哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

この手順の目標は、2種類のCRIPSR/Cas9を介したゲノム編集によって生成されたクローン性ノックアウト細胞株を単離し、同定することです。一方の方法は、非相同末端結合によって引き起こされるタンパク質ノックアウトを検出し、もう一方は相同性指向修復によって生成されるゲノム摂動を検出します。この方法は、遺伝的摂動を伴う細胞株の生成が遺伝子機能を解剖する重要なツールである分子生物学の分野で特に有用です。

この手法の主な利点は、基本的な分子生物学的手法を使用して簡単に実行できる、迅速で比較的ハイスループットな方法であることです。非相同末端結合は、小さな欠失または挿入を導入し、ドットイムノブロットによって評価されますが、相同性特異的修復は、より大きく、より正確な摂動を可能にし、コロニーPCRによって評価されます。この実験では、DMEM培地で培養したT-REx-293細胞に、摂氏37度で10%のFBSと5%の二酸化炭素を添加して使用します。

トランスベクションの前に、細胞を6つのウェルプレートにプレートし、トランスベクションされていないコントロール用のウェルを含めます。細胞を約70%のコンフルエント度まで増殖させます。市販のトランスベクションプロトコルを用いて、2.5 μgの全プラスミドで細胞をトランスベクターします。

選択せずに細胞をトランスベクションするには、2.5μgのCas9-sgRNAプラスミドを使用してください。選択細胞のトランスベクションには、0.75マイクログラムのCas9-sgRNA1、0.75マイクログラムのCas9-sgRNA2、および1マイクログラムの相同組換えテンプレートを使用してください。トランスベクトした細胞とトランスベクションされていないコントロールを摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートします。

選択でトランスベクターされた細胞の場合、適切な薬物(この場合はネオマイシン)で細胞を処理することにより、薬物選択を開始します。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。処理した細胞を1日1回観察して、トランスベクションされていないコントロールのすべての細胞が死ぬまで、細胞死の速度を確認します。

クローン集団を単離するには、まず、選択後に元のウェルで細胞を100%のコンフルエント度まで増殖させます。次に、細胞の段階希釈を行い、細胞をカウントします。モノクローナルコロニーの適切な生成がフルノックアウトを得るための鍵となるため、所望の密度で細胞を座らせるための正しい希釈を決定するように注意する必要があります。

正しい希釈が決定されたら、細胞をウェルあたり0.33細胞の密度で96ウェルプレートに着座させます。3つの96=wellプレートを装着することは、複数の正しいクローンを確実に単離するための良い出発点です。2〜4週間かけて、コロニーが目に見えるようになるまでコロニーを観察します。

これらの代表的な画像は、成長のさまざまな段階にあるコロニーを示しています。着席時の単一細胞、5日目の細胞、10日目の確立されたコロニー。滅菌ピペットチップを使用して、目に見えるコロニーを慎重かつ正確に選択し、新しいウェルに再度装着して単層の成長を促進します。

摂氏37度と5%の二酸化炭素で細胞を成長させ続けます。選択されていないノックアウト候補は、ドットイムノブロットでスクリーニングされ、タンパク質製品をハイスループットで評価します。個々のクローンを50〜100%のコンフルエント度に成長させた後、ウェル内でピペッティングして細胞の単層を取り除きます。

各ウェルから100マイクロリットルの総容量のうち90マイクロリットルをきれいな微量遠心チューブに分注します。このビデオでは、2つのサンプルのみが処理されます。6, 000 RPMで5分間スピンダウンし、メディアを取り出し、10マイクロリットルの1X SDSローディングバッファーでセルパレットを溶解します。

ウェル内の残りの細胞に90マイクロリットルの新しい培地を加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞の増殖を続けます。1マイクロリットルの細胞溶解物を乾燥したニトロセルロースメンブレンにピペットで移し、ドットを形成します。各サンプルを2つの別々のメンブレンで2回ブロットし、2つの同一のサンプルパターンを作成します。

TBST中の5%ミルクのメンブレンを室温で、揺さぶりながら1時間ブロックします。1時間後、推奨される一次抗体希釈で一次抗体でメンブレンをブロットし、TBSTと5%ミルクを添加します。この実験では、標的タンパク質であるELAVL1に対する一次抗体を片方の膜に使用します。

もう一方のメンブレンでは、変化が予想されないコントロールタンパク質の一次抗体を使用し、ここではPUM2を使用します。室温で1時間インキュベートします。各ブロットから一次抗体溶液を取り出し、TBSTを添加して5分間インキュベートします。

このようにして、TBSTでブロットを3回洗浄します。次に、各メンブレンに適切なHRP標識二次抗体を添加し、室温で1時間ブロットします。1時間後、メンブレンをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。

メーカーの指示に従って、化学発光基質溶液をブロットに適用し、デジタル化学発光イメージャーでブロットしたメンブレンをイメージングします。最後に、適切なソフトウェアを使用してターゲットタンパク質とコントロールタンパク質のドット強度を定量し、テキストプロトコルに記載されているように結果を解析します。選択可能な耐性マーカーを持つ候補は、コロニーPCRによってスクリーニングされます。

この手順は、新しい96ウェルプレートで個々のコロニーを複製し、細胞溶解物の調製のためにそれらを100%コンフルエントに成長させることから始めます。クローンの1セットから培地を取り出し、市販のDNA調製キットからの抽出バッファー30μリットルに各ウェルの細胞を再懸濁し、清潔な1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。溶液を摂氏96度に15分間加熱し、次に室温まで冷まします。

各微量遠心チューブに30マイクロリットルの安定化バッファーを加え、よく混合します。コロニーPCRにより野生型およびモノアレル性または両アレル性変異株を同定するには、耐性カセットの統合の成功または失敗に基づいて、相同性アームの周囲の領域を増幅するためのPCRプライマーの2つの別々のセットを設計します。両側に、相同性アームの外側でアニールする共通のプライマーを使用します。

野生型対立遺伝子を試験するには、相同性領域にまたがる内在性配列に相補的な対応する対となるプライマーと共通のプライマーを使用します。目的の変異をテストするには、挿入された耐性カセットに相補的な別のペアのプライマーと共通のプライマーを使用します。試験する各サンプルについて、0.5マイクロリットルの細胞溶解物、1.25マイクロリットルの10X KOD緩衝液、0.75マイクロリットルの25ミリモル硫酸マグネシウム、1.25マイクロリットルの2ミリモルdNTP、0.375マイクロリットルのフォワードプライマー、0.375マイクロリットルのリバースプライマー、0.25マイクロリットルのKODポリメラーゼ、および7.75マイクロリットルの水を含む反応混合物を調製します。

95°Cで2分間、続いて95°Cで20秒間、プライマー融解温度で10秒間、70°Cで20秒間/KBの条件でPCRを行います。続いて、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を可視化します。非相同末端結合を用いたゲノム編集を行い、ELAVL1ノックアウトラインを作製し、続いてドットイムノブロットを作製し、ELAVL1およびPUM2をプローブしました。制御シグナルがほとんど示されなかったクローンにはX印が付けられ、その後の解析から除外されました。

ELAVL1シグナルが低いクローンをウェスタンブロットでさらに試験しました。確認された候補は緑色で表示され、無効になった候補は灰色で示されます。このグラフは、ELAVL1とタンパク質シグナルの制御比率を昇順で示しています。

ほとんどの場合、相対ELAVL1シグナルが最も低いクローン集団は、ノックアウトとして正しく同定されました。相同性特異的修復法によって作製された候補をコロニーPCRでスクリーニングし、PCR産物をアガロースゲル電気泳動で可視化した。内因性インサイドプライマーとノックアウトインサイドプライマーを使用した上流積分接合部にまたがるプライマーを使用した結果の例を示しています。

プライマーは、最初に親細胞とバルク選択細胞の両方で検証されました。24の個々の候補クローンの結果は、野生型、ノックアウト、およびモノアレル欠失クローンの予想されるバンドパターンとともに示されています。黒い矢印は正しい増幅産物を示し、星はバイアレルノックアウトクローンを示します。

両対立遺伝子変異株は、ウェスタンブロットによってさらに検証されました。非相同末端接合では、単一のCas9カットと選択に依存しないスクリーニングを使用するため、事前の準備はほとんど必要なく、ドットブロットによるノックアウトクローンのスクリーニングにより、ノックアウト生成が成功したかどうかを迅速に判断できます。PCRベースのスクリーニングは、相同性発現修復によって生じる大きなゲノム摂動を持つ正しい候補を正確に検出します。

これらの技術により、分子生物学の研究者はノックアウトを簡単かつ効率的に同定し、細胞株を使用して正常または機能不全の細胞プロセスを探索できます。このビデオを見れば、CRISPR/Cas9を介したゲノム編集によって生成されたクローンノックアウト細胞株を単離し、同定する方法を十分に理解できるはずです。