レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

この手順の全般的な目的は、マウス白血病ウイルス（MLV）由来のレトロウイルスベクターの組み込み部位をマッピングし、細胞特異的な調節領域を定義することです。この手法は、ベクターがヒトゲノムのどこに組み込まれるか、また特定のサブタイプを通じてどの調節因子が能動的に利用されるかなど、遺伝子治療および遺伝子調節研究における重要な疑問への解答に役立ちます。我々は、遺伝子治療研究においてMLVベクターがサブタイプ特異的な活性プロモーターおよびエンハンサーに組み込まれることを観察し、本手法を考案しました。

まず、EGFPリポーター遺伝子を組み込み、VSV-Gまたは両親性（amphrotopic）エンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化したMLV由来レトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を導入します。モック導入した細胞を陰性対照として使用します。導入から48時間後、サンプルを遠心分離し、100,000個の細胞を2%胎児牛血清を含む300 µLのPBSに再懸濁します。

次に、フローサイトメトリー解析によりEGFPの発現量を測定します。ゲノムDNA調製およびその後の制限酵素消化のため、形質導入した細胞を別途0.5〜5 million個回収します。1.5 milliliterチューブを用いて、サンプルあたり4件の制限酵素消化系を調製します。

各チューブに0.1～1 µgのG-DNAを消化させます。サンプルあたり10 unitsのTRU91と1 µLのバッファーMを加え、最終容量を10 µLにします。この混合液を2 µLずつ消化用チューブに分注します。

その後、反応液を65°Cで6時間または一晩インキュベートします。インキュベート後、1.5 mLチューブに40 µLの水を加えます。同じチューブに、サンプルあたり10 unitsのPstIと1 µLのバッファーHを加えます。

消化反応液 10 µL を消化用チューブに分注します。反応液を 37 °C で 6 時間または一晩インキュベートします。翌日、1.5 mL チューブを用いてリンカーライゲーション反応を 8 系統セットアップします。

各反応につき、リガーゼ反応混合液を10 µLの消化済みゲノムDNAに加えます。16 °Cで3〜6時間インキュベートします。第1ラウンドPCRのため、0.2 mLチューブで48本のPCR反応をセットアップします。

各PCRにつき、リンカープライマーおよびMLV3 prime LTRプライマーを含む反応混合液を、2 µLのリゲーション反応液に加えます。サンプルを加熱リッド付きのサーマルサイクラーにセットします。サイクル条件を設定し、1回目のPCR反応を行います。

2回目のPCR（セカンドラウンドPCR）のため、リンカーネステッドプライマーとMLV3 prime LTRネステッドプライマーを含む反応液を調製します。次に、テンプレートとして、1回目のPCRで得られたPCR産物を2 µL加えます。その後、2回目のPCR反応を行い、最終的なLN PCR産物を生成します。

2回目のPCR後、48本のネステッドLM PCR反応液を15 mLチューブに回収します。次に、プールして沈殿させたLM PCR産物100 µLに、ローディングバッファー20 µLを加えます。そして、100 bp DNAラダーとともに、サンプルを1%アガロースゲルにロードします。

ゲルを5 V/cmで30〜60分間泳動し、バンドが分離したところで、500〜150 bpの長さのアンプリコンを含むゲルの部分を切り出します。カラムベースのゲル抽出キットを用いてLM PCR産物を精製した後、ライブラリ調製に進む前にUV分光光度計を用いて濃度を測定します。また、メーカーの指示に従い、バイオアナライザを用いてLM PCR産物の長さを評価します。

インデックスPCRをセットアップしてライブラリを調製します。各PCRにつき、精製したLM PCR産物を150〜170 nanograms使用し、サンプルごとに異なるインデックスの組み合わせを用いてください。指示に従い、加熱リッド付きのサーマルサイクラーでPCRを実施します。

PCR後、精製したライブラリを10 mM Tris-HClを用いて10 nMに希釈します。次に、希釈したプール5 µLと0.2 N 水酸化ナトリウム5 µLを、新しい1.5 mLチューブの中で混合します。短時間ボルテックスし、スピンダウンした後、室温で5分間インキュベートしてライブラリを変性させます。

変性済みプールが入ったチューブを氷上に置き、あらかじめ冷却しておいたHT1ハイブリダイゼーションバッファーを990 µL準備します。次に、変性済みプールの300 µLを新しい1.5 mLチューブに分注します。そして、あらかじめ冷却しておいたHT1を300 µL加え、最終的なライブラリープールの濃度を10 pMにします。

並行して、1.5 mLチューブ内で、10 nMの固定コントロールライブラリ 2 µLと 10 mM Tris-HCl 3 µLを混合します。0.2 N 水酸化ナトリウム 5 µLを加え、短時間ボルテックスします。スピンダウン後、希釈した固定物を変性させるため、室温で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブを氷上に置き、あらかじめ冷却したHT1を990 µL加えます。次に、変性させたfixを100 µL分注して新しい1.5 mLチューブに移し、あらかじめ冷却したHT1を300 µL加えて、fixの最終濃度を10 pMにします。最後に、新しい1.5 mLチューブに、変性させたライブラリープール510 µLと変性させた固定ライブラリー90 µLを混合し、シーケンスに供する、fixコントロールを15%含む最終濃度10 pMのプールを作成します。

この画像は、造血幹・前駆細胞、赤芽球系前駆細胞、および骨髄系前駆細胞において、それぞれ3498個、2989個、4103個の再帰的なMLV組み込み部位のクラスターを解析した結果を示しています。各細胞集団において、MLVクラスターの95%以上が、エピジェネティックに定義されたエンハンサーおよびプロモーターと重複していました。細胞特異的なMLV標的領域は高度にアセチル化されており、標的遺伝子の細胞特異的な発現と関連していました。

例としては、HSP特異的なSPINK2遺伝子のプロモーター、赤血球特異的なβ様グロビン遺伝子の強力なエンハンサーを含む遺伝子座制御領域、およびNPP特異的なLYZ遺伝の上流に位置するエンハンサーなどが挙げられます。

ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、EPPおよびMPPにおける細胞特異的なMLV標的エンハンサーのサブセットが検証されました。赤血球特異的なMLV標的領域は、MPPよりもEPPで高い活性を示し、その逆も同様であったことから、MLVが近接遺伝子の発現を制御している可能性のある細胞特異的エンハンサーを同定できることが確認されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1週間で完了させることが可能です。

この手順を行う際は、最適なインテグレーションサイト（組み込み部位）の回収を実現するために、形質導入細胞の頻度を最大化させることが重要です。このビデオを視聴することで、まずゲノムDNAを調整し、次にゲノム断片をDNAリンカーでライゲートさせ、続いてLM-PCRを用いてホストゲノムとウイルスの接合部を増幅し、最後にアンプリコンライブラリーをディープシーケンシングすることで、ウイルス組み込み部位をマッピングする方法について十分な理解を得ることができます。