急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定

折りたたみと結合差動スキャン熱量測定による不耐熱配位子との相互作用は生体分子の迅速な評価のためのプロトコルを提案します。

この方法論の全体的な目標は、熱不安定性配位子を使用して、わずか2回の実験で示差走査熱量測定(DSC)により、生体分子のフォールディングと結合相互作用を支配する熱力学的パラメータを抽出することです。この方法は、生体分子と密結合阻害剤との間の相互作用を支配する熱力学的パラメータの相対的な大きさなど、バイオカロリメトリーおよびドラッグデザイン分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、1回の実験で完全なリガンド滴定が行われ、グローバルフィッティング解析から熱力学パラメータを迅速に抽出できることです。

まず、精製した生体分子をリガンド溶液に透析するためのバッファーを調製します。0.5〜1.7キロダルトンのカットオフの透析チューブを使用して、少なくとも1リットルの緩衝液に対して生体分子を透析します。高品質のDSCデータを取得するための最も重要なステップは、目的のバッファーに対する生体分子リガンドの透析です。

これにより、DSC データにバッファーの不一致のアーティファクトが存在しないことが保証されます。ワーキングバッファーと呼ばれる最終バッファーを、バッファーと完全に平衡化された0.2ミクロンのフィルターでろ過します。リガンドの所望の質量を秤量し、それらを濾過した作業緩衝液に溶解します。

目的のリガンド濃度で質量が小さすぎて正確に計量できない場合は、濃縮リガンドストック溶液を調製します。生体分子ストック溶液を、ワーキングバッファーで完全に平衡化した0.2ミクロンのフィルターでろ過します。次に、吸光度測定により生体分子の濃度を決定します。

調製した生体分子とリガンドは、摂氏4度の冷蔵庫で、または生体分子とリガンドが凍結に耐え、長期保存が必要な場合はマイナス20度またはマイナス80度で保存します。卓上型脱気器で分子と配位子溶液を用いてバッファーを脱気してから、示差走査熱量計(DSC)にロードします。DSCから圧力ハンドルを緩めます。

次に、ワーキングバッファーからシリコンチューブを流し、リファレンスキャピラリーのフロントフランジに取り付けます。参照キャピラリーとサンプルキャピラリーの間にブリッジを作成するには、背面の参照フランジを前面の単純フランジに接続します。次に、シリコンチューブの一部を、真空ラインが取り付けられた廃フラスコに通じる背面のサンプルフランジに取り付けます。

バキュームラインをオンにして、DSCを200ミリリットルの作業バッファーで洗い流します。まず、シリコンチューブの約3〜5センチメートルのセクションをリファレンスキャピラリーフランジに取り付けます。次に、1ミリリットルのピペットチップをリアフランジのシリコンチューブに挿入します。

ピペットで0.8ミリリットルの作業バッファーを引き出し、バッファー付きのピペットチップをフロントリファレンスフランジのシリコンチューブに挿入します。ピペットプランジャーを静かに押し下げて、ワーキングバッファーをフロントシリコンチューブからリファレンスキャピラリーに通し、リアフランジの取り付けられたピペットチップに通します。作業バッファレベルがフロントシリコンチューブのすぐ上に達するまでピペットプランジャーを押し下げ、次にワーキングバッファレベルがリアシリコンチューブのすぐ上に達するまでピペットプランジャーを放します。

作業バッファーを参照キャピラリー内で前後に通過させ続けて、気泡の量をパージします。次に、リアピペットチップを人差し指でキャップし、リアピペットチップとフロントピペットをそっと引き上げて、シリコンチューブを取り付けたリファレンスフランジから取り外します。前回と同様に、サンプルキャピラリーに作業バッファーをロードします。

背面の参照サンプルフランジに黒いプラスチックキャップを取り付け、前面のフランジを覆わないようにします。圧力ハンドルをDSCに取り付けてからDSCソフトウェアを開き、電力の読み取り値が安定したら、インターフェースの上部にある赤い上矢印をクリックして機器を加圧します。DSCの電力は、機器の温度と圧力の読み取り値とともに、インターフェースの右上にあるボックスに示されます。

DSCをワーキングバッファーで平衡化するには、画面左側の実験方法タブでフォワードスキャンとリバーススキャンを実行します。スキャン オプションが選択されて、DSC および温度スキャン モードが実行されていることを確認します。[実験方法]タブの下の[温度パラメータ]で、[加熱]ボタンをクリックします。

実験温度の下限と上限は1°Cと100°C、スキャンレートは1分あたり1°C、平衡化期間は60秒を入力します。平衡化期間の入力フィールドの下にあるAddSeriesボタンをクリックします。ポップアップウィンドウのフィールドを追加する手順に2を入力し、[Alternate Heating/Cooling]ボックスをオンにします。

[OK] をクリックします。追加されたスキャンは、インターフェイスの下部に表示されます。各スキャンのパラメータが希望どおりであることを確認します。インターフェースの上部にある緑色の再生ボタンをクリックして、テストを開始します。

目的のウィンドウに移動し、ポップアップウィンドウに実験を保存するためのファイル名を入力します。実験の進行状況を表示するには、実験方法タブの右側にあるデータタブをクリックします。サンプルデータのベースライン減算のための参照実験を実行するには、両方のキャピラリーにワーキングバッファーを装着したDSCを再ロードします。

適切な温度範囲で、1分間に摂氏1度で複数のフォワードスキャンとリバーススキャンを、アップ平衡化時間120秒で収集します。インターフェースの下部から前のバッファー平衡スキャンを削除するには、各スキャンを個別に強調表示し、インターフェースの右中央にある赤いXをクリックします。新しいスキャンを追加するには、[AddSeries]ボタンをクリックし、追加手順のフィールドに20を入力し、[Alternate Heating/Cooling]ボックスをオンにします。

次に、[OK] をクリックし、前と同じように緑色の再生ボタンをクリックして実験を実行します。両方のキャピラリーに所望の濃度のリガンドを含むワーキングバッファーでこれらのステップを繰り返し、リガンドの参照実験を行います。熱不安定性変換の速度定数を取得するために使用する 2 つの別々の実験を収集します。

遊離生体分子データセットについては、参照キャピラリーにワーキングバッファーが含まれ、サンプルキャピラリーにワーキングバッファー中の所望の濃度の遊離生体分子が含まれていることを確認してください。次に、リファレンススキャンで使用したのと同じDSCローディング手順と実験パラメーターを使用して、サンプル実験を実行します。リガンド結合実験では、リガンドがワーキングバッファーにあり、リファレンスキャピラリーと生体分子とリガンドがサンプルキャピラリーのワーキングバッファーにあることを確認します。

以前と同様に、異なるリガンドの追加間でシステムをフラッシュします。熱不安定性配位子に結合した生体分子でもう1つの実験を行い、高温平衡化期間を600秒に増やし、他のすべての実験パラメータを以前と同じにします。テキストプロトコルで説明されているように、データ処理と分析に進みます。

熱不安定性配位子が結合したピークの位置と高さは、スキャンのたびに熱に不安定なリガンドが枯渇するにつれて、結合していない分子の位置と高さに向かって連続的にシフトします。3D成熟プロファイルは、熱不安定性リガンド変換のエンドポイントの参照として使用されます。高温平衡化期間を長くすると、短い平衡期間のデータセットと比較して、スキャンごとに熱不安定性配位子濃度がより顕著に減少します。

2つのデータセットから最適化されたグローバルフィット濃度パラメーターを使用して、高平衡化温度でのリガンド変換の速度定数を計算できます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば72時間で完了します。この手順を試みるときは、データアーティファクトを防ぐために、ローディングピペットを使用してDSCキャピラリーの気泡をパージするために、生体分子リガンドのガスも抜くことを忘れないでください。

このビデオと記事を読めば、生体分子のDSC実験の実施方法と、フォールディングと結合の相互作用を支配する熱力学パラメータを迅速に抽出するためのグローバルフィッティング解析の実施方法について十分に理解できるはずです。この方法は、平衡フォールディング結合相互作用に関する洞察を得ることができますが、スローフォールディングおよび/またはリガンド結合速度論を示す生体分子などの他のシステムにも適用できます。