調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

この手順の全体的な目標は、分泌促進物質に応答したフォン・ヴィレブランド因子またはVWF-血小板ストリング形成を観察し、定量化することです。この方法は、Von Willebrand因子生物学および波状緩和身体病態生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。また、フォン・ヴィレブランド因子の放出と血小板結合機能を損なう突然変異に関する疑問に答えるのにも役立ちます。

この技術の主な利点は、視覚的で定量化可能なin-vitroシステムにおいて、内皮下コラーゲン、内皮細胞、VWF、および血小板間のin-vivo相互作用を再現できることです。この手法を視覚的に示していくことが重要だと感じています。複数の同時条件下でVWF血小板ストリング形成をリアルタイムで捕捉するために必要な顕微鏡検査ステップは、テキストだけでは習得するのが難しい場合があります。

まず、0.5ミリリットルのコラーゲンコーティングバッファーを1ミリリットルのルアーロックシリンジに装填します。シリンジの端をフローチャンバースライドのリザーバーにねじり、レーン全体がコーティングされ、各リザーバーがいっぱいになるまでプランジャーをゆっくりと押し下げます。リザーバーを補充して、それぞれがいっぱいになるようにします。

すべてのレーンがロードされたら、チャンバーを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、200マイクロリットルのピペットを使用してコラーゲンコーティングバッファーを取り出します。次に、各レーンをHBSSですすぎ、200マイクロリットルのピペットで生理食塩水を吸引します。

HBSSの3回目のラウンドが廃棄された後、100マイクロリットルの成長培地に1ミリリットルあたり6回目の血液増殖内皮細胞に約3倍の10を加え、フローチャンバーの各レーンに10%FBSを補充します。その後、チャンバーを摂氏37度のインキュベーターに24時間戻し、8〜12時間ごとに培地を交換します。フロー装置を組み立てるには、まず、70cmの滅菌シリコンチューブ3本それぞれの一端に、1つのオスエルボールアーコネクターを取り付けます。

そして、各チューブのもう一方の端に1つのメスルアーロックアダプターを取り付けます。メスのルアーロックアダプターを個別の20ミリリットルシリンジに接続し、シリンジポンプをプログラムします。シリンジをポンプにロードし、シリンジとプランジャーの周りにブラケットをしっかりと固定します。

次に、3つの異なる20 cm滅菌シリコンチューブの両端に個々のオスエルボールアーを取り付け、鈍い18ゲージの針を3つのエルボールアーのそれぞれ1つに接続します。次に、全自動ステージを備えたスピニングディスク顕微鏡で、20倍対物レンズを選択し、適切なチャンネル設定を行います。全動的データ範囲を取得するには、電子増倍電荷結合デバイスを電子増倍ゲイン 150 に設定し、露光時間を 200 ミリ秒にします。

491ナノメートルのレーザー出力を20%に調整し、顕微鏡ソフトウェアを使用して3つのレーンすべての中心をマークします。Z 範囲を 1.0 マイクロメートルに、ステップ サイズを 0.5 マイクロメートルに設定します。最後に、スライドごとに 60 の時点で 10 秒ごとに画像をキャプチャする期間と間隔を選択します。

VWF血小板ストリングの形成を誘導するために、フローチャンバーの3レーンから培地を置換し、無血清培地のみをコントロールとして、次に目的の刺激剤を100マイクロリットルの無血清培地で希釈して追加のレーンにします。その後、チャンバーを室温で15分間インキュベートします。刺激期間の終わりに、3つのレーンすべてを100〜200マイクロリットルのPBSで洗浄し、血管クリップを使用してフローチャンバーをスライドスタンドにマッピングします。

70 cmのチューブの端から1つのオスルアーコネクターをフローチャンバーの各リザーバーに取り付けます。そして、シリンジポンプを始動してPBSウォッシュを取り外します。対向するフローチャンバーリザーバーに追加のPBSをピペットで入れて、レーンが空にならないようにします。

同等の流量を確認したら、シリンジポンプを一時停止します。メス型ルアーロックカプラー付き5ミリリットルシリンジを、最初の空いているオス型ルアーコネクターに取り付けます。そして、鈍くなった針を、蛍光標識された洗浄済み血小板溶液が入った1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに浸します。

ゆっくりと、血小板溶液をチューブに通して、システム内に気泡がないことを確認します。オス型ルアーをフローチャンバーの開放型リザーバーに取り付け、先ほど示したように、他の2レーンに血小板溶液をロードします。フローシステムの設定をチェックして、すべての接続が安全であることを確認してください。

シリンジポンプを再起動し、暗闇の中で10分間の血小板の流れをイメージします。次に、ルアーをフローチャンバーリザーバーのインテークチューブから外します。そして、リザーバーをPBSで満たして、内皮細胞単層上の穏やかな生理食塩水の流れを維持します。

VWF-血小板ストリング形成を定量化するには、スライドの中央から重ならないように、各レーンからスライドごとに10枚の画像をキャプチャします。すべての画像を取得したら、画像処理ソフトウェアを開き、[画像]、[調整]、[明るさのコントラスト]をクリックします。最初の画像の明るさを調整するには、付着した血小板が定量化に十分に表示されるまでスクロールバーをドラッグします。

次に、3つ以上の整列した血小板が観察された場合にVWF血小板ストリングを記録し、画像内のすべてのストリングをカウントします。フロー条件の開始後、未処理の細胞は、ヒスタミンまたはPMA処理された細胞と比較して、VWF-血小板ストリングをほとんど示しません。これは、視野ごとに平均2〜3個の文字列を示します。

さらに、血小板と内皮細胞を活性化するヒストンは、未治療のヒスタミン、またはPMA刺激コントロールよりも多くのVWF血小板ストリングの産生を誘導します。この手順を試行している間は、最初の採血収集チューブを廃棄し、すべての試薬を室温に維持し、穏やかなピペット技術を使用して、血小板をフロー実験まで静止させます。この手順に変更を加えて、白血球の存在下でのVWF血小板ストリング形成、血小板活性化剤、または切断酵素原子TS13によるストリングの溶解を評価することができます。

このビデオを見れば、secretogogueによるVWF血小板ストリング形成の評価方法とin-vitroフローチャンバーモデルについて十分に理解できるはずです。