線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析
2017年7月13日
本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。
この行動記録のセットアップとプロトコルの全体的な目標は、マルチカメラビデオ取得システムを使用して、C Elegansの可溶性化合物に対する集団ベースの化学感覚の好みを定量化し、続いて自動ビデオ分析を行うことです。この方法は、遺伝的変異体のより迅速で標準化された行動解析を可能にすることにより、C Elegansの神経生物学研究を促進することができます。この手法の主な利点は、同じ条件下で複数の反復を同時に分析できると同時に、可溶性手がかりに対する線虫集団の応答の時間的ダイナミクスを監視できることです。
ビヘイビアチャンバーアセンブリをデモンストレーションするのは、この研究室のスタッフサイエンティストであるクリストファー・クローニンです。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているように、ファブリックカバー、カメラマウントバー、コーナーブラケット、押し出しバー、およびカメラマウントアセンブリを準備します。センターバーに取り付けられたエンドバーから始めて、カメラスタンドとホルスターをカメラマウントアセンブリに取り付けます。
次に、ビヘイビアチャンバーフレームを組み立てます。正方形のポリエステルシートに4本、1フィートの押し出しアルミニウムバーを取り付けることから始めます。1本のバーを生地シートのオムニの2つのTナットにスライドさせ、バーを生地の幅に沿って中央に配置します。
留め具を締めて、生地シートを各バーに固定します。正方形のポリエステルシートを作業面に広げ、4本の取り付けられたアルミニウムバーを上にします。次に、8つのコーナーブラケットを4本のアルミニウムバーの上面に滑り込ませます(各バーの両端に1つずつ)。
コーナーブラケットをバーに配置し、ブラケットの垂直脚をバーの端と同じ高さにして固定し、ネジをTナットに締めて所定の位置に固定します。各コーナーで、1フィートのアルミニウム押し出しを直立させ、押し出しを2つのコーナーブラケット脚のTナットに滑り込ませます。次に、留め具を締めて直立バーを水平バーに固定し、隣接する2本の水平バーを結合します。
H字型カメラマウントアセンブリの緩いTナットをフレームの支柱に滑り込ませます。Hを完全に滑り込ませて、フレームの各コーナーにあるコーナーブラケットの上に置きます。4つのコーナーブラケットネジを締めて、カメラマウントアセンブリを所定の位置に固定します。
次に、その最後の4つの1フィート押出アルミニウムバーを使用して、チャンバーの最下層を組み立てます。ブラケットの脚がバーの端と同じ高さになるようにコーナーブラケットを配置し、ネジを締めて所定の位置に固定します。次に、直立したチャネルに緩いTナットを付けて、フレームの支柱の間にバーを滑り込ませます。
コーナーブラケットの上端が支柱の開放端から1インチ下になるようにバーを配置し、コーナーブラケットのネジを締めて所定の位置に固定します。次に、4枚の長方形のポリエステルシートのTナットを直立した押し出しバーのチャネルにスライドさせてチャンバーの側面を覆い、留め具を締めて所定の位置に固定します。チャンバーの内部にアクセスするためのドアとして一方の側を選択し、チャンバーの最下層にある2つのネジとTナットを取り外します。
各コーナーの上端にプラスチック製のキャップを取り付けて、完成したフレームの足として機能します。フレームの右側を上にして、スライドごとに2つのパネルホルダーをフレームスペースレイヤーの内側に挿入し、ひねって所定の位置に固定します。次に、パネルホルダーの上に12 x 12インチの透明なアクリル片を置き、アッセイプレート用のステージを提供します。
最後に、カメラとステージテンプレートを、付属のテキストプロトコルで説明されているように配置します。実験の前日に、空の35mmプレートを28枚、平らな面に5枚以下で積み重ねて置きます。各アッセイプレートに5ミリリットルの線虫増殖培地寒天を充填し、アッセイプレートを蓋を外して直立させて乾燥させ、室温で一晩待ちます。
実験当日は、バックライトをONにし、パソコンを起動して、顕微鏡カメラの動画撮影ソフトを起動してください。顕微鏡カメラをコンピューターに接続し、ソフトウェアウィンドウの上部にある番号付きのカメラのサムネイルをクリックして、カメラのライブフィードを表示します。ビデオ録画の設定を調整するには、カメラフィードの左上隅にあるビデオフォーマットメニューをプルダウンし、MJPG 1280x1024を選択します。
次に、ビデオフォーマットメニューの横にあるフォルダメニューをプルダウンし、ビデオファイルを保存するフォルダを選択します。カメラフィードの右上隅にある自動露出アイコンをクリックし、自動露出をオフにします。次に、自動露出アイコンのすぐ右にあるLEDアイコンをクリックして、内蔵の顕微鏡カメラのLEDをオフにします。
隣接する設定のアイコンをクリックして、モノクロを選択します。コントラストを最大化し、明るさを調整します。ステージプレートの位置合わせテンプレートの上にソリューション配置テンプレートを位置合わせし、カメラフィードの左側にあるタイムラプスビデオ録画アイコンをクリックします。
デュレーションに 5 秒、インターバルに 1 秒を入力して、1 秒あたり 1 フレームで 5 秒のキャリブレーション ビデオを録画します。5ミリリットルのガラスピペットを使用して、1.2ミリリットルの線虫増殖培地バッファーを同期線虫のプレートに加え、プレートを穏やかに攪拌してワームをバッファーに置換します。プレートからバッファーをピペットで取り出し、バッファー中のワームを清潔なマイクロ遠心チューブに分注します。
チューブを1〜2分間放置して、ワームが底に落ち着くようにします。次に、プラスチック製のピペットチップを使用して、チューブの底にある凝集したワームのペレットを乱さずに、チューブからできるだけ多くの洗浄バッファーを取り除きます。チューブに1ミリリットルのきれいな線虫増殖培地緩衝液を補充し、洗浄手順をさらに2回繰り返します。
次に、解剖顕微鏡のステージの上に溶液配置テンプレートをテープで貼り付けます。次に、プレート位置合わせテンプレートの両側に両面テープのストリップを配置します。アッセイプレートの周囲をプレートアライメントテンプレートの円に合わせ、テンプレートがプレートの底部に付着するまで押し下げます。
次に、アッセイプレートテンプレートメンバーマーカーを解剖顕微鏡上の溶液配置テンプレートメンバーマーカーに位置合わせします。次に、P2ピペットを使用して、1マイクロリットルのM13バッファーをそれぞれ象限1と4に配置します。新しいチップを使用して、1マイクロリットルの10ミリモルCuCl2溶液をそれぞれ象限2と3に配置します。
ガラスパスツールピペットを使用して、溶液滴が寒天に完全に吸収されたら、洗浄した線虫をアッセイプレートに移します。円形処理領域の上下の領域にワームを一滴垂らします。組織を4回折り、鈍いエッジを使用してアッセイプレート上の余分な洗浄バッファーを吸収します。
アッセイプレートをビヘイビアチャンバー内の顕微鏡カメラの下に配置して、テンプレートコーナーの数を揃えます。2〜3分待って、線虫がアッセイプレートに順応するまで待ちます。次に、カメラフィードの左側にあるタイムラプスビデオ録画アイコンをクリックし、持続時間に10分、インターバルに1秒を入力して、1フレーム/秒の10分間のビデオを録画します。
最後に、[開始]をクリックしてビデオ録画を開始します。各ビデオ フレームについて、プリファレンス インデックス関数は、各関心領域内のワーム ピクセルの数をカウントし、関心領域内のピクセルの総数のうち 1 つのピクセルの割合を計算します。ここでは、さまざまな遺伝子型と治療の組み合わせについて得られた選好指数値を示します。
正の選好指数値は治療への魅力を示し、負の選好指数値は反発を示します。M13バッファー溶液を対照領域と実験対象領域の両方に置いた場合、0.02の選好指数が得られ、空間バイアスがないことが実証されました。このグラフは、N2線虫が銅イオンを強く避け、選好指数が0.67になったことも示しています。
さらに、感覚繊毛形成に欠陥のあるosm-3、およびASHを介した侵害受容反応に欠陥のあるocr-2変異体は、銅イオンに対する回避の減少と軽度の引力さえ示しました。このプロトコルを試行する際には、高速に作業するだけでなく、スムーズかつ一貫して作業することが重要です。記録セットアップとアッセイプロトコルは、異なるC Elegansの感覚品種間の相互作用から生じる集団ベースの行動反応を特徴付けるために容易に適合させることができます。
概要
本記事では、個体群ベースのアッセイにおいて線虫Caenorhabditis elegansを解析するための、行動記録セットアップおよびプロトコルを紹介します。行動チャンバーの構築、行動アッセイプロトコル、および自動解析のためのビデオ解析ソフトウェアの使用方法について詳しく解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 遺伝子変異体
背景
- C. elegansにおける化学感覚的な好みを理解することは、神経生物学への洞察を得るにつながります。
- 自動解析により、より迅速で標準化された行動評価が可能になります。
- 個体群ベースのアッセイにより、同一条件下で複数の反復試行をモニタリングできます。
- この手法は、可溶性刺激に対する時間的なダイナミクスの研究を強化します。
研究目的
- 可溶性化合物に対するC. elegansの化学感覚的な嗜好性を定量化すること。
- 行動解析技術の向上を通じて、神経生物学の研究を促進すること。
- 実験用行動チャンバーの組み立ておよび使用方法を実演すること。
使用方法
- アルミ押し出し材とポリエステルシートを用いた行動チャンバーの構築。
- 線虫の行動を記録するためのマルチカメラビデオ取得システム。
- 可溶性化合物に対する応答を定量化するための自動ビデオ解析。
- 実験用線虫増殖培地を用いたアッセイプレートの調製。
主な結果
- このセットアップにより、複数のレプリケートを同時にアッセイすることが可能です。
- 自動解析により、行動応答に関する一貫性と信頼性のあるデータが得られます。
- 本手法は、刺激に対するC. elegansの応答の時間的ダイナミクスを捉えます。
- 行動チャンバーの組み立てと操作が容易であることが実証されています。
結論
- このプロトコルは、C. elegansを用いた行動研究の効率を高めるものです。
- 自動ビデオ解析は、神経生物学研究において有用なツールとなります。
- 行動チャンバーの設計は、さまざまな実験セットアップに実用的です。
よくある質問
業界における重要性
本手法により、C. elegansにおける個体群レベルの化学感覚反応のハイスループットかつ標準化された定量化が可能となり、初期段階のターゲットバリデーションおよび表現型スクリーニングを支援します。ビデオキャプチャと解析を自動化することで、実験的なばらつきを抑え、遺伝子や化合物のスクリーニングキャンペーンにおけるスループットを向上させます。このアプローチは定量的な好みの指数（PI）を出力するため、神経活性ターゲットのメカニズム的なリスク低減や、リード化合物同定における予測信頼性の向上に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：好みの指標（preference index）の測定により、可溶性化合物に対する誘引または忌避を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：遺伝子と化合物の相互作用を明らかにする、再現性のある集団ベースの行動リードアウトを通じて、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 予測的価値：忌避または誘引の表現型に基づいて活性化合物と不活性化合物を区別し、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）に寄与する定量的なデータを生成する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備性： マルチウェルプレート形式および自動イメージングシステムに対応した、標準化され再現可能な行動アッセイを実現します。
- スケーラビリティ： 同一条件下で複数の繰り返し試行を同時にアッセイできるため、変異体ライブラリや化合物コレクションのスクリーニングスループットを向上させます。
- 出力の標準化： ヒット選択や用量反応モデリングに適した、定量的かつ正規化された読み取り値として好みの指数（PI）値を算出します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 線虫種間で保存されている化学感覚経路の研究を促進し、種をまたいだターゲットのバリデーションをサポートします。
- トランスレーショナルな連続性： 感覚処理に関連する遺伝子変異体の表現型スクリーニングを可能にし、神経疾患のメカニズムモデルに情報を提供します。
- 予測的なリスク低減： 集団反応の時間的ダイナミクスを捉えることで、急性行動と適応行動の区別を容易にし、リード最適化における偽陽性を減少させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、遺伝的な摂動と化合物の応答を橋渡しする定量的な行動表現型を提供することで、初期の創薬ワークフローに統合され、標準化されたマルチプレックススクリーニングを通じてリード化合物の同定を支援します。
- 探索生物学：可溶性刺激に対する集団レベルの回避または誘引を測定することにより、化学感覚における遺伝子機能の仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：自動ビデオ解析を通じてアッセイの標準化と再現性を実現し、オペレーターによるバイアスを最小限に抑えてデータの信頼性を向上させます。
- 分析：定量的な出力として嗜好性指数（PI）値を算出し、遺伝子型、処理、および時点間での比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：感覚遺伝子の変異体と変化した化学感覚応答を関連付けることで、遺伝子の発見から表現型の検証までの連続性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：モジュール設計と自動読み取りにより、複数のプロジェクトにわたって遺伝子変異体や化合物ライブラリをスクリーニングするための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：定量的かつ集団ベースの行動表現型解析を通じてメカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：自動ビデオ解析とマルチカメラの並列化により、再現性と拡張性を向上させ、実作業時間および実験間のばらつきを低減する。
- 戦略的価値：明確で定量化可能な表現型リードアウトを提供することで、ターゲットエンゲージメント不足による後期的脱落を減らし、リード同定におけるgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：堅牢でハイスループットな行動スクリーニングデータに基づき、化合物および遺伝的ターゲットのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- C. elegansの取り扱い、行動アッセイの設計、および基本的なビデオ解析ソフトウェアの操作に関する専門知識が必要です。
- マルチカメラ顕微鏡セットアップ、環境制御チャンバー、および選好指数算出のための画像解析パイプラインに依存します。
- アッセイの実行間での一貫性を確保するため、線虫の調製、播種密度、および馴化時間の標準化が必要です。
- 他の線虫種や感覚様式に適応させる場合、アリーナの設計、刺激の提示方法、またはトラッキングパラメータの調整が必要になることがあります。
- 空間的な制約および個体数に依存する読み取り値のため、濃度勾配における化学走性の研究や、線虫数が非常に少ないアッセイには適していません。
