Name: 線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ 線虫Caenorhabditis elegansの集団ベース化学感覚嗜好アッセイの自動解析手法。複数カメラ映像取得システムと自動解析ソフトウェアを用いて、可溶性化合物への応答を定量化し、神経生物学研究を効率化します。

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いくつかの株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs（P40 OD010440）の資金提供を受けているCaenorhabditis Genetics Center（CGC）によって提供された。この作業は、PWSが調査者であるHoward Hughes Medical Instituteによってサポートされています。

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+taste+bitter%3A+ASH+neurons%2C+QUI-1%2C+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHE-3%2C+a+cytosolic+dynein+heavy+chain%2C+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li>
<li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li>
<li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210(2013).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li>
<li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genetic+and+cellular+analysis+of+modulated+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%22">Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans</a>. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parallel+worm+tracker%3A+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルの重要なステップは、アッセイプレートが異なる実験日間にわたって一貫したレベルの乾燥度を有することを保証することである。乾燥レベルが異なると、溶液の寒天への拡散速度が異なり、結果として行動結果が変化する。したがって、アッセイプレートは実験前に常に午後に新鮮にしなければならない。アッセイ間の比較を容易にするために、アッセイごとに試験したワームの数もまた規制しなければならない。上記ウォーム同期プロトコルは17に従っている場合、参照のために、野生型のワームは、アッセイ当たりの平均得&gt; 360のワームに4-10個の卵/時間を産みます。特定の突然変異系統が産卵欠損である場合、産卵のためにより多くの妊娠した成虫の虫を拾い、子孫の標的数に達するようにする。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、洗浄プロセスとワームの配置中にワームを静かに処理することです。ワームは機械的刺激に敏感で、ストレス反応を誘発する<html>逆転と産卵阻害18 。さらに、ROIを正確に定義し、ビデオ解析を進める前に、特定の照明条件に対する最適な閾値設定定数を決定するように注意する必要があります。また、最後の実験が実行されてから長い時間が経過した場合には、較正としきい値処理のプロセスを繰り返すことをお勧めします。 この方法の限界は、小さなワーム集団をアッセイするのには適していないということである。しかし、食べ物の存在が感覚行動に及ぼす影響を決定するための適切なコントロールが行われた場合、食物を利用して保持アッセイと同様にワームの空間的探索位置を制限することも可能である。加えて、この方法は、接近しているために刺激勾配ナビゲーションを研究するためのものではなく、少量の対照溶液および実験的溶液滴を使用した。 マルチワームトラッキングとシングルワーム特徴抽出を可能にし、将来においてe_content &quot;&gt;、プログラミングソフトウェアは、このシステム19、20に組み込むことができる。そのような逆転速度と提供する本体屈曲部の振幅のような単一のワームの動作の微妙な挙動パラメータを記録します適切なゲージサイズのシリンジ針を使用してROIを穴を開けることによって慣らしを研究し、穴を寒天注入して慣らしを調べることによって、習慣を研究するためにアッセイを改変することもできるこの方法の別の潜在的な応用は、異なる線虫種に亘って比較行動研究を行うことである。さらに、行動チャンバマルチモーダル刺激に対する行動反応を研究するために複数の方法で修正することができる。オプトジェネティックアプリケーションでは、アッセイ中に目的のニューロンを選択的に活性化するために、高輝度LEDアレイをカメラマウントの隣に取り付けることができます。加熱素子、冷却システム、および温度センサを設定に追加して、感温性の挙動に対する温度の影響を調べることもできます。さらに、臭気送達システムを室内に設置して、臭気感受性モダリティと化学感覚様式との間の相互作用を調べることができる。

飼育動物は、複数の感覚様式からのインプットを統合し、環境をうまく乗り越えるためには適切な行動戦略を選択する必要があります。外部の感覚入力がどのように受け入れられ、行動選択を導くために神経情報に変換されるのかを理解することは、神経生物学の分野における中心的な目標である。遺伝的に扱いやすい線虫C. elegansは、感覚生物学およびマルチモーダル統合の基礎となる神経メカニズムを研究する魅力的なモデル生物である。 C.エレガンスは、唯一302ニューロンを有しているが、これは検出および可溶性化合物、揮発性臭気物質、周囲温度1、2、3、4、5、6、7を含む環境刺激の多種多様を区別することができます。ザ線虫C. elegansは、食物源を特定し、潜在的な脅威に気づくために、その化学感覚装置に大きく依存する。したがって、野生型および変異体C.エレガンスの化学刺激に対する応答をスクリーニングするように設計された行動アッセイは、 C.エレガンスの顕著な感覚能力の基礎となる遺伝的、細胞性および神経系の解剖において重要な役割を果たす。 可溶性化合物に対する応答をアッセイするために、液滴試験、走化性アッセイ、および保持アッセイの3つのタイプのアッセイが記載されている。落下試験では、化合物の小滴を動くワームの尾に置き、液体が前の知覚装置に到達したら前進または後退するというワームの決定が得られます4 。落下試験はほとんど実験的な準備を必要とせず、レーザー作動ワームの場合のように、ワームのサンプルサイズが小さい場合に有用である。しかし、1つのワーム一度にアッセイすることができ、実験期間中、実験者が存在しなければならない場合、落下試験には時間がかかることがある。ドロップテストは、サンプル内の各ワーム間のドロップデリバリーの変動にも脆弱であり、これはアッセイの全体的な結果に影響する可能性があります。落下試験のもう一つの制限は、ワームの前方への移動からの魅力的または中立的な効果を区別することが不可能であるため、嫌悪化合物に対するワームの反応をアッセイするためにしか使用できないことである。 可溶性化合物のための走化性アッセイは、一般に、2つの対向する象限の寒天および他の2つの象限8,9に混入対照溶液に混合実験溶液で、4つの象限に寒天プレートを分割することを含みます。アッセイの開始時に、ワームを含む緩衝液の一滴をプレートの中央に置き、ワームの数を<html>各象限は、異なる時点で採点される。走化性アッセイは、各アッセイにおいて多数のワームが試験されるため、落下試験と比較してより大きな統計力を提供する。しかしながら、この方法の1つの限界は、走化性アッセイプレートの調製が大量の実験化合物を必要とすることである。これは、アスカロシドシグナル伝達分子10の場合のように、興味のある化合物を得るために収率が限られた複雑な精製プロセスが必要な場合、大規模な挙動スクリーンを行うことを困難にする。さらに、アッセイ中のワームの手動カウントはエラーの影響を受けやすく、カウントプロセス中のプレートの摂動が結果に影響を与える可能性があります。 前述の2つの方法とは異なり、保持アッセイは、スコアリングプロセス中の誤差を最小にし、アッセイ中の実験者の干渉を減少させる機械視覚を利用する<html> &gt; 11。ワームの行動のビデオ記録のコンピュータ化された分析はまた、スコアリングがいくつかの離散的な時点でのみ行われるときに失われる微妙な行動の力学を潜在的に明らかにする可能性がある。保持アッセイでは、2つの溶液スポットが小さな円形の細菌性食品パッチの反対側に加えられ、続いて少数のワームが食品パッチの中央に配置される。次に、ワームの挙動が記録され、分析され、各解決領域内のワームピクセルの総数に基づいて嗜好指標値が計算される。魅力的な食品パッチが存在すると、各アッセイで使用されるワームの個体数がより少なくなる可能性がありますが、食べ物は以前は可溶性忌避剤12への回避行動を感作することが示されていました12 。さらに、ワームは、短波長の光に対して光敏感応答を示し、挙動記録設定において白色光を放射する顕微鏡光源の使用は、挙動に影響を及ぼす可能性があるs = &quot;xref&quot;&gt; 13。 この記事で論じる方法の目的は、集団ベースのアッセイを用いた可溶性化合物のC.エレガンスの選好を記録および分析することである。このために、現在の方法は、前述の3つの方法すべてからの態様を統合し、改善する。これは、ワームの大集団を検査することを可能にし、各アッセイで使用される実験溶液の少量のみを必要とする。さらに、アッセイは赤外LEDバックライトを備えた特注の密閉型動作チャンバー内で行われ、短波長光の影響を最小限に抑えます。各チャンバには、複数の顕微鏡カメラを装備することもでき、ベンチスペースを損なうことなく実験のスループットを向上させます。最後に、ビデオ分析ソフトウェアは、各ビデオの嗜好指数値および付随するワーム占有率プロットを出力して、時間の経過とともに人口行動のダイナミクスを視覚化する。チャンバーのセットアップとassayプロトコルは、臭気物質または化学感覚挙動の温度の影響などの多峰性挙動応答を研究するためにさらに修飾することができる。 この記事では、行動チャンバの構築とアッセイプロトコルについて説明します。また、野生型ワームおよび化学感覚欠損突然変異体の既知の可溶性忌避物質銅イオンに対する反応をアッセイする際のこの方法の有用性も実証している4 。最後に、提供されたソフトウェアを使用したビデオ解析プロセスについて詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>アルミTスロットフレーミング押出成形</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>シングルプロファイル、1インチサイズ、ソリッド</td></tr><tr><td>ブラケット</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1インチ、1インチ、1インチ、高シングルプロファイル押出成形</td></tr><tr><td>コンパクトエンドフィードファスナー</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1インチ(シングル)、4ツ</td></tr><tr><td>イストインソリッドパネルホルダー</td>のパック <td>マクマスターカー</td><td>47065T251</td><td>1インチ高押出</td></tr><tr><td>プラスチックエンドキャップ</td>用 <td>マクマスターカー47065T91</td><td></td><td>1インチ高押出</td></tr>用<tr><td>光学的に透明なキャストアクリルシート</td><td>マクマスターカー8560K211</td><td></td><td>3/16インチ厚、12インチ x 12インチ</td></tr><tr><td>ビニールコーティングポリエステル生地</td><td>マクマスターカー88505K57</td><td></td><td>0.027インチ厚、61インチ幅、黒</td></tr><tr><td>真鍮グロメット</td><td>McMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>取引サイズ 0、0.545インチ外径</td></tr><tr><td>スチールワッシャー</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>1/4インチ ネジサイズ</td></tr><tr><td>丸みを帯びたヘッドネジ</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>1/4インチ - 20 スレッドサイズ、1 - 1/2インチ</td></tr><tr><td>標準動作バックライト</td><td>スマートビジョンライト</td><td>地元のベンダーを参照してください</td><td>8インチ x 8インチ、赤外線 850 nm</td></tr><tr><td>IVP-C1可変制御ポット</td><td>スマートビジョンライト</td><td>地元のベンダー</td><td></td></tr><tr><td>を見る T1電源</td><td>スマートビジョンライト</td><td>地元のベンダー</td><td></td>を見る</tr><tr><td>Dino lite Pro AM4113T</td><td>Dino-Lite デジタルマイクロスコープ</td><td>地元のベンダー</td><td></td>を見る</tr><tr><td>MS09B 顕微鏡スタンド</td><td>Dino-Liteデジタルマイクロスコープ</td><td>地元のベンダー</td><td></td>を見る</tr></tbody></table>

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

線虫であるCaenorhabditis elegansの唯一の302ニューロンのコンパクトな神経系は、様々な行動のレパートリーの基礎を成しています。これらの挙動の根底にある神経回路の解剖を容易にするために、頑強で再現性のある行動アッセイの開発が必要である。以前のC.エレガンスの行動研究では、可溶性化合物に対するC.エレガンスの応答を調べるために、「落下試験」、「走化性アッセイ」、および「保持アッセイ」のバリエーションを使用しています。この資料に記載されている方法は、前述の3つのアッセイの補完的な強みを組み合わせることを目指しています。簡潔には、各アッセイプレートの中央にある小さな円を、コントロールおよび実験溶液を交互に配置して4つの四分円に分割する。ワームを添加した後、アッセイプレートを行動チャンバに入れ、顕微鏡カメラがワームの遭遇を治療領域と記録する。次に、自動化されたビデオ分析が各ビデオの嗜好指数（PI）値が生成される。この方法のビデオ取得および自動解析機能は、実験者の関与および関連するエラーを最小限に抑える。さらに、アッセイごとに微量の実験化合物を使用し、行動チャンバのマルチカメラ設定は実験スループットを増加させる。この方法は、遺伝的突然変異体および新規化合物の行動スクリーンを実施するのに特に有用である。しかしながら、この方法は、対照および実験溶液領域が近接しているため、刺激勾配ナビゲーションの研究には適していない。また、少数のワームしか利用できない場合には使用しないでください。この方法は、現在の形態の可溶性化合物に対する応答のみをアッセイするのに適しているが、マルチモーダル感覚相互作用および光発生研究に適合するように容易に改変することができる。この方法は、他の線虫種の化学感覚応答をアッセイするためにも適用することができる。 </p&gt;

図3Aは、異なる遺伝子型および治療対において得られた嗜好指標値を示す。嗜好指数値1は、実験ROIに置かれた解に対する強い誘引力を示し、嗜好指数値-1は、強い反発力を示す。 M13緩衝溶液を対照ROIおよび実験ROIの両方に配置した場合、0.02の嗜好指数が得られ、いずれのROIに対しても空間的偏りがないことが実証された。 N2虫は銅イオンを強く避け、嗜好指数は-0.67であり、これは銅イオンが強力な忌避剤であるという以前の知見を裏付けている（ 補遺1 ） 4 。感覚繊毛の遠位部分の適切な形成を欠いているosm-3突然変異体は、銅イオン（PI = -0.19）の有意に減少した回避を示した15 。 ocr-2変異体は、de<html>銅回避を含む多くのASH仲介侵害受容応答において有害であり、銅イオン（PI = 0.19）に対する軽度の誘引も有意に減少した（ 補助映画2 ） 16 。 図3Bは、代表的なワーム占有率のプロットを示しています。これは、コントロール内のワームの密度と各ビデオの経時的な実験的ROIを示しています。描画領域の色が濃いほど、ROI内のワームピクセルの数が多くなります。 M13緩衝液対照で処理したN2虫の占有率プロットは、両方のROIにおける虫の数がアッセイを通して同様のままであることを示している。しかし、銅イオンで処理されたN2虫の占有率プロットは、ワームが、アッセイを通して試験ROIを強く一貫して回避することを示しています。 gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：行動室設計の写真と図式表現。 （ A ）挙動チャンバのセットアップの正面図（左）およびチャンバフレームの対応する概略図（右）。不透明なポリエステルシートは、底面を除くすべての面にチャンバを囲み、赤外線バックライトパネルからの光を通過させる。数字1,2および3は（B）の押出層に対応する。 （ B ）挙動チャンバフレームを構成する押出層の平面図。これには、最上層（1）、中間カメラマウントアセンブリ層（2）、および最下段層（3）が含まれる。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; 図2：ソリューション配置とプレート配置テンプレート （ A ）ソリューション配置テンプレートには、4つの象限と番号整列マーカーがあります。対照溶液を左上および右下象限に入れ、実験溶液を右上および左下の四分円に入れる。 （ B ）プレートアラインメントテンプレートは、ビデオ記録および分析中に視野内のワームの閉塞を最小限に抑えるための番号整列マーカーのみを有する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> 図3：このアッセイを使用して収集されたデータの例 （ A ）野生型N2および変異体C.エレガンス（C. elegans ）の優先順位指数（PI）値</e<html> M13緩衝液および10mM CuCl 2に応答してm&gt;。 N2虫は、M13対照溶液を両方のROIに入れたときに対照と実験ROIの間に優位性は示さなかったが、銅イオンが置かれたときに実験ROIを強く避けた（PI = 0.02および-0.67）。 osm-3（p802）突然変異体およびocr-2（ak47）突然変異体は、N2と比較して銅イオンの回避が有意に減少した（PI = -0.1および0.2）。各遺伝子型 - 治療ペアリングについてN = 6アッセイ、検定当たり360ワーム、エラーバーは±1SEM、***p &lt;0.001、一方向性ANOVA、ポストホックTukey Honestly Significant Difference（HSD）試験を示す。 （ B ）対照ROIにはM13バッファ、実験ROIには銅イオン（下）の両方のROI（上）およびN2ワームにM13バッファを有するN2ワームの代表的なワーム占有率プロット。各占有プロットの下のカラースケールは、ワームピクセルの数を表します。pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 補遺ムービー1：10mM塩化銅に対するN2虫の行動応答。ワームはM13バッファー（左上と右下）でコントロール四分円に引き付けられますが、M13バッファーに溶解した銅イオンを含む四分円（右上と左下）を強く避けます。ビデオは毎秒1フレームで記録され、15倍高速化されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> 補足ムービー2： 10mM塩化銅 に対する ocr-2（ak47） ワームの 行動応答 。ワームは、M13バッファー（左上と右下）とコントロール四分円の両方でおよそ等しい程度までローミングし、M13バッファー（右上と左下）に溶解した銅イオンを含有しています。突然変異体は、記録の開始時に銅イオンを含有する象限に対してわずかな選択性を示す。ビデオは毎秒1フレームで記録され、15倍高速化されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> 補足ファイル：ソリューション配置およびプレートアライメントテンプレート。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>

本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

この行動記録セットアップおよびプロトコルの全体的な目的は、マルチカメラビデオ取得システムとそれに続く自動ビデオ解析を用いて、水溶性化合物に対するC. elegansの個体群ベースの化学感覚好みを定量化することです。この手法は、遺伝子変異体の行動解析をより迅速かつ標準化して行うことを可能にし、C. elegansの神経生物学研究を促進できます。本技術の主な利点は、水溶性刺激に対する線虫個体群の反応の時間的ダイナミクスをモニタリングしながら、同一条件下で複数の反復試行を同時にアッセイできることです。行動チャンバーの組み立てについては、当研究室のスタッフサイエンティストであるChristopher Croninが実演します。まず、付随するテキストプロトコルに従い、ファブリックカバー、カメラマウントバー、コーナーブラケット、エクストルージョンバー、およびカメラマウントアセンブリを準備してください。センターバーにエンドバーを取り付けた状態で、カメラスタンドとホルスターをカメラマウントアセンブリに取り付けます。次に、行動チャンバーのフレームを組み立てます。まず、4本の1フィートのアルミ押し出し材を正方形のポリエステルシートに取り付けます。バーをファブリックシートの2つのTナットにスライドさせ、バーをファブリックの幅の中央に合わせて固定します。ファスナーを締めて、布シートを各バーに固定します。正方形のポリエステルシートを作業台の上に広げ、上に4本のアルミニウムバーを配置します。次に、4本のアルミニウムバーの上面の各端に、コーナーブラケットを1つずつ、計8個差し込みます。コーナーブラケットをバーの上に配置し、ブラケットの垂直脚をバーの端に合わせ、ネジをTナットに締め付けて固定します。各コーナーに1フィートのアルミニウム押し出し材を垂直に立て、2つのコーナーブラケットの脚にあるTナットに押し出し材を差し込みます。次に、ファスナーを締め付けて垂直バーを水平バーに固定し、隣接する2本の水平バーを接合します。H字型のカメラマウントアセンブリの緩いTナットを、フレームの支柱に沿って差し込みます。H字型パーツをそのまま下まで滑らせ、フレーム各コーナーのコーナーブラケットの上に載せます。4箇所のコーナーブラケットのネジを締め、カメラマウントアセンブリを固定します。次に、残り4本の1フィートのアルミ押出棒を使用して、チャンバーの底層を組み立てます。コーナーブラケットを配置し、ブラケットの脚を棒の端に合わせ、ネジを締めて固定します。その後、支柱のチャンネル内にある緩いTナットを用いて、棒をフレームの支柱の間に差し込みます。バーを配置し、コーナーブラケットの上端が支柱の開口端から1インチ下の位置に来るようにして、コーナーブラケットのネジを締め付けて固定します。次に、4枚の長方形ポリエステルシートのTナットを支柱押出棒の溝に沿って下にスライドさせ、チャンバーの側面を覆い、ファスナーを締めて固定します。チャンバー内部にアクセスするためのドアにする側を1面選び、チャンバー最下層にある2本のネジとTナットを取り除きます。完成したフレームの脚として機能させるため、各コーナーの上端にプラスチックキャップを取り付けます。フレームを正位置に戻し、フレームのスペース層の内側にスライドあたり2つのパネルホルダーを挿入し、ねじって固定します。次に、アッセイプレートを置くステージとするため、パネルホルダーの上に12 by 12 inchの透明アクリル板を設置します。最後に、付属のテキストプロトコルに従って、カメラとステージテンプレートを配置します。実験の前日に、28枚の空の35 mmプレートを、5枚以下の束にして平らな面に置きます。各アッセイプレートに5 mLの線虫成長培地アガロースを注入し、蓋を開けた状態で直立させ、室温で一晩乾燥させます。実験当日、バックライトを点灯させ、コンピュータを起動し、顕微鏡カメラのビデオキャプチャソフトウェアを立ち上げます。顕微鏡カメラをコンピュータに接続し、ソフトウェアウィンドウ上部にある番号付きのカメラサムネイルをクリックして、カメラのライブフィードを表示させます。ビデオ録画設定を調整するには、カメラフィードの左上にあるビデオフォーマットメニューをプルダウンし、MJPG 1280x1024を選択してください。次に、ビデオ形式メニューの隣にあるフォルダーメニューを展開し、ビデオファイルを保存するフォルダーを選択します。カメラフィードの右上隅にある自動露出アイコンをクリックし、自動露出をオフにします。その後、自動露出アイコンのすぐ右側にあるLEDアイコンをクリックして、顕微鏡カメラ内蔵のLEDをオフにします。隣の設定アイコンをクリックし、「モノクロ」を選択します。コントラストを最大にし、明るさを調整してください。ステージプレートのアライメントテンプレートの上に溶液配置テンプレートを合わせ、カメラフィードの左側にあるタイムラプスビデオ録画アイコンをクリックします。期間に5秒、間隔に1秒と入力し、1秒間に1フレームの割合で5秒間のキャリブレーションビデオを記録します。5 mLのガラスピペットを使用して、同期させた線虫のプレートに1.2 mLの線虫増殖培地バッファーを加え、プレートを軽く揺らして線虫をバッファー中に分散させます。プレートからバッファーをピペッティングで吸い上げ、バッファー中の線虫を清潔なマイクロ遠心チューブに移します。チューブを1〜2分間静置し、線虫を底に沈殿させます。次に、プラスチック製ピペットチップを使用して、チューブ底部の線虫の凝集ペレットを乱さないように、洗浄バッファーを可能な限り取り除きます。チューブに1 mLの清浄なnematode growth mediaバッファーを補充し、この洗浄操作をさらに2回繰り返します。次に、解剖顕微鏡のステージ上に溶液配置テンプレートをテープで固定します。続いて、プレートアライメントテンプレートの両側に両面テープを貼ります。アッセイプレートの外周をプレートアライメントテンプレートの円に合わせ、テンプレートがプレート底面に密着するまで押し付けます。次に、解剖顕微鏡上で、アッセイプレートテンプレートのマーカーを溶液配置テンプレートのマーカーに合わせて整列させます。続いて、P2ピペットを使用して、第1象限と第4象限にそれぞれ1 µLのM13緩衝液を分注します。新しいチップを使用して、第2象限と第3象限にそれぞれ1 µLの10 mM CuCl2溶液を分注します。溶液の滴がアガーに完全に吸収されたら、ガラスパステールピペットを使用して、洗浄した線虫をアッセイプレートに移します。円形の処理領域の上下に、線虫の滴を置きます。ティッシュを4回折り、鈍い端を用いてアッセイプレート上の余分な洗浄バッファーを吸収します。テンプレートのコーナーにある番号を合わせて、行動チャンバー内の顕微鏡カメラの下にアッセイプレートを直ちに配置します。線虫がアッセイプレートに順応するまで、2〜3分間待ちます。次に、カメラフィードの左側にあるタイムラプスビデオ録画アイコンをクリックし、録画時間を10分、間隔を1秒に設定して、1秒間に1フレームの10分間のビデオを録画します。最後に、「Start」をクリックしてビデオ録画を開始します。ビデオの各フレームにおいて、好みの指標関数が各関心領域内の線虫ピクセル数をカウントし、関心領域の全ピクセル数に対する1ピクセルの割合（パーセンテージ）を算出します。異なるジェノタイプと処理の組み合わせについて得られた好みの指標の値がここに示されています。正の嗜好性指数（preference index）は処理への誘引を示し、負の嗜好性指数は忌避を示します。コントロール領域と実験領域の両方にM13緩衝液を配置した場合、嗜好性指数は0.02となり、空間的なバイアスがないことが示されました。また、このグラフはN2線虫が銅イオンを強く忌避し、0.67の嗜好性指数となったことを示しています。さらに、感覚繊毛の形成に欠陥があるosm-3変異体およびASH介在性の侵害受容反応に欠陥があるocr-2変異体では、銅イオンに対する回避行動の減少、さらにはわずかな誘引さえも示されました。このプロトコルを実施する際は、迅速に、かつスムーズに一貫して作業することが重要です。この記録系およびアッセイプロトコルは、異なるC. elegansの感覚変異体間の相互作用から生じる集団ベースの行動反応を特性評価するために、容易に適合させることが可能です。

automated-analysis-nematode-population-based-chemosensory-preference

Research

JoVE Journal

Behavior

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線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

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