Name: 調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶVWF-血小板文字列形成の定量解析法。炎症刺激下でのvon Willebrand因子放出と血小板捕捉をフローチャンバーで可視化し、止血機構の病態理解に役立つin vitroモデルを解説します。

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アリソン ・ ミッシェルは、フレデリック ・ バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金から、カナダ研究所の健康研究 (機構) の受信者です。ローラ ・ l ・ Swystun は、機構の交わりの受信者です。デビッド Lillicrap は、分子止血のカナダの研究の椅子の受信者です。本研究は、営業許可 (モップ 97849) 機構によって一部で賄われていた。

これらの研究は、研究倫理委員会の女王の大学、カナダによって承認されました。
1. 血管内皮細胞刺激
<ol><li>
コラーゲン コート 6 ウェル培養プレート。
	<ol>
<li>事前に、コート 1 ml コラーゲンの 37 ° C で 6 も組織培養プレート h 24 バッファー (50 μ G/ml ラット尾コラーゲン タイプ 1 0.02 M 氷酢酸と)。</li>
		<li>2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) で 2 回洗浄します。 注: プレート錫箔に包まれてでき 4 ° C で気密のポリ袋で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>内皮細胞成長培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL でよくあたり 1 x 10 の6セルの密度での種子。37 ° C (5% CO2) で 24 時間のセルを孵化させなさい。 注: ここでは、血液由来内皮細胞 (BOECs) 通路 5 と 15 の間使用されました。BOECs はスタークらに参照されるメソッドを使用して野生型 VWF シーケンスを持つ健康なボランティアから分離しました。22ゼウス23によって前述 1 と同様の方法で。</li>
	<li>24 h 後、培地を取り除き、HBSS でセルを洗浄します。</li>
	<li>無血清培地 (FBS せず最小限不可欠な成長媒体) 含むホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートの 1 mL を追加 (PMA; 100 nM)、37 ° c (5% CO2) 2 h のセルに HR (25 μ G/ml ですべて) や HK 未分画ヒストン (UH)。 ヒストンのこの集中は、徐らによる以前の in vitro毒性レポートに基づいていたメモ。24とエイブラムスら。25 50 μ g/mL を使用。</li>
	<li>2 時間後メディアを収集して分析まで-20 ° C で保存します。</li>
</ol>2 酵素結合抗体法 (ELISA) による VWF の定量化
<ol><li>バッファー (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩と 145 mM 塩化ナトリウム, pH 7.2) 含む 10 μ G/ml ポリクローナル抗 VWF 抗体 4 ° C で一晩をコーティングの 100 μ L でマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回、洗浄 (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩、塩化ナトリウム 500 mM、0.1% Tween 20、pH 7.2)。</li>
	<li>1:2 と 1:4 洗浄バッファー中のサンプルを希釈し、1:10 から始まる標準的なカーブの通常の参照のプラズマを使用して希釈。</li>
	<li>希釈試料 100 μ L をプレートし、基準が 4 ° C で一晩</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回洗浄します。</li>
	<li>希釈抗 VWF、プレートに HRP 標識の検出の抗体 (1.1 μ g/μ L で洗浄バッファー) の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートを洗浄し、製造元の指示に従って、o-フェニレンジアミン二塩酸塩 (OPD) 試薬で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>だから 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4読み取り 492 でプレート nm。</li>
</ol>3. 固相ヒストン VWF の結合の試金
<ol><li>0.5% ナトリウム デオキシ コール酸 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) 一晩 4 ° C で 10 μ g/ml で希釈したヒストンをマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>3 回を 250 μ L の PBS を 0.1% 添加した洗浄するトゥイーン 20、洗浄の間 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ L の PBS 0.1% Tween 20 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間で補完とプレートをブロックします。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>連続希釈血漿由来 VWF/ヒューマンファクター 25 mU/mL の生理食塩水のバッファー内に 200 mU/mL から複雑な VIII (塩化ナトリウム 10 mM 塩基リン酸ナトリウム,での 500 mM と 0.1% Tween 20、pH 7.2)。室温で 2 h のプレートに 100 μ L を追加します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>VWF PBS-0.1% Tween 20 と縮尺ウサギ ポリクローナル抗 VWF 抗体室温で 1 時間 HRP 標識を含む溶液 100 μ L を使用して固定化ヒストンの結合を検出します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>OPD 試薬の 100 μ L で 30 分のプレートを孵化させなさい、従って 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4。492 の光学濃度を測定 nm。</li>
</ol>4. フロー チャンバーに内皮細胞の播種
<ol><li>ルアーロック 1 mL シリンジに 0.5 mL のコラーゲン ・ コーティング バッファー (ステップ 2.1 で説明) をロードします。</li>
	<li>流れチェンバー スライドの貯水池にルアーロック注射器末をねじる。</li>
	<li>全体のレーンをコーティングし、各タンクは満杯までプランジャーをゆっくりと押します。各レーンの繰り返し、インキュベート室 24 h の 37 ° C にします。</li>
	<li>200 μ L ピペットとコラーゲン ・ コーティング バッファーを吸い出しなさい。注射器 1 mL HBSS、別の読み込みし、ゆっくりと流れ区域の各レーンを洗浄するプランジャーを押します。流れ区域の反対の端に 200 μ L ピペットの洗浄を吸い出しなさい。2 回繰り返します。</li>
	<li>10% の培地に 3 x 10 6/mL の細胞内皮細胞 (BOEC) ソリューションの約 100 μ L をピペット流れ区域の車線に FBS。 注: 内皮細胞の播種密度はチャンバーの容量を超えています。これは、最大チャンネル報道;非付着性のセルは、その後洗浄ステップで削除されます。</li>
	<li>インキュベート室 24 時間変更の 37 ° C に媒体 (ステップ 4.4) のようにルアーロック注射器を使用してすべての 8-12 h。車線で目に見える気泡がないことを確認します。</li>
</ol>5. ひと全血から血小板を分離します。
<ol><li>生物学的安全キャビネット 30 G 針付け無添加 3 mL 血液コレクション バキュテナーにバッファー酸クエン酸塩デキスト ロース (クエン酸ナトリウム 85 ミリメートル、111 mM D-グルコースと 71 mM クエン酸、pH 4.5) の 300 μ L を追加します。</li>
	<li>次のベルナルドら26刊に類似したプロトコル (抗血小板作用と非ステロイド性抗炎症薬から 7 日間無料) 健常者から穿刺 (3 mL の 3 つの管) で全血を収集します。</li>
	<li>静脈穿刺に関連する初期組織の損傷は自発的な血小板の活性化を引き起こすことができます最初のチューブを破棄します。</li>
	<li>優しくする血液の抗凝固剤を混ぜて 3 回、vacutainers を反転します。</li>
	<li>遠心分離機の 24 ° C (常温) で 15 分の 150 x g で vacutainers。</li>
	<li>ゆっくりと生物学的安全キャビネットのピペット (清) 血小板豊富な血しょうを削除し、慎重に 15 mL の円錐管にそれを転送します。潜在的なクロス活性化を避けるために単一の円錐管に各バキュテナーの血小板豊富なボリュームを転送します。 注: 血小板分離は、生物学的安全性の細菌汚染と潜在的な人工血小板や血管内皮活性化を防ぐためにキャビネットで実行する必要があります。</li>
	<li>血小板をペレットに 24 ° C (常温) で 10 分の 900 x g で円錐管を遠心します。</li>
	<li>ピペットし、血小板貧しい上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 mL のクエン酸グルコース ナトリウム (CGS) バッファー (クエン酸ナトリウム 13 mM、30 mM D-グルコースおよび 120 mM 塩化ナトリウム、pH 7.0) で慎重にペレットを洗浄します。 注: CGS バッファーが追加され、ペレットは優しく再停止されると、血小板が wisp のようなフォーメーションで表示をされます。血小板の活性化によって汚染されたサンプルで血小板が簡単に再懸濁しますないと固まりが表示されます。</li>
	<li>完全に再停止一度遠心分離機の 24 の ° C (常温) で 10 分の 900 x g でサンプル。</li>
	<li>CGS 洗浄バッファーを削除し、タイロード バッファー (塩化ナトリウム 138 mM、5.5 mM 0.36 mM 塩基リン酸ナトリウム 2.9 mM の塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム 12 mM D-グルコース pH 7.4) の 3 mL にペレットを再懸濁します。血小板の完全な再懸濁を確保し、集計が観察される場合、サンプルは廃棄します。</li>
	<li>最終濃度 1 μ M の洗浄血小板の各 3 mL の円錐管に 20 mM DiOC6 原液 (57.25 mg 5 mL のメタノールに溶解) から 1.5 μ L を追加します。 注: DIOC6 は緑蛍光ミトコンドリア染料ラベル血小板この実験で使用されています。</li>
	<li>3 1.5 mL 遠心チューブに洗浄血小板溶液の分注 1 mL。 注: この実験に必要な血小板容積が流れ区域、目的のせん断応力と実験 (ステップ 6.5) の長さのサイズに基づいて計算されます。このプロトコルは、流体の流れの十分な量があることを確認に状況の変化に応じて調整できます。</li>
	<li>分離の 2 h 内洗浄血小板を使用します。</li>
</ol>6. 流動装置アセンブリ
<ol><li>一端おすエルボ ルアーロック コネクタと他の女性のルアーロック ロック アダプター (1.6 mm の内部の直径) をチューブ滅菌シリコーン 70 cm 部分を添付します。</li>
	<li>20 mL の注射器をチューブに接続されている女性のルアーロック ロック アダプターを接続します。</li>
	<li>6.1 と 6.2 二度 3 つの同一のシリンジ チューブ接続を生成する手順を繰り返します。</li>
	<li>
シリンジ ポンプを使用すると、流体の流れを生成できます。シリンジ ポンプに次の設定を入力: 注射器とフロー レートの内部の直径。 メモ: 20 mL シリンジ 19.55 の mm の内部の直径があります。流量は、所望せん断率/せん断応力とフロー チャンバーの寸法に基づいて計算されます。1 dyn/cm2 (で観測された低静脈傾斜) を達成するために現在の研究で使用されるフロー チャンバー 9.37 μ L/分の流量が必要です。静脈血栓症へのヒストンのリンクの証拠のため 4.45 dyn/cm2の適度な静脈のせん断強度が選択されます。これはまた水に同じような粘度をバッファーには仮定に基づいています。流量 41.7 μ L/分方程式様々 なフロー槽寸法の流量はで見つけることができますを計算するために使用と等しいです。<ol>
<li>シリンジ ポンプのボタン オプションを使用して流体を撤回するためにポンプを設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリンジ ポンプのチューブに接続されている 3 つの注射器を読み込み、シリンジとプランジャーの前後にかっこをしっかりと保護します。</li>
	<li>おすエルボ ルアーを滅菌シリコン チューブの 2 番目の 20 cm 部分の両端に接続します。</li>
	<li>1 つ肘ルアーを鈍化 18 ゲージ針に接続します。</li>
	<li>流れ区域の 3 つの車線のための 3 つの同じ摂取量システムの作成を 2 回、繰り返します。 注: シリコン チューブとルアーズ再利用前に蒸留水に続いて 10% 漂白剤で洗浄できます。フローの部屋を再利用することはお勧めしません。</li>
</ol>7. 顕微鏡設定
<ol><li>完全に自動化されたステージを搭載した回転ディスク顕微鏡を使用します。633 nm レーザー線、543, 491 458 405 レーザー発射と照明を実行します。20 × 対物ですべての画像をキャプチャします。解析ソフトウェア (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) のすべてのパラメーターを調整します。</li>
	<li>チャンネル設定を選択 (排出フィルター: 520/35)、491 で励起による獲得のための nm。完全に動的なデータ範囲を取得する 200 ms の露光時間で 150、電子乗算増加に電荷結合素子を掛けて電子を設定します。 注: 血小板が緑色蛍光色素、DiOC6、波長マキシマと付け (励起, 482 nm; 排出, 504 nm)。</li>
	<li>20 %491 nm レーザー パワーを調整します。</li>
	<li>すべての 3 つの車線の中心をマークし、z の範囲の 1 μ m、0.5 μ m 用ステップ サイズを選択します。選択時間ポイント (つまり時間) の数とイメージをキャプチャするイメージ (すなわち間隔) の間の時間ごとの 10 s。スライドあたり「60 時間ポイント」を選択します。3 つの車線からのイメージをキャプチャし、実験の指定フォルダーに保存する顕微鏡を設定します。 注: 流れ区域は 3 つの車線があるため顕微鏡必要があります、画像をキャプチャする 3 つの位置の間で切り替えます。</li>
</ol>8. VWF 血小板文字列生成
<ol><li>(手順 4) からの流れ区域から培養液を削除手順 4.4 のように同じ技術を使用して。</li>
	<li>いずれかのヒスタミン (25 μ M)、PMA の 100 μ L を追加 (100 nM)、UH、香港、または HR (25 μ G/ml ですべて) 室温と周囲 O2/CO2で 15 分の BOEC 膜を刺激するために (手順 1.4) のように無血清培地で希釈しました。 メモ: VWF リリースには必要ないは、VWF エキソサイトーシス27を高めることが 37 ° C でこの刺激を実行します。</li>
	<li>確実につ 3 つの流れ区域の別のレーンに残る実験コントロールとして未処理。</li>
	<li>1 mL の注射器を使用してメディアを削除し、内皮膜から分泌促進物質を洗浄する PBS の 100-200 μ L で置き換えます。</li>
	<li>血管クリップを使用して場所に商工会議所を保護するスライド スタンドに流れ区域をマウントします。</li>
	<li>流れ区域の貯水池へ (注射器に接続) 70 cm チューブの端に利用できる男性ルアーロック コネクタを取り付けます。2 その他流れ商工会議所レーンに繰り返します。</li>
	<li>PBS 洗浄を削除するシリンジ ポンプを起動します。反対の流れ商工会議所貯水池にピペット追加 PBS に車線がドライ実行しないように。</li>
	<li>すべての 3 つのレーンと等価フロー用フロー システムを観察し、シリンジ ポンプを一時停止します。</li>
	<li>実験の間ほぼ同じエリアで、各レーンの中頃で画像をキャプチャする領域を選択します。 注: 人の顕微鏡で動作は実験条件に盲目にすることができます。この手順により、顕微鏡が血小板の流れの前に集中する (手順 7 を参照)。</li>
	<li>女性ルアー カプラーを添付<a></a>5 mL シリンジにし無料男性ルアーロック コネクタ (ステップ 6.8) 洗浄血小板溶液 (ステップ 5.13) 1.5 mL 遠心チューブに鈍い針を沈める。システム内で気泡がないようにチューブを介して血小板ソリューションをゆっくりと描画します。</li>
	<li>5 mL シリンジを取り外し、流れ区域のオープンの貯水池に男性のルアーを取り付けます。3 つの車線に繰り返します。</li>
	<li>・ シリンジ ポンプを再起動し、暗闇の中で 10 分間ステップ 7 から顕微鏡とプロトコルの設定を使用して血小板フロー中にイメージをキャプチャします。</li>
	<li>10 分後流チャンバー貯水池で吸気管から、ルアーを外し、リザーバーは内皮細胞の膜上の流れを維持するために PBS。</li>
</ol>(9) VWF 血小板文字列定量化
注: PBS の連続的な流れは、画像解析の VWF 血小板文字列伸長を維持するために必要です。フローの停止が球状になる VWF と VWF 血小板文字列定量化を損ないます。イメージ キャプチャの間に PBS で各貯水池を先頭に不可欠です。このステップの間に細胞の縮小や剥離が発生した場合、HBSS は PBS を置き換えることができます。
<ol><li>第 1 レーンに始まり、スライドの中央周辺の 20 X 対物レンズを使用して重複なし 10 枚のスライドをキャプチャします。各レーンのこの手順を繰り返します。 注: 乱流せん断応力による貯水池周辺は避けてください。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアを使用すると、「画像」、「調整、」と「明るさ/コントラストです」をクリックして明るさを調整します。定量化のために十分によく付着血小板を見なすことができるまで、スクロール バーをドラッグします。</li>
	<li>画像の 3 つ以上の一直線に並べられた血小板が観察されるときは、VWF 血小板文字列を記録します。イメージ内のすべての VWF 血小板文字列をカウントします。すべての 10 の画像の繰り返し、実験の平均します。 注: 定量化を行う人は実験条件に盲目にすることができます。これは、独立した研究8,28,29によって確認されて、VWF の共同染色する必要はありません。</li>
	<li>最低 3 回各分泌促進物質を評価する実験を繰り返します。</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

サイトに VWF によって血小板募集の定量化の in vitroモデルとして仕えるまま VWF 切断プロテアーゼ ADAMTS13 の存在下で急速な分解のために論争は、文字列 VWF 血小板の生理学的な関連性を中血栓の存在下で形作るかもしれないローカライズ ヒストン レベル5の増加です。また、血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) として - または炎症性微小 - ADAMTS13 活性などに欠けている病態で ADAMTS13 活性は阻害 VWF 血小板文字列32 体内を観察できるし、ことがあります血小板ミクロ凝集と白血球の漏出、VWF33の止血、炎症性の関数をリンクに貢献します。最後に、それは仮定されたがその文字列が VWF 血小板生成開始イベントかもしれない静脈や動脈の血栓症、病的血栓の構築を nidus を形成します。
WPB エキソサイトーシス、ADAMTS13 胸の谷間と VWF の血小板結合能を...

血栓症は、死亡率世界1の主要な原因で応答 todysregulated 血小板活性化とトロンビン生成両方 veinsand 動脈内で開発することができます。VWF の血漿中濃度は血液凝固の重要な調節因子、という低いレベル (< 50%) フォン Willebrand の病気 (VWD)2および高レベルとして知られている出血障害が発生 (> 150%) 静脈3のリスクの増加に関連付けられていると4動脈血栓症。
VWF はポリコームタンパク糖巨核球や血管内皮細胞により合成、血小板 α 顆粒と WPBs にそれぞれ格納されます。止血の挑戦時に VWF 活性化血管内皮細胞5または容器壁6露出したコラーゲンに血小板を循環をテザーに内皮細胞の WPBs から解放できます。内皮細胞と VWF のアンカーは、P-セレクチン ・ タンパク7とインテグリン αvβ38によって媒介される示されています。血小板 α 顆粒店の後続のリリースはさらに血小板血小板相互作用血小板栓形成、凝固カスケードとフィブリンの伝播に必要な足場を安定させるためにローカライズされた VWF 濃度を増やすことができます。蒸着。VWF の血小板結合活性より止血作用9,10を有する高分子量多量とポリコームタンパク体質によって調整されます。循環、VWF も血液凝固因子の第 VIII のためのキャリアとして機能します。
流体のせん断応力は、VWF の生理学の本質的なレギュレータです。剪断応力がない場合は、VWF は血小板糖蛋白 Ib 接着11の結合ドメインを隠して球状の形で存在します。せん断応力が存在する場合は、メタロプロテアーゼ、disintegrin、トロンボスポンジン モチーフ (ADAMTS13) メタロプロテアーゼの胸の谷間のサイトが公開されます。ADAMTS13 裂く裸と血小板装飾の VWF 文字列多量体のサイズを調節するその止血作用12を減らします。
VWF は急性期蛋白質、低酸素症13、感染症14、炎症性サイトカインなど、多数の刺激は、血管内皮細胞から VWF リリースを仲介する示されています。他に似たような炎症剤、細胞のヒストンも示されている全身 VWF リリース マウス15,16と血小板体外17,18,の活性化を誘導する19. このリジンの違いとして、ヒストンのサブタイプに依存することが示され、アルギニン含有量関数15に影響を与える可能性があります。流れ区域を確立する研究目標は、リジンが豊富な (HK) の影響を調査するモデルし、アルギニンが豊富な (HR) ヒストン サブタイプと内皮の VWF リリースとリアルタイムの血小板の分泌促進薬、潜在的な初期イベントでキャプチャ炎症による血栓症です。
この流れの商工会議所の方法論は、ビジュアルと、再現と定量化にある生体外でシステムで subendothelial コラーゲン、血管内皮細胞、VWF と血小板の生体内での相互作用を繰り返します。WPB 分泌、血小板の活性化と VWF 分解を含む VWF 血小板の相互作用を調節する経路のすべての側面のリアルタイム評価が可能です。VWF のせん断応力を制御条件の下での研究は、ADAMTS135VWF リリースと血小板結合関数20、WPB 生理21VWF 胸の谷間を損なう VWD の突然変異を評価に使用されています。この方法論を使用して、炎症性刺激の結果として VWF 血小板文字列形成の定量化: 細胞のヒストン。

<table><tbody><tr><td>子牛胸腺未分画ヒストン(UH)</td><td>ワージントン生化学</td><td>HLY</td>血清<td>還元培地(5 mg / mL)</td></tr>子<tr><td>牛胸腺リジンリッチヒストン(HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td>血清<td>還元培地(5 mg / mL)子</td></tr><tr><td>牛胸腺アルギニンリッチヒストン(HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td>血清<td>還元培地(5 mg / mL)</td></tr><tr><td>で再構成ホルボール 12-ミリスチン酸 13-酢酸 (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>DMSO (20 mM)</td></tr>で再構成ヒ<tr><td>スタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>水 (50 mg/mL) で再構成</td></tr><tr><td>3,3' ジヘキシロキサカルボシアニン ヨウ化物 (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>メタノール (20 mM) で再構成</td></tr>)<tr><td>ウサギ抗 VWF コーティング抗体</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>VWF ELISA 用</td></tr><tr><td>ウサギ抗VWF検出抗体、HRP標識DAKO</td><td></td><td>P0026</td><td>VWF ELISAおよびヒストン-VWF結合アッセイ用</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 平底96ウェルマイクロプレート</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>ヒストンVWF結合アッセイ</td></tr>用 <tr><td>Immulon 4 HBX 平底マイクロタイター 96ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>VWF用 ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>血漿由来のヒトフォンWillebrand因子/第VIII因子</td></tr><tr><td>ノーマルリファレンス プラズマ</td><td>精密 BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>VWF ELISA標準曲線用</td></tr><tr><td>O-フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD)試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>ThermoFisher Scientific(カタログ番号:34006)を通じて入手可能な同等の製品</td></tr> <tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>培養および初期用BOEC</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)</td>の播種<td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン 1型</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I 還元型血清培地</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>内皮細胞刺激用</td></tr><tr><td>METAMORPH 顕微鏡 自動化および画像解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td><td>同上</td><td></td><td>この製品は販売を終了しました。&micro;-Slide VI 0.1 (#80661) または 0.4 (# 80601) を使用して、4.45 dyn/cm2 のせん断応力を維持するために必要な流量と血小板量を再計算</td></tr>することをお勧めします <tr><td>シリコンチューブ 1.6 mm 内径: 5 m、滅菌済み</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックコネクタ メス: 天然ポリプロピレン、滅菌済み</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>エルボー ルアーコネクタ オス: 白色ポリプロピレン、滅菌済み</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>鈍い 18G ニードル</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ポンプ New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 スピニングディスク顕微鏡</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

調査フォン willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた willebrand 因子-血小板文字列生成

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF) はポリコームタンパク糖タンパク質の凝固因子血小板粘着および血管内皮細胞障害のサイトで集計を仲介し、循環の第 VIII 因子を運ぶ。VWF は、血管内皮細胞で合成しプラズマに恒常解放ですかまたは止血チャレンジへの応答でのオンデマンド リリース Weibel Palade 体 (WPBs) と呼ばれる特殊な細胞小器官で格納されます。凝血促進および炎症性刺激は、WPB エキソサイトーシスと VWF リリースを急速に引き起こすことができます。VWF は、血管内皮細胞によるリリースの大半が循環するプラズマ;ただし、VWF の割合は、血管内皮細胞表面に固定されています。生理学的なせん断の条件の下で内皮アンカー VWF は、血栓形成の nidus を表す VWF 血小板文字列を形成血小板にバインドできます。流れ溜まりは、内皮細胞から VWF のリリースと再現し VWF を介する血栓形成の病態に関連する方法でキャプチャ後の血小板を視覚的に観察する使用できます。この方法を使用すると、内皮細胞培養流れ区域で、WPB の開口放出を誘発する分泌促進物質でその後刺激です。洗浄血小板は、活性化された血管内皮細胞に灌流します。血小板が活性化し、その後の流体の流れ方向に細長い VWF 文字列にバインドします。凝血促進、炎症性刺激として細胞のヒストンを使用して、ヒストン治療血管内皮細胞, 血管内皮細胞と比較して増加した VWF 血小板文字列形成を観察した.このプロトコルでは、止血と血栓形成モデルの VWF 血小板相互作用の活性化の定量的・視覚・ リアルタイム評価について説明します。

VWF リリース血管内皮細胞からのヒストンの影響を直接評価、2 h の無血清培地含む PMA (肯定的な制御)、UH、HR、および香港に合流 BOECs を公開しました。我々 は、HK 誘発処理血管内皮細胞 (図 1) の中の VWF 蛋白質 (VWF:Ag) の 2 倍増加したことを示した。興味深いことに、BOECs に UH と HR 刺激されたときが VWF:Ag 以下が検出されました未処理状態により中。培養液中の VWF:Ag 検出の妨げがあります特異的ヒストンは、VWF30に直接バインドすることができます、ので、我々 の仮説。VWF にヒストン結合を評価するには、固相結合の試金を使用しました。我々 は、UH と HR HK (図 2) より VWF により強くバインド検出干渉をサポートは、図 1に示すことを示した。
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本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

本手順の全体的な目的は、セクレトゴグに反応して形成されるフォン・ヴィレブランド因子（VWF）またはVWF-血小板ストリングを観察し、定量化することです。この手法は、フォン・ヴィレブランド因子の生物学および血管壁の病態生理学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、フォン・ヴィレブランド因子の放出や血小板結合能を損なう変異に関する疑問の解明にも寄与します。この手法の最大の利点は、内皮下コラーゲン、内皮細胞、VWF、および血小板の間のin-vivoにおける相互作用を、視覚化および定量化が可能なin-vitroシステムで再現できることです。この手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要であると考えます。複数の条件下で同時に、VWF-血小板ストリングの形成をリアルタイムで捉えるために必要な顕微鏡操作の手順は、テキストのみで習得するのは困難な場合があります。まず、1 mLのルアーロックシリンジに0.5 mLのコラーゲンコーティングバッファーを充填します。シリンジの先端をフローチャンバースライドのリザーバーにねじ込み、レーン全体がコーティングされ、各リザーバーが満たされるまでプランジャーをゆっくりと押し下げます。各リザーバーが完全に満たされていることを確認し、不足分を補充してください。すべてのレーンの充填が完了したら、チャンバーを37°Cで24時間インキュベートします。翌日、200 µLピペットを用いてコラーゲンコーティング緩衝液を除去します。その後、各レーンをHBSSで洗浄し、200 µLピペットで生理食塩水を吸引します。3回目のHBSSを廃棄した後、10% FBSを添加した増殖培地100 µLに、1 mLあたり約3 × 10⁶個のBlood Outgrowth Endothelial Cellsを懸濁したものを、フローチャンバーの各レーンに加えます。その後、チャンバーを37 °Cのインキュベーターに戻して24時間培養し、8〜12時間ごとに培地を交換します。フロー装置を組み立てるには、まず3本の70 cmの滅菌シリコンチューブの各末端に、オスエルボールアーコネクタを1つずつ取り付けます。そして、各チューブのもう一方の端にメスルアーロックアダプターを1つずつ取り付けます。メスルアーロックアダプターを個別の20 milliliterシリンジに接続し、シリンジポンプをプログラムします。シリンジをポンプに装着し、シリンジとプランジャーの周囲のブラケットをしっかりと固定します。次に、3本の異なる20 centimeterの滅菌シリコンチューブの両端に、個別のオス型エルボルアーを装着し、3本のエルボルアーのそれぞれ片端に鈍端の18ゲージ針を接続します。続いて、完全自動ステージを備えた回転ディスク顕微鏡において、20倍対物レンズを選択し、適切なチャンネル設定を行います。十分なダイナミックレンジのデータを取得するため、電子倍増型電荷結合素子（EMCCD）の電子倍増ゲインを150、露光時間を200 millisecondsに設定します。491 nmレーザーの出力を20%に調整し、顕微鏡ソフトを使用して3つのレーンのすべての中央にマークを付けます。Z範囲を1.0 µmに、ステップサイズを0.5 µmに設定します。最後に、期間と間隔を選択し、1スライドあたり60タイムポイント、10秒ごとに画像をキャプチャするように設定します。VWF-血小板ストリングの形成を誘導するため、フローチャンバーの3つのレーンのうち、コントロールとして1つのレーンの培地を無血清培地のみに置換し、残りのレーンには100 µLの無血清培地で希釈した目的の刺激剤を注入します。その後、チャンバーを室温で15分間インキュベートします。刺激期間の終了後、3つのレーンすべてを100〜200 µLのPBSで洗浄し、血管クリップを使用してフローチャンバーをスライドスタンドに固定します。70 cmのチューブの端にあるオスルアーコネクタを、フローチャンバーの各リザーバーに取り付けます。続いてシリンジポンプを始動させ、PBS洗浄液を除去します。レーンが乾燥しないように、反対側のフローチャンバーリザーバーにPBSを追加でピペットします。等価な流量が確認されたら、シリンジポンプを一時停止させます。メスルアーロックカプラー付きの5 millileterシリンジを、最初の空いているオスルアーコネクタに取り付けます。そして、先端を丸めた針を、蛍光標識された洗浄血小板溶液の入った1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに浸します。システム内に気泡が入らないように、血小板溶液をゆっくりとチューブに通します。フローチャンバーの開放リザーバーにオスルアーを接続し、先ほど示した方法で他の2つのレーンにも血小板溶液を充填します。フローシステムのセットアップを確認し、すべての接続が確実であることを確認してください。シリンジポンプを再始動させ、暗所にて10分間、血小板の流れをイメージングします。次に、フローチャンバーリザーバーの吸入チューブからルアーを外します。そして、内皮細胞単層上に緩やかな生理食塩水の流れを維持するため、リザーバーにPBSを満たします。VWF-血小板ストリングの形成量を定量するため、各レーンのスライド中央から、重複しないように1枚のスライドにつき10枚の画像をキャプチャします。すべての画像を取得後、画像処理ソフトウェアを開き、[image]、[adjust]、[brightness contrast]の順にクリックします。最初の画像の明るさを調整するには、付着した血小板が定量に十分に見えるまでスクロールバーをドラッグします。次に、3個以上の血小板が直線状に配列しているのが観察された場合にVWF-血小板ストリングとして記録し、画像内のすべてのストリング数をカウントします。フロー条件の開始後、未処理の細胞では、ヒスタミンまたはPMA処理細胞と比較してVWF-血小板ストリングがほとんど認められません。一方、処理細胞では1視野あたり平均2〜3本のストリングが認められます。さらに、血小板および内皮細胞を活性化するヒストンは、未処理のコントロールやヒスタミンまたはPMAで刺激したコントロールよりも多くのVWF-血小板ストリングの生成を誘導します。この手順を行う際は、最初の採血チューブを破棄し、すべての試薬を室温で保持し、穏やかなピペッティング技術を用いることで、フロー実験まで血小板を静止状態に保ってください。白血球や血小板活性化剤の存在下におけるVWF-血小板ストリングの形成、または切断酵素atom TS13によるストリングの溶解を評価するために、この手順に変更を加えることが可能です。このビデオを視聴することで、分泌促進物質（secretogogue）によって誘導されるVWF-血小板ストリング形成の評価方法およびインビトロ・フローチャンバーモデルについて、十分に理解することができます。

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医学

血小板接着カスケードには、せん断流の存在下で、従来の（静的）ウェルプレートアッセイでは考慮されていない要因を行われます。この記事の生理的せん断流れの条件をエミュレートするマイクロ流体ウェルプレートフォーマットを利用した血小板凝集アッセイに関するレポート。...

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

せん断応力下での細菌と血管との相互作用を研究するために、血管接着に寄与する細菌と宿主因子を解剖することを可能にするフローチャンバーとin vivo腸間膜生体内顕微鏡モデルが説明されています。...

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin...

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。...

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

本研究では、定義された流路条件におけるせん断応力下で分化したヒト一次内皮細胞の表面上で産生されるフォン・ヴィレブランド因子ストリングに対する肺炎球菌の視認性の顕微鏡的モニタリングについて述べている。このプロトコルは、微分免疫染色手順を適用することにより、特定の細胞構造の詳細な可視化および細菌の定量に拡張することができる。...

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

フロー下での血小板機能を評価し、マイクロ流体デバイスを使用してシミュレートされた止血蘇生法をモデル化でき、これは外傷および輸血医療に応用できます。...

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

本記事では、全血型サイトメトリーを用いて組織因子(TF)陽性血小板の割合を定量化するプロトコルを概説し、タンパク質の評価を行います。(1) 安静状態における細胞内、(2)...

ヒト血小板における組織因子発現のフローサイトメトリー解析

本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。...

血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム

学ぶVWF-血小板文字列形成の定量解析法。炎症刺激下でのvon Willebrand因子放出と血小板捕捉をフローチャンバーで可視化し、止血機構の病態理解に役立つin vitroモデルを解説します。

調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

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