Name: レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶMLV由来レトロウイルスベクターの統合サイトマッピング法。ヒト細胞における細胞特異的調節領域を定義し、遺伝子治療と遺伝子発現制御の理解を深めるための実験プロトコルを解説します。

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この研究は、イタリア教育省、大学および研究省（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003）の欧州研究評議会（ERC-2010-AdG、GT-SKIN） 、EPIGEN Epigenomics Flagship Project）、イタリア保健省（若手研究者は2011年GR-2011-02352026）、Imagine Institute Foundation（フランス、パリ）があります。

1.ヒト細胞のMLV形質導入<ol><li> 標的細胞を単離し、eGFPレポーター遺伝子を有し、水疱性口内炎ウイルスG（VSV-G）または両性エンベロープ糖タンパク質16でシュードタイピングしたmLV由来レトロウイルスベクターでそれらを形質導入する。 <ol><li>以下の分析のために、偽形質導入細胞を陰性対照として保つ。 mLVベースのレトロウイルスベクターは効率的に分裂している細胞に形質導入できるので、細胞分裂を刺激する条件で標的細胞集団を培養する。形質導入条件は、研究中の各細胞型について特異的に最適化する必要がある。ヒト造血前駆体、T細胞および表皮細胞の細胞増殖および形質導入条件は参考文献7,14,15および17に記載されている。 </li></ol></li><li>形質導入の48時間後、2％ウシ胎仔血清を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）300μLに100,000細胞を再懸濁し、eGFP発現をf低サイトメトリー分析（488nm励起レーザー）。陰性対照として偽形質導入細胞を使用する。最適な組込み部位検索のために、蛍光活性化細胞選別（FACS）によりGFP +細胞を精製する。 </li><li>ゲノムDNA調製のために0.5〜500万個の細胞を収集する。分化していないプロウイルスを希釈するためにはより長い培養期間（&gt; 7日間）が好ましく、 真正幹細胞の長期間の子孫を分析する場合には必要である（ 討論欄および参考文献15参照）。細胞ペレットをスナップ凍結し、使用するまで-80℃で保存することができます。 </li></ol>リンカー媒介PCR（LM-PCR）によるmLV組み込み部位の増幅は、 <ol><li> ゲノムDNA（gDNA）の調製 <ol><li>カラムベースのDNA抽出キットを使用してgDNAを抽出し、製造元の指示に従って培養細胞のプロトコールに従う。 </li></ol></li><li> 制限酵素消化に<ol><li> 1.5 mLのチューブで1サンプルあたり4つの制限酵素消化を設定します。 1μLのTru9I（10U）と1μLのBuffer Mを最終容量10μLで加えることにより、各チューブに0.1〜1μggDNAを消化する。反応液を65℃で6時間または一晩インキュベートする。 </li><li>各反応物に1μLのPstI（10U）、1μLの緩衝液Hおよび8μLの水を加える。 37℃で6時間または一晩反応をインキュベートする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> リンカーライゲーション <ol><li> 100μM濃度のリンカープラス鎖およびリンカーマイナス鎖オリゴヌクレオチドを混合することにより、1.5mLチューブ中の100μMのTru9Iリンカーストック溶液を調製する。チューブを100℃にセットした水に入れ、室温で冷却させます。 Tru9Iリンカーストック溶液は、使用するまで-20℃で保存することができます。 </li><li> 1.5mLのチューブで8個のリンカーライゲーション反応をセットアップする。各反応について、以下の成分10μLの制限酵素消化：1.4μLの10X T4 DNAリガーゼ反応緩衝液、1μLの10μMリンカーTru9I、1μL（2,000U）のT4 DNAリガーゼおよび0.6μLの水。 16℃で3〜6時間インキュベートする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 最初のPCR <ol><li> 0.2mLチューブ中で48のPCR反応（各ライゲーションチューブから6反応）をセットアップする。各PCRについて、以下の試薬を2μLのライゲーション反応に添加する：5μLの10X PCRバッファー、2μLの50 mM硫酸マグネシウム、1μLの10 mMデオキシヌクレオチド（dNTP）Mix、1μLの10μMリンカープライマー、1 10μMmLV-3&#39;LTRプライマーμL、Taq DNAポリメラーゼ0.3μL（1.5U）および水37.7μLを添加した。プライマー配列を表1に示す。 </li><li>次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で2分間; 95℃で15秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを25サイクル; 72°; 5分間C; 4℃で保持する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 第2のPCR <ol><li> 0.2mLチューブ中で48のPCR反応（各「最初のPCR」チューブから1つ）をセットアップする。各PCRについて、以下の成分を2μLの第1のPCR反応に加える：5μLの10X PCR緩衝液、2μLの50mM硫酸マグネシウム、1μLの10mM dNTP Mix、1μLの10μMリンカーネスト化プライマー、1μL 10μMのmLV-3&#39;LTR入れ子プライマー、0.3μLのTaq DNAポリメラーゼ（1.5U）および37.7μLの水を含む。選択された特定の巨大な配列決定戦略のために設計されたネストされたプライマーを使用する：（i）リンカーネストプライマーおよびイルミナプラットフォームと適合するmLV-3 &#39;LTRネストプライマー; （ii）Rocheプラットフォームに適合するリンカーネステッドプライマーおよびmLV-3&#39;LTRネストプライマー。プライマー配列を表1に示す 。 </li><li>次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で2分間; 2595℃で15秒、58℃で30秒、72℃で1分のサイクル; 72℃で5分間; 4℃で保持する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li><li> 48 mLの入れ子になったPCR反応液を15 mLチューブ（最終容量〜2.4 mL）にプールする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> アガロースゲル電気泳動によってLM-PCR産物の存在およびサイズを決定する。 <ol><li> 4μLのLoading Bufferを20μLのLM-PCR産物に加え、サンプルを100 bp DNAラダーとともに1％アガロースゲルにロードします。ゲルを5V / cmで30〜60分間泳動し、エチジウムブロマイド染色によってPCR産物を視覚化する。 </li><li>ネガティブコントロールとして偽形質導入サンプルからLM-PCR反応を行う。 </li></ol></li><li> 0.1容量の酢酸ナトリウム溶液（3M; pH5.2）および2.5容量の100％エタノールを加えることによってアンプリコンを沈殿させる。混合し、-80℃で20分間凍結させる。 <ol><li>フーでスピン標準微量遠心分離機で4℃、20分間スピードアップします。上清を捨て、ペレットを70％エタノールで洗浄する。 4℃で5分間標準マイクロ遠心分離機で最高速度でスピンします。 </li><li>上清を捨て、ペレットを空気乾燥する。 PCR等級の水200μLを加え、DNAを再懸濁する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> LM-PCR産物100μLにLoading Buffer20μLを添加し、サンプルを100％DNAラダーとともに1％アガロースゲルにロードします。 <ol><li>ゲルを5V / cmで30〜60分間流し、150〜500bpのアンプリコンを含むゲル部分を切断する。 </li><li>カラムベースのゲル抽出キットでLM-PCR産物を精製し、UV分光光度計を使用して濃度を測定する。 </li></ol></li><li>メーカーの指示に従って、バイオアナライザを使用してLM-PCR産物の長さを評価するために、1μLのライブラリーを使用する。 </li><li><strong&gt;アンプリコンの散布クローニング<ol><li> 20 ngの精製LM-PCR産物を使用し、pCR2.1-TOPOベクター中で製造業者の指示に従ってクローン化する。 </li><li>得られた配列のゲノムマッピングを行ってM13ユニバーサルプライマーを用いたシークエンシング反応を行い、適切なサンプルを同定するためにクローンの&gt; 50％のウイルスゲノム接合部（mLV-3 &#39;LTRネストプライマーを含む）の存在を明らかにする大規模な配列決定のため。ウイルスゲノム接合部の例： <img alt="ジャンクション" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTRネストプライマー454およびリンカーネステッドプライマー454（ 表1 ）を太字で示し、ウイルスLTRの3&#39;末端をイタリックで示す。ヒトゲノム配列は赤色のテキストで強調表示されている（chr10：6439408-6439509、hg19）。 </li></ol></li></ol> 3. mLV統合サイトの大規模配列決定注：LM-PCRは市販のプラットフォームを使用して配列決定することができます（2回目のPCR反応で適切な入れ子になったプライマー対を選択します（2.5.1項を参照）。 Roche GS-FLXパイロシーケンシングプラットフォームによるシークエンシングについては、以前の論文7,14,15を参照してください。このセクションでは、Illuminaシーケンシングプラットフォームのために新たに最適化されたプロトコルについて説明します。 <ol><li> 図書館の準備 <ol><li> 0.2 mLのチューブで1サンプルあたり1回のインデックスPCR反応を設定します。各PCRについて、精製LM-PCR産物5μL（150-170ng）に以下の試薬を添加する：5μLのIndexPrimer1,5μLのIndexPrimer2,25μLの2X Master Mixおよび10μLのPCR-グレードの水。各サンプルに異なるインデックスの組み合わせを使用します。 </li><li>次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で3分間; 95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間の8サイクル; 72℃5mに; 4℃で保持する。 </li><li>固相可逆固定（SPRI）ビーズ分離プロトコルを使用してPCR産物を精製する：新しい1.5mLチューブで、各サンプルにビーズ56μLを加え、製造業者の指示に従う。 25μLのTris-HCl（10mM）で溶出する。ライブラリは、使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> ライブラリチェック <ol><li>バイオアナライザを使用してライブラリのサイズを評価するには、1μLのサンプルを使用します。 </li><li>メーカーの指示に従って、蛍光ベースのリアルタイムPCRアッセイを使用してライブラリーモル濃度を定量するために1μLのサンプルを使用します。 </li></ol></li><li> ライブラリーの希釈およびシークエンシング <ol><li> Tris-HCl 10mMを用いて10nMにライブラリを希釈する。ライブラリーをプールするために、各希釈ライブラリー5μLを新しい1.5mLチューブに移し、次いでプールをTris-HCl 10mM中で4nMに希釈する。 </li><li> 5μLの希釈したプールを5μLの0.2N NaOHと新たに1.5mで混合する。Lチューブに入れ、短時間ボルテックスし、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートしてライブラリーを変性させる。 </li><li>チューブを氷上に置き、予冷したハイブリダイゼーション緩衝液（HT1）990μLを加える。新しい1.5mLチューブに300μLの変性プールを分注し、300μLの予備冷却したHT1を添加して、10μM最終ライブラリープールを得る。 </li><li>並行して、2mLのPhiXコントロールライブラリー（10nM）を3mLのTris-HCl 10mMと1.5mLのチューブに混合する。 5μLのNaOH 0.2Nを添加し、短時間ボルテックスし、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、希釈したPhiXを変性させる。チューブを氷上に置き、予め冷却したHT1990μLを加える。 </li><li>新たな1.5mLチューブに300μLの変性PhiXを分注し、予め冷却したHT1300μLを加えて10μMの最終PhiXを得る。 </li><li>新しい1.5mLチューブに、変性ライブラリープール510μLを変性PhiXライブラリー90μLと混合し、15％PhiXコントロールを含む最終10pMプールを得る。 </li><li>これらのサンプル600μLをピペット容積を解凍したシーケンシング試薬カートリッジのロードサンプルリザーバーに入れ、直ちにシングルリード150サイクルを実行します。 注：このプロトコールに必要な重要な試薬およびプライマー配列を表1に示します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、クロマチン領域を標的とするレトロウイルスであるmLVの組込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載し、活性化プロモーターおよびエンハンサーとしてエピジェネティックにマークした。プロトコルの重要なステップおよび/または限界には、（i）標的細胞集団のmLV形質導入; （ii）LM-PCRによるウイルス - 宿主接合部の増幅; （iii）集積部位の高い割合の回収。 mLVベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞に効率的に形質導入する。分裂していない細胞（例えば、有糸分裂後の神経細胞）の形質導入効率が低いことは、この技術の潜在的な限界である。しかし、それは、レポーター遺伝子（ 例えば、 eGFP）の発現に基づいて、形質導入された集団の細胞選別によって克服することができる。 LM-PCR（150〜500bp）による比較的短いアンプリコンの生成は、現在使用されている大規模な配列決定戦略に適合するアンプリコンのライブラリーを作製し、mLV組込み部位の全般的分析。一例として、&gt; 500 bpのLM-PCR産物の増幅は、部分的ゲノムDNA消化またはTru9I消化ゲノム断片のライゲーション（LM-PC...

細胞同一性は、特定の遺伝子セットの発現によって決定される。プロモーターおよびエンハンサーのようなシス調節要素の役割は、細胞型特異的転写プログラムの活性化にとって重要である。これらの調節領域は、特異的ヒストン修飾、転写因子および補因子結合、およびクロマチン接近可能性などの特定のクロマチン特徴によって特徴づけられ、いくつかの細胞タイプ1,2,3 においてそのゲノムワイド同定に広く使用されている。特に、ヒストンH3リジン27（H3K27ac）のアセチル化のゲノムワイドプロファイルは、一般に、活性プロモーター、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー4,5,6を定義するために使用される。 モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）は、遺伝子に広く使用されているガンマ - レトロウイルスである哺乳動物細胞での転移。標的細胞を感染させた後、レトロウイルスRNAゲノムは、ウイルスおよび細胞タンパク質に結合して、前組み込み複合体（PIC）を構築する二本鎖DNA分子に逆転写される。 PICは核に入り、宿主細胞のクロマチンに結合する。ここで、重要なPIC成分であるウィルスインテグラーゼは、プロウイルスDNAの宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介する。ゲノムDNAにおけるmLVの組込みは、ランダムではなく、細胞特異的様式で、プロモーターおよびエンハンサーのような活性なシス調節エレメントにおいて起こる（7,8,9,10）。この特有の組込みプロファイルは、mLVインテグラーゼと細胞ブロモドメインおよび外胚葉ドメイン（BET）タンパク質11,12,13との間の直接的相互作用によって媒介される。 BETタンパク質（BRD2、BRD3、およびBRD4）は、宿主のクロマチンとmLV PICとの間の橋渡しとして作用する：それらのブロモドメインを介して、高度にアセチル化されたシス調節領域を認識するが、外側のドメインはmLVインテグラーゼ11,12,13と相互作用する。 ここでは、mLVの統合特性に基づいて活性なシス調節領域をマッピングするための新規ツールであるレトロウイルススキャニングについて説明します。簡潔に述べると、細胞は、増強緑色蛍光タンパク質（eGFP）レポーター遺伝子を発現するmLV由来レトロウイルスベクターで形質導入される。ゲノムDNA抽出後、mLVベクターの3 &#39;末端反復配列（LTR）とゲノムDNAとの間の接合部をリンカー媒介PCR（LM-PCR）によって増幅し、大量配列決定する。 mLV組み込み部位はヒトゲノムにマッピングされ、mLVによって高度に標的化されるゲノム領域はmLV組み込み部位のクラスターとして定義される。 レトロウイルススキャンいくつかのヒト初代細胞14,15 において、細胞特異的活性調節エレメントを定義するために使用された。エピジェネティックに定義されたプロモーターおよびエンハンサー（ほとんどがH3K27acなどの活性ヒストンマークを有し、細胞特異的である）と共マップされたmLVクラスターである。レトロウイルススキャニングは、前向きに単離された細胞集団7,14、ならびにケラチノサイト幹細胞のような遡及的に規定された細胞集団において、将来の単離のための有効なマーカーを欠くゲノムワイドな同定を可能にする15 。

<table><tbody><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>0.2 mlチューブ</td><td>1.5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mlチューブ</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNAミニキット&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4DNAリガーゼ反応バッファーニュー</td><td>イングランドバイオラボ</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>リンカープラスストランドオリゴヌクレオチド</td><td>一般ラボサプライヤー5</td><td></td><td>'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'&nbsp;(精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>リンカーマイナスストランドオリゴヌクレオチド</td><td>一般ラボサプライヤー5</td><td></td><td>'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3'(精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>ロシュ・シグマ・アルドリッチ</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/カットバッファー M</td><td>ロシュ・シグマ・アルドリッチ</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>PCR グレードの水</td><td>一般ラボ サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル サーマル サイクラー (加熱蓋付き)</td><td>一般ラボ サプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リンカー プライマー</td><td>一般ラボ サプライヤー</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(精製グレード:PCRグレード)</td></tr><tr><td>MLV-3'LTRプライマー</td><td>ジェネラルラボサプライヤー5</td><td></td><td>'-GACTTGTGGTCTCTCCTGTTCCTTGG-3'(精製グレード:PCRグレード)</td></tr><tr><td>リンカー ネストプライマー 454</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3'LTRネストプライマー454</td><td>一般ラボサプライヤー5</td><td></td><td>'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>リンカーネストプライマーイルミナ</td><td>一般ラボサプライヤー5</td><td></td><td>'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3'LTR ネストプライマー Illumina</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](精製グレード:SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム溶液 (3M) pH 5.2</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用エタノール(絶対)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>Topo TA クローニングキット (pCR2.1-TOPO ベクター付き)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>臭化エチジウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>100 bp DNA ラダー</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>6x ローディングバッファー</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度計</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT インデックスキット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 または FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFiホットスタートレディミックス&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Dynal 磁気スタンド 2 ml チューブ用</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml キット</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>一般ラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>D1000 試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>KAPA ライブラリ Illumina プラットフォーム用 定量キット (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT 高速リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, 分子生物学グレードの</td><td>一般ラボサプライヤーHT1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ハイブリダイゼーションバッファー)</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>MiSeq Reagent Kit</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)</td>で提供 <td>イルミナ</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>ミセクシステム</td><td>イルミナ</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>イルミナ</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのmlv統合サイトのマッピング

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

モロニーマウス白血病（MLV）ウイルスベースのレトロウイルスベクターは、主にアセチル化エンハンサーおよびプロモーターに組み込まれる。この理由から、mLV組込み部位は、活性調節エレメントの機能的マーカーとして使用することができる。ここでは、細胞特異的エンハンサーおよびプロモーターのゲノムワイドな同定を可能にするレトロウイルススキャニングツールを紹介します。簡潔には、標的細胞集団をmLV由来ベクターで形質導入し、ゲノムDNAを頻繁に切断する制限酵素で消化する。適合するDNAリンカーでゲノム断片をライゲーションした後、リンカー媒介ポリメラーゼ連鎖反応（LM-PCR）により、ウィルス - ホストゲノム接合の増幅が可能になる。アンプリコンの大規模な配列決定は、全ゲノムのmLVインテグレーションプロファイルを定義するために使用されます。最後に、細胞型特異的転写プログラムの活性化に関与する細胞特異的調節領域を同定するために、反復インテグレーションのクラスターを定義する。 例えば、体細胞幹細胞）の遡及的同定のための道具技術を表す。

レトロウイルススキャニング手順のワークフローレトロウイルススキャニング手順のワークフローは図1に図式化されています。標的細胞集団を精製し、eGFPレポーター遺伝子を発現するmLV由来のレトロウイルスベクターで形質導入する。導入遺伝子には、2つの同一の長い末端反復（5 &#39;および3&#39;LTR）が隣接し、ウイルスゲノムの合成、逆転写および宿主DNAへの組み込みを確実にする。形質導入効率は、eGFP発現のFACS分析によって評価される。高比率（&gt; 30％）のmLV形質導入細胞を含む細胞集団を増幅し、続いて溶解して、mLVウイルスカセットを含むゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAを消化し、互換性のあるリンカーで連結し、ウイルス3&#39;LTRと宿主ゲノムとの間の接合部をLM-PCRにより増幅する。ヴィルその後、我々の宿主ゲノム接...

ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

この手順の全般的な目的は、マウス白血病ウイルス（MLV）由来のレトロウイルスベクターの組み込み部位をマッピングし、細胞特異的な調節領域を定義することです。この手法は、ベクターがヒトゲノムのどこに組み込まれるか、また特定のサブタイプを通じてどの調節因子が能動的に利用されるかなど、遺伝子治療および遺伝子調節研究における重要な疑問への解答に役立ちます。我々は、遺伝子治療研究においてMLVベクターがサブタイプ特異的な活性プロモーターおよびエンハンサーに組み込まれることを観察し、本手法を考案しました。まず、EGFPリポーター遺伝子を組み込み、VSV-Gまたは両親性（amphrotopic）エンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化したMLV由来レトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を導入します。モック導入した細胞を陰性対照として使用します。導入から48時間後、サンプルを遠心分離し、100,000個の細胞を2%胎児牛血清を含む300 µLのPBSに再懸濁します。次に、フローサイトメトリー解析によりEGFPの発現量を測定します。ゲノムDNA調製およびその後の制限酵素消化のため、形質導入した細胞を別途0.5〜5 million個回収します。1.5 milliliterチューブを用いて、サンプルあたり4件の制限酵素消化系を調製します。各チューブに0.1～1 µgのG-DNAを消化させます。サンプルあたり10 unitsのTRU91と1 µLのバッファーMを加え、最終容量を10 µLにします。この混合液を2 µLずつ消化用チューブに分注します。その後、反応液を65°Cで6時間または一晩インキュベートします。インキュベート後、1.5 mLチューブに40 µLの水を加えます。同じチューブに、サンプルあたり10 unitsのPstIと1 µLのバッファーHを加えます。消化反応液 10 µL を消化用チューブに分注します。反応液を 37 °C で 6 時間または一晩インキュベートします。翌日、1.5 mL チューブを用いてリンカーライゲーション反応を 8 系統セットアップします。各反応につき、リガーゼ反応混合液を10 µLの消化済みゲノムDNAに加えます。16 °Cで3〜6時間インキュベートします。第1ラウンドPCRのため、0.2 mLチューブで48本のPCR反応をセットアップします。各PCRにつき、リンカープライマーおよびMLV3 prime LTRプライマーを含む反応混合液を、2 µLのリゲーション反応液に加えます。サンプルを加熱リッド付きのサーマルサイクラーにセットします。サイクル条件を設定し、1回目のPCR反応を行います。2回目のPCR（セカンドラウンドPCR）のため、リンカーネステッドプライマーとMLV3 prime LTRネステッドプライマーを含む反応液を調製します。次に、テンプレートとして、1回目のPCRで得られたPCR産物を2 µL加えます。その後、2回目のPCR反応を行い、最終的なLN PCR産物を生成します。2回目のPCR後、48本のネステッドLM PCR反応液を15 mLチューブに回収します。次に、プールして沈殿させたLM PCR産物100 µLに、ローディングバッファー20 µLを加えます。そして、100 bp DNAラダーとともに、サンプルを1%アガロースゲルにロードします。ゲルを5 V/cmで30〜60分間泳動し、バンドが分離したところで、500〜150 bpの長さのアンプリコンを含むゲルの部分を切り出します。カラムベースのゲル抽出キットを用いてLM PCR産物を精製した後、ライブラリ調製に進む前にUV分光光度計を用いて濃度を測定します。また、メーカーの指示に従い、バイオアナライザを用いてLM PCR産物の長さを評価します。インデックスPCRをセットアップしてライブラリを調製します。各PCRにつき、精製したLM PCR産物を150〜170 nanograms使用し、サンプルごとに異なるインデックスの組み合わせを用いてください。指示に従い、加熱リッド付きのサーマルサイクラーでPCRを実施します。PCR後、精製したライブラリを10 mM Tris-HClを用いて10 nMに希釈します。次に、希釈したプール5 µLと0.2 N 水酸化ナトリウム5 µLを、新しい1.5 mLチューブの中で混合します。短時間ボルテックスし、スピンダウンした後、室温で5分間インキュベートしてライブラリを変性させます。変性済みプールが入ったチューブを氷上に置き、あらかじめ冷却しておいたHT1ハイブリダイゼーションバッファーを990 µL準備します。次に、変性済みプールの300 µLを新しい1.5 mLチューブに分注します。そして、あらかじめ冷却しておいたHT1を300 µL加え、最終的なライブラリープールの濃度を10 pMにします。並行して、1.5 mLチューブ内で、10 nMの固定コントロールライブラリ 2 µLと 10 mM Tris-HCl 3 µLを混合します。0.2 N 水酸化ナトリウム 5 µLを加え、短時間ボルテックスします。スピンダウン後、希釈した固定物を変性させるため、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを氷上に置き、あらかじめ冷却したHT1を990 µL加えます。次に、変性させたfixを100 µL分注して新しい1.5 mLチューブに移し、あらかじめ冷却したHT1を300 µL加えて、fixの最終濃度を10 pMにします。最後に、新しい1.5 mLチューブに、変性させたライブラリープール510 µLと変性させた固定ライブラリー90 µLを混合し、シーケンスに供する、fixコントロールを15%含む最終濃度10 pMのプールを作成します。この画像は、造血幹・前駆細胞、赤芽球系前駆細胞、および骨髄系前駆細胞において、それぞれ3498個、2989個、4103個の再帰的なMLV組み込み部位のクラスターを解析した結果を示しています。各細胞集団において、MLVクラスターの95%以上が、エピジェネティックに定義されたエンハンサーおよびプロモーターと重複していました。細胞特異的なMLV標的領域は高度にアセチル化されており、標的遺伝子の細胞特異的な発現と関連していました。例としては、HSP特異的なSPINK2遺伝子のプロモーター、赤血球特異的なβ様グロビン遺伝子の強力なエンハンサーを含む遺伝子座制御領域、およびNPP特異的なLYZ遺伝の上流に位置するエンハンサーなどが挙げられます。ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、EPPおよびMPPにおける細胞特異的なMLV標的エンハンサーのサブセットが検証されました。赤血球特異的なMLV標的領域は、MPPよりもEPPで高い活性を示し、その逆も同様であったことから、MLVが近接遺伝子の発現を制御している可能性のある細胞特異的エンハンサーを同定できることが確認されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1週間で完了させることが可能です。この手順を行う際は、最適なインテグレーションサイト（組み込み部位）の回収を実現するために、形質導入細胞の頻度を最大化させることが重要です。このビデオを視聴することで、まずゲノムDNAを調整し、次にゲノム断片をDNAリンカーでライゲートさせ、続いてLM-PCRを用いてホストゲノムとウイルスの接合部を増幅し、最後にアンプリコンライブラリーをディープシーケンシングすることで、ウイルス組み込み部位をマッピングする方法について十分な理解を得ることができます。

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。...

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している...

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。...

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

潜在性の決定の増幅とフルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスに効率的かつ高スループット方法を提供でき、フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転)レプリケーション能力。反転は、潜在的な HIV 1...

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ...

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

プロウイルス選択したゲノム サイト統合を要約 HIV-1 感染の新しい体外モデルの生成のゲノム工学ワークフローを提案します。記者の HIV 由来のターゲットは、CRISPR Cas9...

選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学

HIV の効率的な再活性化の機能評価および潜在的な proviruses のクリアランスのための高いスループット プロトコル説明および HIV 転写の介入の影響をテストおよび選択的スプライシングによって適用しました。LTR...

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

挿入突然変異誘発は、機能的なゲノム要素を特定するための前方遺伝学において不可欠なツールです。ここでは、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリー内のレンチウイルス統合部位を検出する方法であるInSET(Insertion-based Screen for functional Elements and...

挿入型突然変異誘発細胞ライブラリーにおける機能関連レンチウイルス組み込み部位の同定

学ぶMLV由来レトロウイルスベクターの統合サイトマッピング法。ヒト細胞における細胞特異的調節領域を定義し、遺伝子治療と遺伝子発現制御の理解を深めるための実験プロトコルを解説します。

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

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