Name: 急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶDSCを用いた生体分子の折りたたみと結合相互作用の熱力学的パラメーター抽出法。不耐熱配位子を活用し、わずか2回の実験で迅速にデータを取得し、バイオカロリメトリーと創薬研究に貢献します。

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R. W. H. V は、マギル大学自然科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) Bionanomachines トレーニング プログラムによって支えられました。A. K. M. と p. e. j. は、レベル補助金 327028-09 (A. K. M) と 238562 (p. e. j.) によって支えられました。

1. サンプル準備
<ol><li>目的の生体分子13を浄化します。 注: このプロトコルを購入使用してコカイン バインディング DNA アプタマー MN4 に対して 3 回遠心フィルターを用いた 3 kDa の分子量カットオフ膜純水 3 つのラウンドに続いて 2 の M の NaCl を交換した後。</li>
	<li>合成や浄化、目的不耐熱リガンド13を購入します。 注: MN4 不耐熱リガンド コカインにバインドします。MN4 はまた、これらの実験の温度でリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されるキニーネをバインドします。</li>
	<li>精製された生体分子の透析と配位子 (20 mM リン酸ナトリウムと 140 mM NaCl のバッファー、MN4 とここで使用されるリガンドの pH 7.4) の溶解バッファーを準備します。</li>
	<li>透析の管を使用してバッファーの少なくとも 2 L に対して生体分子を dialyze 0.5 - 1.0 kDa カットオフ。</li>
	<li>徹底的にバッファーと平衡しては 0.2 μ m フィルターを通過、最後のバッファー (バッファーと呼ばれます) をフィルターします。</li>
	<li>リガンドの目的の固まりを量りし、フィルター バッファー中に溶解します。必要なリガンド濃度は正確に計量するのに小さすぎる大衆を必要とする場合は、集中配位子ストック ソリューション (たとえば 10 倍) です。 注: すべての DSC 実験サンプルの同じ作業バッファーを利用し、リガンド、すなわちは決して実験を実行バッファーの原因になります生体より作業バッファーの異なるバッチ内に配位子が解散が重要です。データの不一致アーティファクト。</li>
	<li>徹底的に作業バッファーと平衡に達したされている 0.2 μ m のフィルターを通して生体分子の原液をフィルターします。</li>
	<li>吸光度測定による生体分子の濃度を決定する (260 nm MN4 と 280 のような核酸蛋白質の nm)。</li>
	<li>4 ° C の冷蔵庫 (MN4 とここで使用されるリガンドに適した)、または-20 で準備された生体分子と配位子を格納または-80 ° C 生体分子と配位子凍結や長期保存に耐える場合は必要です。ドガは、DSC に読み込む前にテーブルの上でバッファー、生体分子、およびリガンド ソリューション製 (材料の表を参照してください)。 注: は脱ガス気泡の高温 DSC を防ぐのに役立ちます。泡は、無名の DSC ピーク形状と基準信号アーチファクトを引き起こします。</li>
</ol>2. DSC 準備
<ol><li>DSC から圧力ハンドルを外し (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>バッファーからシリコン チューブを実行し、参照毛細血管のフロントのフランジ (金属開口部) にアタッチします。</li>
	<li>リア参照フランジをフロント サンプル フランジに接続することで管を参照、サンプル間のブリッジを作成します。</li>
	<li>真空線付き廃棄物フラスコに実行される後部サンプル フランジにシリコン チューブの部分を取り付けます。</li>
	<li>200 ml のバッファーの DSC をフラッシュする真空ラインを入れます。</li>
	<li>バッファー付き DSC の参照毛細血管をロードします。参照キャピラリー フランジ約シリコン チューブの 3-5 cm のセクションに接続します。</li>
	<li>後部フランジのシリコン チューブに 1 mL ピペット チップを挿入します。0.8 mL のピペットで作業バッファーを描画、バッファーでピペットの先端を前基準フランジのシリコン チューブに挿入します。</li>
	<li>優しく、パス フロント シリコン チューブを介して作業バッファー参照毛細血管にまでピペット プランジャーを押すし、後部フランジには、ピペット チップを添付します。作業バッファー レベルに達するフロント シリコン チューブのすぐ上までピペット プランジャーを押しし、後部シリコン チューブのすぐ上の作業バッファー レベルに達するまでピペット プランジャーをリリースします。<ol>
<li>泡の参照毛細血管内のボリュームを削除するのには、前後の作業バッファーを渡すことを繰り返します。 注: 通常、前後のソリューションの 10 のパス、任意の気泡をクリアするのに十分です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>親指で背面のピペット チップをキャップし、リアのピペット チップと接続されているシリコン チューブで参照フランジからそれらを削除するフロントのピペットを軽く引いてください。</li>
	<li>2.6 2.9 の手順のようにバッファーにサンプル毛細血管をロードします。後方参照の黒いプラスチックのキャップを置き、フランジ、明らかにフロントのフランジを残してのサンプルします。</li>
	<li>圧力ハンドルをアタッチします。</li>
	<li>DSC ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください) や電源読書が安定; したらインターフェイスの上部にある矢印を赤をクリックして楽器を加圧DSC 力が上部のボックスに示されている機器の温度および圧力を読むインターフェイスの右。 注: モニター DSC として読書力を加圧します。力の変化以上 〜 10 μ を示すデータのアーティファクトを引き起こす可能性が毛細血管のバブル形成。ソリューションを削除し、脱気する必要があります続行する前にさらに。</li>
	<li>前方および逆スキャンを実行することでバッファーと DSC を平衡します。画面の左側にある「実験方法」タブでは、スキャン モードの温度で DSC を実行する「スキャニング」オプションが選択されているを確認います。 注: 実験的パラメーターは、温度範囲をスキャン、スキャン レート、低・高温平衡時間スキャン数です。<ol>
<li>「実験方法」タブで"温度パラメーター"はめ込み、で"暖房"のボタンをクリックしてします。下限と上限の実験的温度、1 ° C/分スキャン率および 60 の 1 ~ 100 ° C を入力平衡期間 s。</li>
		<li>入力フィールドの下の平衡期間」シリーズの追加」ボタンをクリックします。(1 度の加熱と冷却スキャン) のポップアップ ・ ウィンドウで「手順を追加」フィールドに 2 を入力し「代替加熱/冷却」ボックスをオン。"OK"をクリックします。追加のスキャンは、インタ フェースの下部に表示されます。各スキャンのパラメーターは、チェック目的です。</li>
		<li>インターフェイスの上部に緑色の「再生」ボタンをクリックしてテストを開始します。目的のフォルダーに移動し、ポップアップ ウィンドウで実験を保存するファイル名を入力します。実験進捗状況を表示するには、「実験法」タブ右側に「データ」タブをクリックしますします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 不耐熱リガンド DSC データセットの収集
います最小限の手順で構成されて 5 つの実験: バッファー参照実験とリガンドなし (基線の減算に使用する、議論参照)、サンプル無料の生体分子、リガンド分子の実験と長い高温平衡期間とリガンド分子。
<ol><li>参照実験サンプル データの基線の減算を実行します。両方の毛細血管でバッファーと DSC を再読み込み、1 ° C 分-1が上限 (高温) で適切な温度範囲にわたって複数の前方および逆スキャンを収集 120 の平衡化時間 s。<ol>
<li>インターフェイスの下の部分から個別にそれぞれを強調表示し、インタ フェースの右中央に赤色の X をクリックすると以前のバッファーの平衡化スキャンを削除します。新しいスキャンを追加するには、「シリーズを追加」ボタンをクリックして、「追加手順」のフィールドに 20 を入力、"代替加熱/冷却"ボックスをチェックします。OK をクリックし、上記の緑の再生ボタンをクリックしてテストを実行します。</li>
		<li>リガンドの手順 3.1 - 目的の参照を取得する両方の毛細血管でリガンド濃度バッファーで 3.1.1 実験 (120 を使用して 2 つの独立した実験を収集 s と 600 s 高温平衡の回それぞれ、不耐熱リガンド変換の速度定数を取得で使用される)。 注: ここで使用されるスキャン レートにより、その後の実験で生体分子が (説明参照) 前方および逆引きのスキャンで熱平衡状態にあります。スキャン レート < 0.1-0.2 ° C 分-1騒々しいサーモグラムにつながるし、DSC 実験には適用できません。温度を生体分子のリガンドで飽和の融点の上よく無料の生体分子の溶解温度以下の井戸から拡張する必要があります (~ MN4 20-80 ° C)。(例、10 進むと合計 20 の 10 逆スキャンで十分です) スキャンの再現性を確認します。</li>
		<li>複数のリガンド (コカイン キニーネなど) を使用している場合は、毛細血管から配位子を外し、クロス汚染を防ぐために実行の間 (2.5 のステップから繰り返し) 作業バッファーの 200 mL の DSC をフラッシュします。 注: 以前の配位子が毛細血管の壁を強く吸着し、バッファーのフラッシュは適切に削除されないかどうかをチェックするために無料の生体分子のリガンドを実行した後複製の実験を実行すると便利です。無料の生体分子のサーモグラム リガンド結合実験後に大きい大きさと高い変性温度に移行する場合、以前の配位子がフラッシュした後カロリメータにまだ存在するそうです。20% で毛細血管の孵化によって吸着リガンドを削除オフ圧力ハンドル、プラスチック製のキャップと 60 ° C で 1 時間の Contrad 70。DSC ソフトウェアで平衡化時間のため入ったゼロ「等温」期間と等温温度 60 ° C の実験方法タブを選択 3,600 秒の下でに実験モードを変更します。「実験方法に追加」をクリックします。等温実験は、画面の下部に表示されます。終了後、2 L の脱イオン水で楽器をフラッシュし、2.5 のステップからを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>同じ参照をスキャン プロシージャおよび実験的パラメーターを読み込み DSC を使用してサンプル実験を実行します。無料の生体データ セットの参照毛細血管にバッファーが含まれているサンプル キャピラリーには作業バッファーに必要な濃度で無料の生体分子が含まれていることを確認します。<ol>
<li>リガンド結合実験、リガンドはバッファー参照毛細血管で、生体分子と配位子は、サンプル、キャピラリー中でバッファーを確認します。追加ステップ 2.5 のように異なる配位子の間のシステムをフラッシュします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>600 の高温平衡期間の増加、不耐熱リガンド行きの生体追加実験の 1 つを実行 s とすべての他の実験的パラメーターは、3.2.1 の手順と同じです。 注: 第二配位子結合実験のため高温平衡期間中は単にリガンドの短い平衡時間実験よりより急速に劣化を確実に選択されます。最初からリガンド ピーク実験スキャン数の関数としてゆっくり崩壊場合 (例えば、連続ピーク マキシマの違いある ≤ 0.5 の ° C)、高温平衡期に 10 〜 20 倍向上の推定十分に配位子を消費し、第 2 の実験。配位子の変換のための速度定数の正確な計算は、2 番目の実験を最初に対する配位子のより速い枯渇する必要があります。同様、リガンドの枯渇が十分に 2 番目の実験ではアクセラ レートされていない場合使用できない 2 つの実験のグローバル分析から抽出されたリガンド濃度にあります。</li>
</ol>4. データ処理
<ol><li>開いている DSC 実験 DSC データ解析ソフトウェアでファイル (材料の表を参照) と生の力データをスプレッドシートとしてエクスポートします。</li>
	<li>データフィッティングのためのソフトウェアに未加工力データを含むスプレッドシートをインポートします。</li>
	<li>ベースラインは、無料からのバッファー データと生体分子リガンド結合実験を減算してサンプル データを減算します。 注: 不耐熱リガンド実験のため初期リガンドの濃度は各スキャンで減少しています。したがって、サンプル スキャン 1 からバッファー スキャン 1 を減算に最適です。リガンド変換が行わし、不耐熱リガンド データのすべてを減算する単一不耐熱リガンド バッファー スキャンを使用ことができますそのためにコカインとバッファー スキャンがかなり変化しないことがわかった。</li>
	<li>サンプルのベースライン減算力データを比熱容量に変換します。 注: 変換には、推定14,,1516は、生体分子の部分比容が必要です。熱容量を電力に変換する数式がずっと17で説明しました。</li>
</ol>5. データの解析
<ol><li>世界的に短い平衡時間不耐熱リガンド熱容量データセットに一連のベースライン、配位子濃度、折りたたみ、およびリガンド結合パラメーター4を前述のように合います。</li>
	<li>不耐熱リガンド変換4を前述のように速度定数を計算するために長い平衡時間データセットのグローバル フィットを繰り返します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

変更とトラブルシューティング
図 1 と図 2で使用されているグローバル フィット分析の詳細がされている4で説明しました。ここでは、実行して不耐熱配位子を DSC 結合実験の分析の実用的な側面をまとめました。不耐熱配位子だけでは配位子から差し引かれるために、DSC ベースラインが得られることに注意してください + 生体分子データセット、リリースまたは熱変換によって吸収される熱を効果的にキャンセル自体を処理します。標準不耐熱リガンド グローバル管継手解析 (図 1 および図 2) とし、システムは、熱力学的平衡温度スキャン全体不耐熱リガンド濃度は一定全体にわたって各サーモグラムは、高温平衡期間中のみ減少します。私たちは以前この仮定がコカイン...

示差走査熱量測定 (DSC)、生体分子結合のケイ光と折り畳み式の相互作用1,2,3の強力な方法です。DSC の強みには、バインドとフォールディング機構を明らかにし、対応する熱力学的パラメーター2,3を生成する能力が含まれます。また、DSC は近く生理条件下でのソリューションで実行することができます、生体分子や配位子、例えばフルオロ、スピン ラベルまたは核同位元素4とラベルを必要としません。楽器スキャン温度、配位子の有無で、生体分子を変性するに必要な熱の量を測定します。結果サーモグラムを使用してプロセスを折り配位子を支配する熱力学的パラメーターを抽出します。DSC や他の熱力学的手法によって提供される情報は、ターゲット生体分子1,5,6,7,8医薬品の設計を指導に不可欠です。ただし、高温に繰返しスキャン (〜 60-100 ° C) 問題が発生することができます。たとえば、多くの調剤上重要な化合物を受ける転位又は高温9,10,11,すなわちへの持続的な露出に分解、不耐熱。DSC による相互作用を通常結合の検討は、熱力学的解析12サーモグラムの再現性を確認するために複数の前方および逆のスキャンを必要とします。初期配位子の変更の結合特性を持つセカンダリ形式への変換熱が初期のリガンドの濃度低下しながら各スキャン形状と連続サーモグラムの位置で顕著な違いにつながる、熱変換製品を蓄積します。これらのデータセットは、伝統的な解析に適しておりません。
我々 は最近不耐熱リガンド DSC データセットの生体分子の折りたたみを支配する、バインドに参照される単一のリガンド結合実験からの相互作用の熱力学的パラメーターの完全なセットを生成するグローバル継ぎ手方式を開発した、無料生体分子4の必要なサーモグラムは。分析低減実験時間とサンプルに必要な 〜 10 倍標準的な DSC 手法に比べて。占めているサーモグラムはリガンドの濃度に依存しない各スキャンの高温部分の間に配位子のこれを仮定することにより熱の変換が行われます。したがって、配位子濃度は熱力学的パラメーターを抽出するために使用するサーモグラムの部分内にある定数です。私たちはさらに高温平衡期間が長く 1 つの補足実験を実行することによって配位子の熱変換の速度定数の取得方法を示した。配位子の温度差が少ない温度依存性システム (すなわち、すべての温度でかなり発生している)、分析は変数リガンド濃度を含めるように変更することができます。ここで我々 は急速に高温で benzoylecgonine に変換する不耐熱リガンド コカインの存在下で DNA アプタマー MN4 手順をデモンストレーション (> 60 の ° C)。これらの実験の温度で変換が行われない MN4 と連結されますので、キニーネはリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されます。不耐熱リガンド DSC データセットと降伏の折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的パラメーター変換プロセス解析の買収について述べる。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用脱イオン水</td><td>ミリポア</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2ミクロン滅菌シリンジフィルター</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ 0.5-1.0 kDaカットオフ</td><td>スペクトラムラボラトリ</td>ーズ <td>131048</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック DSC フランジキャップ</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNAアプタマー MN4</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>コカイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>キニーネ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III マイクロカロリメーター</td><td>TAインスツルメン</td>ツ <td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRunソフトウェア</td><td>TAインスツル</td>メンツ <td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyzeソフトウェア</td><td>TAインスツルメンツ</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 dsc プロファイルを測定

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

示差走査熱量測定 (DSC) は生体分子の折りたたみと結合の相互作用を支配する熱力学的パラメーターを定量化するための強力な手法です。この情報は、新しい医薬化合物のデザインに重要です。ただし、多くの医薬関連配位子 DSC 分析で使用される高温で化学的に安定はありません。したがって、熱量計セル内配位子と熱変換製品の濃度は常に変化のために結合相互作用を測定が困難します。ここでは、急速に折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的情報に変換プロセスを得るため不耐熱配位子と DSC を使用してプロトコルを提案します。我々 は MN4 不耐熱リガンド コカインに結合する DNA アプタマーを私たちの手法を適用しました。不耐熱リガンド変換の新しいグローバル フィット分析を使用すると、折りたたみとバインディング パラメーターの完全なセットは、DSC 実験のペアから取得されます。さらに、1 つだけ補足 DSC データセットと不耐熱リガンド変換の速度定数がられる場合があるを示す.生体分子、折り畳み式の低速、低速のバインディング、および不耐熱リガンドの急速な枯渇の不可逆的な集計を含むを特定およびいくつかのより複雑なシナリオのデータを分析するためのガイドラインが掲載されています。

不耐熱リガンド DSC の代表的なデータは、図 1のとおりです。位置および不耐熱リガンド ピークの高さ連続シフト ダウン非連結の生体分子の方不耐熱リガンドが各スキャン (図 1 a) で使い果たされるとします。無料変性プロファイルは、不耐熱リガンド変換 (図 1 b) のエンドポイントの参照として使用されます。MN4 キニーネにバインドのためのデータは、変換不耐熱リガンド (図 1 b) のネガティブ コントロールとして表示されます。最終不耐熱リガンド スキャンがわずかに高い移行中点と不耐熱リガンド変換製品 (benzoylecgonine) に MN4 に弱い親和性を示す非連結 MN4 基準ピーク高さあります。図 1にデータセットのグローバル分析で得られた熱力学的パラメーター...

折りたたみと結合差動スキャン熱量測定による不耐熱配位子との相互作用は生体分子の迅速な評価のためのプロトコルを提案します。

急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

本手法の全体的な目的は、熱不安定リガンドを用い、わずか2回の実験で、示差走査熱量測定（DSC）によって生体分子のフォールディングおよび結合相互作用を支配する熱力学的パラメータを抽出することです。この方法は、「生体分子と強結合阻害剤との相互作用を支配する熱力学的パラメータの相対的な大きさはどの程度か」といった、生体熱量測定およびドラッグデザイン分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、1回の実験でリガンドの完全なタイトレーションが行われるため、グローバルフィッティング解析から熱力学的パラメータを迅速に抽出できることです。まず、精製した生体分子をリガンド溶液に透析するためのバッファーを調製します。0.5～1.7 kilodaltonの分画分子量を持つ透析チューブを用いて、生体分子を少なくとも1リットルのバッファーに対して透析します。高品質なDSCデータを得るために最も重要な工程は、生体分子リガンドを目的のバッファーに対して透析することです。これにより、DSCデータにバッファーの不一致によるアーティファクトが生じないことが保証されます。ワーキングバッファーと呼ばれる最終バッファーを、あらかじめバッファーで十分に平衡化した0.2 µmフィルターでろ過します。リガンドを必要量量り取り、ろ過したワーキングバッファーに溶解させます。目的のリガンド濃度に必要な質量が小さすぎて正確に秤量できない場合は、高濃度のリガンドストック溶液を作成してください。バイオ分子ストック溶液を、ワーキングバッファーで十分に平衡化した0.2 µmフィルターでろ過します。その後、吸光度測定によりバイオ分子濃度を決定します。調製した生体分子およびリガンドは4 °Cの冷蔵庫で保存するか、生体分子およびリガンドが凍結に耐え、かつ長期保存が必要な場合は-20 °Cまたは-80 °Cで保存してください。差示走査熱量計（DSC）にロードする前に、卓上脱気装置を用いて緩衝液、生体分子およびリガンド溶液を脱気します。DSCから圧力ハンドルを緩めて取り外します。次に、ワーキングバッファーからシリコンチューブを伸ばし、リファレンスキャピラリーのフロントフランジに取り付けます。リファレンスフランジのリア側とサンプルフランジのフロント側を接続し、リファレンスキャピラリーとサンプルキャピラリーの間にブリッジを作成します。続いて、サンプルフランジのリア側にシリコンチューブを取り付け、真空ラインが接続された廃液フラスコまで繋げます。真空ラインをオンにし、200 millilitersのワーキングバッファーでDSCをフラッシュします。まず、約3～5 cmのシリコンチューブをリファレンスカピラリーフランジに取り付けます。次に、後方フランジのシリコンチューブに1 milliliterピペットチップを挿入します。ピペットでワーキングバッファーを0.8 milliliters分分注し、バッファーが入ったピペットチップを前方リファレンスフランジのシリコンチューブに挿入します。ピペットプランジャーをゆっくりと押し下げ、ワーキングバッファーを前方シリコンチューブ経由でリファレンスキャピラリーに通し、後方フランジに取り付けられたピペットチップまで送り込みます。ワーキングバッファーの液面が前方シリコンチューブの直上に達するまでプランジャーを押し下げ、その後、液面が後方シリコンチューブの直上に達するまでプランジャーを戻します。気泡を除去するため、リファレンスキャピラリー内でワーキングバッファーを繰り返し往復させます。次に、後方のピペットチップを人差し指で塞ぎ、後方および前方のピペットチップをゆっくりと引き上げ、シリコンチューブを装着したままリファレンスフランジから取り外します。前と同様に、サンプルキャピラリーにワーキングバッファーを充填します。後方のリファレンスサンプルフランジに黒色のプラスチックキャップを被せ、前方のフランジは uncovered のままにします。DSCにプレッシャーハンドルを取り付け、DSCソフトウェアを起動します。電源の読み取り値が安定した後、インターフェース上部の赤い上向き矢印をクリックして装置を加圧してください。DSCの電力は、装置の温度および圧力の読み取り値とともに、インターフェース右上のボックスに表示されます。画面左側の実験方法タブで、正方向および逆方向のスキャンを行い、DSCを作動緩衝液で平衡化させます。スキャンオプションで、DSCの実行と温度スキャンモードが選択されていることを確認してください。実験方法タブの下にある温度パラメータの挿入箇所で、加熱ボタンをクリックします。下限および上限の実験温度に1度および100度、走査速度に毎分1度、平衡時間に60秒を入力します。平衡時間の入力フィールドの下にあるAddSeriesボタンをクリックします。ポップアップウィンドウのステップ追加フィールドに2を入力し、Alternate Heating/Coolingチェックボックスをオンにします。OKをクリックします。追加されたスキャンがインターフェースの下部に表示されます。各スキャンのパラメータが希望通りであるか確認してください。インターフェース上部にある緑色の再生ボタンをクリックして、実験を開始します。任意のウィンドウに移動し、ポップアップウィンドウに実験の保存用ファイル名を入力します。実験方法タブの右側にあるデータタブをクリックして、実験の進行状況を確認してください。両方のキャピラリーにワーキングバッファーを充填してDSCを再ロードし、サンプルデータのベースライン減算のためのリファレンス実験を行ってください。適切な温度範囲にわたって、昇温・降温速度 1 °C/min、上部平衡時間を 120 秒として、複数回の正方向および逆方向のスキャンを収集します。インターフェースの下部にある以前のバッファー平衡スキャンを、個別にハイライトしてインターフェース中央右側の赤いXをクリックすることで削除します。[AddSeries] ボタンをクリックし、追加するステップ数に 20 を入力して [Alternate Heating/Cooling] ボックスにチェックを入れ、新しいスキャンを追加します。次に、「OK」をクリックし、前と同様に緑色の再生ボタンをクリックして実験を開始します。両方のキャピラリーに目的の濃度のリガンドを含むワーキングバッファーを用いてこれらの手順を繰り返し、リガンドの参照実験を行います。熱不安定変換の速度定数の算出に使用するため、2つの独立した実験データを収集します。遊離バイオ分子のデータセットについては、リファレンスキャピラリーにワーキングバッファーを、サンプルキャピラリーにワーキングバッファーで所望の濃度に調製した遊離バイオ分子を入れていることを確認してください。次に、リファレンススキャンで使用したものと同じDSCロード手順および実験パラメータを用いて、サンプル実験を行います。リガンド結合実験については、リファレンスキャピラリーにワーキングバッファー中のリガンドを、サンプルキャピラリーにワーキングバッファー中のバイオ分子とリガンドを入れていることを確認してください。前述と同様に、異なるリガンドを添加する間にシステムをフラッシュします。生体分子に熱不安定リガンドを結合させた状態で、高温平衡時間を600秒に延長し、その他の実験パラメータはすべて前と同じ条件で、もう1回追加の実験を行います。テキストプロトコルに記載されている通り、データの処理および解析に進みます。熱不安定リガンド結合ピークの位置と高さは、スキャンごとに熱不安定リガンドが減少するにつれて、未結合分子のピークに向かって順次シフトします。3D成熟プロファイルは、熱不安定リガンド変換の終点の基準として用いられます。高温平衡時間を長くすると、短い平衡時間のデータセットと比較して、スキャンごとの熱不安定リガンド濃度の減少がより顕著になります。2つのデータセットから得られた最適化済みのグローバルフィット濃度パラメータを用いて、高温平衡状態におけるリガンド変換の速度定数を算出できます。この手法に習熟すれば、適切に実施することで72時間以内に完了させることが可能です。本手順を行う際は、データにアーティファクトが生じるのを防ぐため、ロード用ピペットを用いてDSCキャピラリー内の気泡を排除し、生体分子リガンドもしっかりと脱気させることが重要です。このビデオを視聴し、記事を読むことで、生体分子のDSC実験の実施方法、および折り畳みや結合相互作用を支配する熱力学的パラメータを迅速に抽出するためのグローバルフィッティング解析の実装について、十分に理解できるはずです。この手法は平衡状態における折り畳み・結合相互作用への知見を提供しますが、緩やかな折り畳みやリガンド結合キネティクスを示す生体分子などの他の系にも適用可能です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

中程度の結合親和性と生物系のための結合熱力学を監視するために等温滴定熱量計を使用するための一般的なプロトコルが表示されます。...

高分子 - リガンド親和性を測定するための等温滴定カロリメトリー

このビデオでは、生体分子とリガンドの相互作用を研究する手法である示差走査熱量測定を実演しています。DNAアプタマーと熱不安定性リガンドの結合は、サンプルに加熱と冷却のサイクルを繰り返し適用し、熱力学分析のためのスキャンを取得することによって研究されます。...

DNAアプタマー-熱不安定性リガンド相互作用を研究するための示差走査熱量測定

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。...

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

示差走査蛍光法は、タンパク質との相互作用について低分子のライブラリをスクリーニングするために広く使用されている方法です。ここでは、これらの分析を拡張して、低分子とそのタンパク質パートナーとの間の解離定数を推定する簡単な方法を紹介します。...

示差走査蛍光光度を用いたタンパク質 - リガンド相互作用の定量

示差走査熱量測定は、タンパク質を変性させるのに必要な熱転移温度（S）との総熱エネルギーを測定します。得られた結果は、ワクチン製剤中のタンパク質抗原の熱安定性を評価するために使用されます。...

示差走査熱量測定 - タンパク質抗原の熱安定性および立体配座を評価するための方法

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST)...

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

マイクロスケール熱泳動は、低い材料コストで結合定数を迅速に取得します。標識または標識フリーマイクロスケール熱泳動のいずれかが市販されている;しかしながら、標識フリーの熱泳動は、蛍光標識を用いて行うことができる多様な相互作用測定が可能ではない。当社は、標識熱泳動測定のためのプロトコルを提供しています。...

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

標的タンパク質の溶融温度の変化をモニタリングする(すなわち、熱シフトアッセイ、TSA)は、数百化合物の断片ライブラリーをスクリーニングするための効率的な方法である。フラグメントスクリーニング用の固有トリプトファン蛍光と光逆散乱をモニタリングするためのロボット工学支援ナノ微分走査蛍光測定(nano-DSF)を実装するTSAプロトコルを発表する。...

フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー

このプロトコールは、化合物とタンパク質分子との間の結合を検出するための独自の方法を説明しており、タンパク質サンプルの損失を最小限に抑え、高いデータ精度という利点を提供します。...

示差走査蛍光法によるCD40タンパク質-ウンベリフェロン相互作用の検出

ここでは、低分子の目的のタンパク質への結合を調査するために使用されるハイスループットの蛍光ベースの手法であるサーマルシフトアッセイを紹介します。...

サーマルシフトアッセイによるセレノプロテインOへの基質結合のプローブ

学ぶDSCを用いた生体分子の折りたたみと結合相互作用の熱力学的パラメーター抽出法。不耐熱配位子を活用し、わずか2回の実験で迅速にデータを取得し、バイオカロリメトリーと創薬研究に貢献します。

急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定

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