイズを測定するだけではなく使えます。多くの要因とエンドサイトーシスなどカルシウム、水溶性 NSF 添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 蛋白質、脳由来神経栄養 factor(BDNF)、カルシニューリンの調節に関与するタンパク質は、pHluorin イメージング1を使用して識別されています。,2,10,11,12,13,14,15,16. 唯一の第一次ニューロンではなく観察17神経芽細胞腫、さらに、神経伝達物質の放出が検出できます。最近では、pHluorin 亜種、下流、mOrange、pHTomato は、単一シナプス18,19で複数の要因を同時記録を監視するため開発されました。たとえば、pHTomato シナプトフィジンと融合され遺伝的コード化カルシウム インジケーター (GCaMP5K) とシナプス小胞の融合およびシナプス コンパートメント20の Ca2 +流入監視に使用します。そのため、シナプス蛋白質に接続されている pHluorin は、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの関係を分析する有用な方法を提供します。
EM は一般的エンドサイトーシス中の微細構造の変化を示す高空間分解能のためのエンドサイトーシスを研究するために使用する別の方法です。2 つの一般的な領域は、神経細胞21内の病理学的変化を視覚化し、小胞蛋白質22を追跡する機能です。特に、シナプス小胞の取り込み、膜の曲率の観察 periactive ゾーンにクラスリン被覆し、エンドソーム構造が EM3,23,24,25 で可能 ,26,,2728。EM で定着剤による奇形などの潜在的なアーティファクトは、エンドサイトーシス、影響を与える可能性があります、データ分析は労働集約型、解像度は細胞構造を視覚化するための魅力的な機会を提供します。潜在的な定着性の問題と EM の時間分解能の限界は、凍結、エンドサイトーシス27の間に現在の繊細な構造の安定化の高速で非化学メソッドを提供する高圧で克服できます。

<table><tbody><tr><td>リポフェクタミンLTX with Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>シナプトフィジンまたはVAMP2-pHluorin神経基礎培地を含むプラスミドDNAのトランスフェクション</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>ニューロン用増殖培地、37°Cまで温めます。C 使用前のC</td></tr><tr><td>B27</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504-044</td><td>ニューロン分化のための勾配</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050-061</td><td>ニューロン培養のための勾配</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジンコーティングされたカバースリップ</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td> 神経<td>細胞の成長とウシ膵臓からのpHluorin</td></tr><tr><td>トリプシンXI</td>のイメージングのための基質 シ<td>グマ</td><td>T1005</td>ニューロン<td>培養消化海馬組織</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼI</td><td>シグマ</td><td>D5025</td><td>ニューロン培養阻害粘性細胞懸濁液</td></tr><tr><td>パルス刺激装置</td><td>A-Mシステム</td><td>モデル 2100</td><td>電気刺激を適用する</td></tr><tr><td>フィールド刺激付きスロットバス</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-21BRFS</td><td>電気刺激</td></tr><tr><td>刺激アイソレーションユニット</td><td>を適用するワーナーインスツルメンツ</td><td>SIU102</td>電気<td>刺激</td></tr><tr><td>潤滑剤</td>ダ<td>ウコーニング</td><td>111</td><td>pHluorinイメージングシールカバースリップとイメージングチャンバー付きシールを適用し、チャンバーAP5</td></tr><tr><td></td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>生理食塩水、選択的NMDA受容体拮抗薬の勾配は、再発活動の可能性があるシナプス後活動を阻害します</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>生理食塩水、競合AMPA/カイニン酸受容体拮抗薬のグラジエントは、再発活動の可能性があるシナプス後活動を阻害します</td></tr><tr><td>イルミネーター</td><td>ニコン</td><td>C-HGFI</td><td>pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td>用メタルハライド光源 <td>Andor</td><td>iXon3</td><td>pHluorin イメージング、pHluorin 蛍光強度の検出</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>シナプトフィジンまたはVAMP2 pHluorinトランスフェクト細胞のイメージング</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>ニコン</td><td>NIS-Elements イメージング</td><td>取得および解析用アドバンスドリサーチソフトウェア</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>イメージング解析およびデータ表示用ソフトウェア</td></tr><tr>イメージング<td>チャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC21B</td><td>pHluorinイメージング、生細胞</td></tr><tr><td>にフィールド刺激を適用するpoly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>電子顕微鏡、ニューロン成長のための基質、室温で 1 時間マルチウェルプレートに適用し、滅菌水で 3 回洗</td></tr>ってください <tr><td>西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P6782</td><td>電子顕微鏡、過酸化水素の存在下で DAB を触媒することにより、エンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、最終濃度は生理食塩水で 5 mg/mL です。使用前に</td></tr><tr><td>新鮮な Na カコジル酸</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12300</td><td>電子顕微鏡、固定剤および洗浄のための緩衝液、最終濃度は0.1 N</td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジアミノベンジジン(DAB)</td><td>シグマ</td><td>D8001</td><td>電子顕微鏡、エンドサイトーシスシナプス小胞の標識、HRPの基質、最終濃度は重水素減少水で0.5 mg / mLであり、ろ過され、使用前に新鮮にしてください</td></tr>過<tr><td>酸化水素溶液</td><td>シグマ</td><td>H1009</td><td>電子顕微鏡法、HRP-DAB反応を誘導することによりエンドサイトーシスされたシナプス小胞の標識、最終濃度は重水素減少水で0.3%、使用前に新鮮に作る</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16365</td><td>電子顕微鏡法、固定剤、最終濃度はNa-カコジル酸緩衝液で4%、使用前に新鮮に作り、</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>を使用する前によく振とう電子顕微鏡、エンドサイトーシス小胞のイメージング、超微細構造変化</td></tr><tr><td>CCDデジタルカメラ</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>電子顕微鏡、画像キャプチャ</td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>16707235</td><td>電子顕微鏡、グリッド染色</td></tr></tbody></table>

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

エンドサイトーシス、時にシナプス小胞の融合は小胞リサイクルそしてこうして神経反復焼成時におけるシナプス伝達の維持を可能にする神経終末で取得されます。病理学の条件に障害エンドサイトーシスは、シナプスの強さと脳の機能の低下につながります。ここでは、我々 は哺乳類神経培養海馬シナプスにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスを測定するために使用方法を説明します。我々 は pHluorin、増加 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質を小胞の内腔側でシナプトフィジンと VAMP2/シナプトブレビンを含むシナプス小胞膜タンパク質を融合することでシナプス小胞タンパク質エンドサイトーシスを監視、pH として蛍光強度が増加します。エキソサイトーシス、時小胞内腔 pH が増加し、pH は酸性再エンドサイトーシス小胞内腔中。したがって、pHluorin の蛍光強度の増加は減少を示す標識のシナプス小胞タンパク質のエンドサイトーシスに対し融合を示します。PHluorin イメージング法を使用して、エンドサイトーシスを記録するに加え、膜小胞エンドサイトーシスの監視西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 摂取量の電子顕微鏡検査 (EM) 測定による小胞によって。最後に、我々 は神経末端の穴を形成する高カリウム誘起脱分極後様々 な時を監視しました。HRP 吸収と膜ピット形成の時間的経過は、エンドサイトーシスの時間コースを示します。

脂質キャリア メソッドを使用して、SpH に表現された海馬ニューロン ボタン (図 1 a) の同定を可能にします。電気刺激誘発細胞エキソサイトーシスと蛍光強度の増加に対応。蛍光 (ΔF) の増加は、刺激 (図 1 b) を終了することによって停止されました。増加の蛍光は、エンドサイトーシスにより、低速の減少が続いた。VAMP2-pHluorin の場合 VAMP2 を刺激4後、ブートンから軸索に沿って拡散します。Raw データは、任意の単位を使用し、崩壊と τ (図 2 a-c) のレートを取得するベースラインに正規化されました。測定値は、正規化されたトレースから作られた、ので減衰率はピーク ΔF (ΔF/秒) の割合で蛍光の初期崩壊を反映しています。私達の実験条件でエンドサイト...

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169 と吸収小胞の電子顕微鏡によるシナプス小胞エンドサイトーシスが検出されました。

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

この標識法の全般的な目的は、シナプス小胞のエンドサイトーシスを測定することです。この手法は、形成されたエンドサイトーシス小胞の分散など、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、イメージング時の解像度が高く、細胞の完全な構造を調べることで変化を可視化できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、エポキシ樹脂の調製時に微小な気泡を除去できなかったり、エタノール洗浄中にサンプルを乾燥させてしまったりすることで、困難に直面することがあります。本手順を開始するために、まずポリ-D-リシンコート済みの6ウェルプレートを準備します。各ウェルに0.01%の滅菌ろ過済みポリ-D-リシン溶液を1.5 milliliters加え、室温で1時間静置した後、滅菌水で3回洗浄してください。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼを含む高カリウム刺激溶液を調製し、5 molarの水酸化ナトリウムを用いて溶液のpHを7.4に調整します。その後、室温で各ウェルに1.5 millilitersの高カリウム刺激溶液を加え、90秒間海馬ニューロン培養を刺激します。このステップでは、pH 7.4の0.1 molar sodium cacodylate bufferを調製してください。0.1 molar sodium cacodylate bufferに含まれる4%glutaraldehydeを用いて、室温で1時間以上細胞を固定し、その後、0.1 molar sodium cacodylate bufferで1回につき7分間、計3回細胞を洗浄します。その後、DAB溶液を調製し、0.22 µmフィルターでろ過します。次に、1.5 mLのDAB溶液を細胞に添加し、37 °Cで30分間反応させた後、0.1 M sodium cacodylate緩衝液で、1回につき7分間、計3回細胞を洗浄します。後固定として、0.1 M sodium cacodylate緩衝液で調製した1%四酸化オスミウム1.5 mLを用いて、ニューロンを4 °Cで1時間インキュベートします。その後、0.1 M ソジウムカコジル酸緩衝液 1.5 mL を用いて、ニューロンを7分間ずつ3回洗浄します。続いて、酢酸ナトリウムと氷酢酸を用いて 0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液を調製します。0.1 M 酢酸緩衝液 1.5 mL を用いて、細胞を7分間ずつ3回洗浄します。その後、細胞を0.1 M酢酸緩衝液で調製した1%酢酸ウラニル溶液1.5 mLと共に、4°Cで1時間インキュベートし、次いで0.1 M酢酸緩衝液1.5 mLで3回（各7分間）洗浄します。ドラフトチャンバー内で、50%、70%、90%のエタノールをそれぞれ1.5 mL用いて各7分間ずつ1回的に洗浄し、神経細胞培養物を脱水します。続いて、100%エタノール1.5 mLで3回（各7分間）洗浄します。次に、エポキシ樹脂を作成して十分に混合し、気泡を除去するために真空状態で保存します。シェーカーを用い、室温でエタノールを50%エポキシ樹脂エタノール溶液に置換してサンプルを浸透させ、30分間置きます。続いて、シェーカーを用い室温で70%エポキシ樹脂エタノール溶液に置換し、30分間置きます。エポキシ樹脂溶液を100%エポキシ樹脂に交換し、50°Cで10分間インキュベートします。新鮮な100%エポキシ樹脂で2回置換を行い、各置換につき50°Cで1時間インキュベートします。次に、新鮮な100%エポキシ樹脂を加え、50 °Cで一晩、その後60 °Cで36時間以上硬化させます。その後、ドリラーの手鋸を用いて、マルチウェルプレートから各サンプルを取り出します。倒立光顕微鏡を使用して、細胞が密集している関心領域を選択し、切片作成用に4×5×8 mm立方体のブロックに切り出します。その後、サンプルのコントラストを向上させるため、切片を1%酢酸ウラニル水溶液に15分間、次いで3%クエン酸鉛水溶液に5分間浸漬して対比染色を行います。本研究では、培養ニューロンを用いて電子顕微鏡観察を行い、刺激なしで5 mg/mLのHRPを90秒間インキュベートした対照サンプルと比較して、クラスリン被覆小胞を検討しました。刺激がない状態では、ブトンあたり0.05の確率でクラスリン被覆ピットが観察されました。これらの画像では、高カリウム刺激によって誘導されたバルクエンドソームおよびシナプス小胞の取り込みが、HRP標識によって同定されました。シナプス小胞は直径50 nanometers未満の小胞と定義し、バルクエンドソームは直径80 nanometers超、または直径80 nanometersの小胞よりも断面積が大きいものと定義しました。誘導されたバルクエンドソームの取り込みは、生理食塩水による回復によって減少しました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、8.5時間で完了し、さらにエポキシ樹脂を硬化させるために3日間の時間を要します。本手順に続き、刺激からの回復過程における標的タンパク質の分布など、追加の疑問を解消するために、免疫ゴールドラベル法などの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、電子顕微鏡によるイメージングに向けたサンプルの固定および染色の方法について、十分に理解できるはずです。

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM...

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

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シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。...

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リサイクルシナプス小胞の光学解析のための培養ニューロンの準備

出典:Villarreal, S., et.al.、培養海馬ニューロンにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスの測定。J. Vis. Exp.

マウス海馬ニューロンにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスの透過型電子顕微鏡イメージング

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。...

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

学ぶ 培養海馬神経細胞におけるシナプス小胞エンドサイトーシスの測定法。高解像度の光顕微鏡と電子顕微鏡を用いて、小胞動態と神経伝達の機構を詳細に可視化する手法を解説します。

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

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