シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

本手順の目的は、DNAに沿った分子輸送を研究するための、シンプルで堅牢かつ高スループットな単一分子フローストレッチングアッセイを構築することである。これは、まずビオチン標識オリゴをlambda-DNAにライゲーションして、ビオチン標識lambda-DNAを調製することで達成される。次のステップでは、一段階の反応プロトコルに従って、ポリエチレングリコール（PEG）機能化カバースリップを調製する。

次に、あらかじめチャネルがカットされた両面テープを、PEG修飾カバーガラスと、入口および出口の穴があるポリジメチルシロキサン（PDMS）スラブで挟み込み、ハイスループットフローセルを構築します。最後のステップは、タイムラプス全内部反射蛍光（TIRF）イメージングを用いて、フローチャネル内における単一蛍光分子の軌跡を追跡することです。流れによって伸長したlambda-DNAに沿って拡散する単一分子の軌跡を特定するために、信頼性が高く効率的なカスタム単一粒子追跡ソフトウェアを使用して、生の蛍光画像を解析します。

代替案と比較した本アッセイ構成の主な利点は、カバースリップ調製の信頼性、スループット能力の向上、サンプル調製における実作業時間の短縮、およびより効率的な教師なしデータ解析にあります。本手順の実演は、私の研究室の博士研究員であるKan Xiong博士が行います。本アッセイを開始する前に、プロトコルの本文に従い、必要なすべての試薬を調製してください。

0.5 mg/mLのλ-DNAストック溶液を65 °Cで60秒間加熱し、直ちに氷上に置いて急冷します。マイクロ遠心チューブ内で、100 µLのλ-DNA溶液と2 µLの10 µMビオチン標識オリゴを混合します。この混合液を65 °Cで60秒間加熱し、その後、室温までゆっくりと冷却します。

混合物を氷上に置きます。T4 DNA ligase反応バッファーを11 µL加え、穏やかに混ぜ合わせます。次に、800 unitsに相当するT4 DNA ligaseを2 µL加え、穏やかに混ぜ合わせます。

混合物を16°Cで2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。公称分子量分画限界100 kDaの遠心フィルターチューブを用いて、生成物を精製します。染色瓶に入れた95%エタノール中で1番のカバーガラスを10分間超音波処理し、その後、超純水で3回洗浄します。

染色瓶に1 M 水酸化カリウムを満たし、再び10分間超音波処理した後、超純水で3回洗浄します。このサイクルを2回繰り返します。カバーガラスをクリーンで乾燥した窒素ガス流下で乾燥させます。

900 millitorrの圧力で5分間エアプラズマ処理を行い、カバースリップをさらに洗浄し乾燥させます。95% ethanolに溶解した25 mg/mLのシラン-ポリエチレングリコール-ビオチン50 µLとともに、カバースリップを室温で2時間インキュベートします。超純水で過剰なポリエチレングリコールを洗い流し、ポリエチレングリコールでコーティングしたカバースリップをクリーンで乾燥した窒素ガス気流下で乾燥させます。

CADソフトウェアを用いて流路を設計し、テープカッターを使用して両面テープに流路を切り出します。流路内部のテープ残渣を除去してください。PDMSスラブを作成するため、ミキサーを用いて45 gのPDMSと5 gの架橋剤を十分に混合します。

混合液を2枚の100 mmペトリ皿に注ぎ、すべての気泡が消えるまで真空チャンバー内に約30分間放置します。その後、PDMSが凝固するまで80 °Cのオーブン内で約2時間放置します。あらかじめチャネルがカットされた両面テープのサイズに合わせたPDMSスラブを切り出します。

両面テープから保護フィルムを1枚剥がし、PDMSスラブの平坦な面に貼り付けます。23ゲージの針を備えたバイオプシーホールパンチャーを用いて、PDMSスラブに流出口と流入孔を開けます。両面テープのもう一方の保護フィルムを剥がし、カバーガラスの機能化された表面に貼り付けます。

組み立てたフローセルを顕微鏡ステージ用インサートに固定します。あらかじめ脱気したすべての試薬をリザーバーに充填します。リザーバーには、ソレノイドバルブに接続されたTygonチューブと、試薬の逆流を防止するPEEKチューブに接続された別のチューブが備わっています。試薬の流れは、スクリプトプログラミングアプリケーションによって制御されるソレノイドバルブで制御されます。

ブランクバッファーを流し、1つのフローチャネルをプライミングします。他の3本のPEEKチューブをインレット穴に挿入します。チャネル内に気泡が発生しないよう注意してください。

Tygonチューブを短いPEEKチューブで出口穴からサンプル廃棄容器に接続します。0.2 milligrams per milliliterのストレプトアビジン溶液を流し、5分間インキュベートします。その後、ブランクバッファーを流して、未結合のストレプトアビジンを洗い流します。

1 mg/mLのウシ血清アルブミン溶液を流し、1分間インキュベートします。次に、結合していないウシ血清アルブミンを洗い流すために、ブランクバッファーを流します。続いて、100 pMのビオチン化λ-DNA溶液を流し、10分間インキュベートします。

次に、結合しなかったlambda-DNAを洗い流すため、ブランクバッファーを流します。PEG機能化されたカバースリップの品質を確認するために、SYTOX OrangeなどのDNA染色色素を流し、蛍光イメージングを開始します。カバースリップの品質が良好であれば、流れによって伸展したlambda-DNAの密度が高くなります。

また、ほぼ完全にフロー伸長したlambda-DNAの画像のS/N比が最大になるように、TIRF角を調整します。単一分子の軌跡を追跡するには、まず新しいチャネル内でインキュベーションを開始し、シリンジポンプを用いて十分な流速でサブナノモル濃度の蛍光標識分子を導入し、フレームレート100 Hzでタイムラプス蛍光画像を収集します。通常、1つの視野につき10,000フレームを収集し、複数の視野から動画を収集します。

最後に、DNA染色染料を再度流し、DNAが依然としてフローストレッチ可能であることを確認します。DNAに沿って拡散する単一分子の軌跡を特定するために、カスタムの単一粒子追跡ソフトウェアを使用します。このソフトウェアは、まず単一粒子の重心位置を高精度に決定します。

カバースリップ表面に付着した粒子を除去し、次に異なるフレーム内の粒子をリンクさせてタイムラプス軌跡を形成します。これらの軌跡から、1D拡散係数を推定します。データ解析を開始するには、スクリプトプログラミングアプリケーションを開き、シングルパーティクルトラッキングソフトウェアのディレクトリに移動してください。

largedataprocess3.m という名前のスクリプトを開きます。定義すべき重要なパラメータの一つに、単一粒子検出の閾値があります。最適な閾値を決定するために、determine_threshold_value を実行してください。

mスクリプト。このスクリプトでは、閾値が単一粒子検出にどのように影響するかを可視化します。最適な閾値を決定した後、largedataprocess3を実行してください。

mスクリプト。単一粒子追跡解析の完了後、trajectory_filtering.mスクリプトを実行して、生の軌跡をフィルタリングします。

フィルタリング工程を可視化するために、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を構築します。GUIパネルで、DNAに沿った最小変位（MinXDisp）を2ピクセルに設定します。DNAと直交する最大変位（MaxYDisp）を2ピクセルに設定します。

最小フレーム数（minFrames）を10に設定します。トリプレットの最小状態数（minTriplets）を10に設定します。DNAに沿った最小拡散係数（D_par）を0に設定します。

DNAに垂直な方向の最大推定拡散係数 D_trans を 10 mega base pair squared per second に設定します。最小統計パラメータ Chi2 Stat を -5 に設定します。DNAに沿った変位とDNAに垂直な変位の最小比 MinX/Y を 2 に設定します。

これらのフィルタリングパラメータを通過したすべての生トラジェクトリーは表1に、通過しなかったものは表3にリストされます。表1のトラジェクトリー番号をクリックしてください。そのトラジェクトリーがグラフィックス1および2に表示されます。

再生ボタンをクリックして、生の蛍光画像を再生してください。このトラジェトリーが単一分子のスライディングトラジェトリーである場合は、「table2に追加」をクリックしてください。最終的に、table2に追加されたすべてのトラジェトリーは、GUIを閉じる際に保存されます。

すべてのフィルタリングステップを通過した軌道をまとめ、そこから平均拡散係数を推定します。平均拡散係数を算出するには、単にcalculate_mean_diffusion_constant.mスクリプトを実行してください。この手順は、in vitroの単一分子生物物理学を研究する多くの人々にとって有益なものです。