Name: 原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法で、タンパク質の機械的特性と展開経路を測定する手法です。定速度測定によりタンパク質安定性と展開速度を解析し、分子生物学の理解を深めます。

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この作品は、全米科学財団助成金 MCB 1244297 と PEM に MCB 1517245 によって支持されました。

1. 蛋白質の準備
<ol><li>DNA のクローニング。<ol>
<li>興味、例えば NI10C10、DNA シーケンスの DNA シーケンスの合成または経由でPCR 標準分子生物学技術11を使用してホストの有機体から分離します。合成中にまたは (Addgene #74888)12プラスミド pEMI91 のモジュールに対応する PCR プライマーの 5' 末端にサイトを配置することによって、制限のサイトと興味の遺伝子を逃げ。</li>
		<li>別にプラスミド pEMI9112と制限のサイトのペアを持つ興味の DNA シーケンスの両方は、タンデム I91 を繰り返します (図 1参照) で両側の興味のシーケンスになりますのでダイジェストします。制限のサイトの標準的なプロトコルに従います。</li>
		<li>ゲル電気泳動を使用して消化、製品を浄化し、T4 DNA リガーゼ、次の標準的なプロトコルを使用している製品を縛る。結紮、プラスミッドの浄化のためのエシェリヒア属大腸菌のセルにプラスミッドを変換し、標準的なプロトコルを使用してプラスミッドの浄化します。T7 プライマーまたは内部 pEMI91 プライマーを使用して、シーケンスが正常に変換を確認するシーケンス。</li>
	</ol>
</li>
	<li>変換です。<ol>
<li>C41 などのタンパク質発現細胞を削除 (DE3) pLysS 細胞、-80 ° C のフリーザー アイスで完全に雪解けから。</li>
		<li>セルに DNA のプラスミッドの 1 μ L を追加し、簡単にかき混ぜるそれは気泡を導入し、細胞を温めると、上下にピペッティングは勧められません。</li>
		<li>セルと 30 分間氷の上プラスミドを含む培養管を孵化させなさい。</li>
		<li>熱衝撃 45 42 ° C の水浴中で細胞 s。</li>
		<li>2 分間氷にチューブを返します。</li>
		<li>セル内流体培養基 LB の 950 μ L を置き、37 ° C で 1 時間 250 rpm で振る</li>
		<li>100 μ g/mL アンピシリン含有 LB プレートに変換の約 200 μ L を配置します。PEMI91 以外のプラスミドを使用している場合は、そのプラスミッドのため適切な抗生物質を使用します。37 ° C でインキュベーターで一晩プレートを配置します。次の日、インキュベーターから削除板パラフィルム、ラップし、ストア冷凍 1 ヶ月。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛋白質の表現。<ol>
<li>プレートに単一の細菌のコロニーを滅菌ピペット チップを触れると、LB の上下にピペッティングで一晩成長 37 ° C で 50 mL のチューブに 100 μ g/mL アンピシリンと LB ブイヨン培地 15 mL を接種します。</li>
		<li>100 μ g/mL アンピシリンと LB ブイヨン培地 1 L に 15 mL 文化を転送し、37 ° C で 4-12 h に振る (まで外径600 > 0.8)。</li>
		<li>プラスミッドの準備の文化の 10 mL を収集します。</li>
		<li>0.2-1 mM イソプロピル-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、一晩式室温に温度を下げます。</li>
		<li>次の日 4 本のチューブに分割し、40 分間 4,000 × gで遠心分離によって細胞を収穫し、数時間-80 ° C でペレットを凍結します。</li>
		<li>タンパク質12の挿入されたカセットに対応するプライマー配列の細胞から抽出したプラスミドを送信し、挿入 DNA の忠実度を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛋白質の浄化。<ol>
<li>室温で 30 分間凍結細胞の 1 つの管を解凍します。</li>
		<li>解凍細胞換散バッファー (38 mL の水、グリセリン、50 mM トリス塩酸 pH 7.6, 150 mM の NaCl、1 mM の CaCl2、10 μ g/mL DNase、1 mM PMSF、1 mM TCEP、500 μ G/ml リゾチーム 2 mL) を中断し、1 時間氷の上を振る。</li>
		<li>いくつかの時間-80 ° C で分離細胞を凍結し、再室温で解凍。</li>
		<li>4 ° C で 30 分間 13,100 × gでダウン ライセート スピンします。</li>
		<li>特定のタグ (例えば、連鎖球菌タグまたはタグ) の重力流列を上清を実行します。</li>
		<li>連鎖球菌性タグまたはタグと使用前に 4 ° C でストアの適切なバッファーを用いた遠心フィルターを使用してバッファー交換を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプル準備のためをスライドします。
<ol><li>ピラニア溶液を用いたガラス スライドを準備します。<ol>
<li>場所 10-30 個の 40 mL ガラス製ビーカーにガラス カバー スリップ (半径 7.5 mm) のラウンドします。 注:フードでは、この手順と次の手順を実行します。このステップの間に危険な化学物質に対処するための標準的な手順に従います。</li>
		<li>(18.4 M) の濃硫酸 30 mL を追加します。</li>
		<li>30% 過酸化水素の 10 mL を追加します。</li>
		<li>95 ° C に 10-30 分のための混合物を熱します。</li>
		<li>(再使用または破棄) を別の廃棄物容器にデカント ピラニア ソリューションが慎重に。</li>
		<li>ピラニア ソリューションを削除する脱イオン水でスライドをすすいでください。</li>
		<li>40 mL のアセトンにスライドを中断します。</li>
		<li>廃棄物容器にアセトンを捨て、再 40 mL のエタノールにスライドを停止します。</li>
		<li>慎重に、時に 1 つのスライドを抽出し、アルゴンまたは浄化された空気と乾燥きれいな鉗子を使用します。</li>
		<li>場所きれいな、乾燥したスライド金蒸着まで真空下でまたは長期保管のためのアルゴン中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(省略可能) ゴールド コーティング スライドを準備します。 注:この手順には、主要な大学で多くのクリーン ルーム設備で利用できる真空 (電子ビーム) 蒸発器の使用が必要です。<ol>
<li>5 つの顕微鏡スライド (25 mm × 75 mm の長方形) を glasscutter を使用して半分にカットします。</li>
		<li>それぞれの 10 の中央に両面粘着テープを適用半分顕微鏡スライド。</li>
		<li>付箋の粘着面をカットし、両面テープに適用されるように、メモの粘着面です。付箋は、一般的に以下の接着剤はまだしっかりと将来の破損を防ぐためにスライドに添付します。その後、それらの半分の顕微鏡スライド ガラス スライド ホルダーとして処理できます。</li>
		<li>ホルダーの粘着面の各コーナーに (セクション 2.1.10) から 4 つのきれいなガラス スライドを慎重に押します。</li>
		<li>電子ビーム蒸発器にガラス スライドを移動します。70 を適用する蒸発器の仕様に従うクロムと 300 nm の表面に金の nm。</li>
		<li>アルゴン中ゴールド コーティング スライドを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプル準備
<ol><li>
スライドを準備します。
	<ol>
<li>きれいな鉄のディスク (直径 15 mm) を選択し、粘着タブを添付します。</li>
		<li>粘着タブのカバー作品の品をはずします。</li>
		<li>(セクション 2.1.10) からきれいなガラスまたは (セクション 2.2.7) から金の一部を選択、しっかりと鉄のディスクの粘着面に配置このサンプル スライドになります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スライド上にタンパク質を沈殿物します。<ol>
<li>ポリプロテインを dialyze 実験 (25 mM トリス-HCl、150 mM の NaCl と pH 7.6) のバッファーにバッファー交換カラム 0.5 mL 遠心フィルターなどを用いるします。13,000 rpm で 10 分間の列でタンパク質をスピン列を逆にし、2 分間 1,000 rpm で回転して新しいバッファーにタンパク質を溶出します。</li>
		<li>280 で吸光度を測定することによりおおよそのタンパク質濃度を決定する nm、分光光度計を使用しています。</li>
		<li>10-100 μ g/ml 100 μ L の最終巻にタンパク質を希釈します。</li>
		<li>スライドの中央にタンパク質溶液の 60 μ L を適用します。これは実験と制御されていないサンプルの動きの間に接着剤の膨張を引き起こす可能性がある任意の液体ガラスと鉄スライド間のギャップに下入力をさせないこの段階でつけてください。 注:ゴールドのスライド、疎水性の球状液滴を形成、スライド ガラスは親水性、タンパク質溶液が広がる可能性があります。</li>
		<li>10-60 分間室温で放置サンプルを聞かせてください。この間、原子間力顕微鏡のセットアップを開始する次の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 原子間力顕微鏡 (AFM) セットアップ
注:以下は、原子間力顕微鏡をセットアップするための一般的な説明およびある特定の細部が使用特定の機器によって異なる場合があります。器械使用は部分的に家造られた、ショル13で詳細に記述されています。
<ol><li>原子間力顕微鏡セルにカンチレバーをマウントします。<ol>
<li>アプリケーションの適切なプロパティを持つ片持梁を選択します。使用は 4-10 pN/nm 低展開力のバネ定数とカンチレバー (10 〜 50 pN)、バネ定数と使用のカンチレバー 15 100 pN/nm 高い展開力の。</li>
		<li>慎重に端から片持ち梁をピックアップし、セルを保持するプローブに配置。</li>
		<li>場所でしっかりと保持細胞は、カンチレバーを保持続行する前に確認してください。</li>
		<li>レーザーの配置のための AFM ヘッドに保持セルを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>AFM ヘッドにレーザーを合わせます。<ol>
<li>倒立顕微鏡上に頭を置き、頭にレーザーを駆動するための AFM ヘッドにバッテリー パックを接続します。</li>
		<li>顕微鏡検出器にカメラを接続して、テレビまたはモニターの上にレーザー光を視覚化できます。</li>
		<li>カンチレバーの先端にあるので、レーザーを位置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル ヘッドをマウントします。<ol>
<li>各セルを保持するプローブのポートに 10 μ L のバッファーをフラッシュします。</li>
		<li>培養されているサンプルのスライドと培養液からの流体の 40 μ L をデカントします。スライド上のバッファーの 40 μ L を追加します。上記の圧電磁石にサンプル スライドを配置します。</li>
		<li>原子間力顕微鏡ステージが高い位置にあることを確認します。AFM カンチレバーがサンプル液滴になるので、ステージ上に AFM ヘッドを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>センター フォト ダイオード上に反映されたレーザー ビーム。<ol>
<li>紙の小片をカットし、AFM フォト ダイオードの前に置きます。</li>
		<li>ノブを使用して用紙にレーザー スポットになる集中的かつ明るい原子間力顕微鏡レーザーの位置を変更します。</li>
		<li>レーザーがゼロ (A + B ・ C ・ D) を 2 つの領域をヒットすべての象限 (A + B + C + D) で全信号を最大にするフォト ダイオードと上の 2 つの間の差信号を発生上下ように AFM ヘッド ミラーを調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 原子間力顕微鏡校正
<ol><li>パワー スペクトルを測定します。<ol>
<li>AFM に接続されているフィルター、帯域幅をフルに AFM ヘッド信号のフィルター設定を有効にします。</li>
		<li>自体 AFM に関する信号にノイズが追加されますこの圧電が消灯していることを確認します。</li>
		<li>AFM ソフトウェア14を使用して、パワー スペクトルの計算ごとの 1,024 データ ポイントからの 512 の計算の平均値を測定します。</li>
		<li>カンチレバーの振動の主要なモードに対応する最初のピークの間でパワー スペクトル密度を統合するのに AFM ソフトウェア15を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フォト ダイオードの感度を計算します。<ol>
<li>自体 AFM、圧電コント ローラーをオンし、500 Hz (低域通過フィルター) にフィルター設定を変更します。</li>
		<li>AFM ソフトウェアでゼロの周り変動すべき差信号を監視します。迅速 micropositioners を使用して数百マイクロメートル下 AFM ヘッドを移動します。頭を下へ移動を繰り返し、一貫性のあるジャンプの差信号を監視します。表面は非常に近くのとき信号がジャンプを開始高さで増加しています。</li>
		<li>すぐに偏向信号は表面から頭がわずかに動いて、表面との接触時に飽和します。</li>
		<li>Afm によるソフトウェアの入力コントロールを使用して、100 5,000 nm の上下を移動することによって、表面を見つけるにピエゾ電圧を調整します。それでも表面が到達しない場合は、手動で頭とサンプル間の距離を減らすために続けます。</li>
		<li>AFM ソフトウェアでスキャン サイズ約 500 の引き抜き実験を行う nm 先端は、約 100 の連絡先、ピエゾ旅行の nm。</li>
		<li>AFM の先端が基板表面と接触して残る圧電変位曲線とフォト ダイオード信号の線形領域の勾配を測定します。</li>
		<li>ばね定数と斜面と統合されたパワー スペクトルを用いた感受性を計算 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq1.jpg">)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. データ集録
<ol><li>準備。<ol>
<li>AFM に接続されているフィルター、フィルター設定をサンプリング周波数は、少なくとも 2 倍の帯域 (ナイキスト基準)、低域カットオフの上限を与えるに設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>測定。<ol>
<li>スキャン サイズを展開ポリタンパク質 (アミノ酸 × 0.365 数) に加えて基板に対して押すことを許可する約 40% の総理論的なサイズに設定します。たとえば、9 x I91 構築を引いて約 300 の理論展開長さを必要がのでスキャン サイズ、約 420 nm nm。</li>
		<li>AFM ソフトウェア表面かスキャン サイズの 80% にあるカンチレバーを位置 (340 についてこの場合、サーフェスから nm)。</li>
		<li>AFM ソフトウェアで 300 nm/秒に最初のスキャン速度を設定します。 注:この速度は、低速または高速の用途に変更できます。</li>
		<li>引き抜き実験を実行し、圧電、フォト ダイオードの信号の位置を測定します。原子間力顕微鏡のソフトウェアを使用すると、スキャンを開始します。</li>
		<li>AFM ソフトウェアで約 10,000 の録音まで測定を実行し続けます。 注:通常、肯定的な制御分子のピックアップ率は 0.516、だから 10,000 は、分析するのに十分なデータを収集できるようにする必要の周りです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. データ解析
<ol><li>データを正規化します。<ol>
<li>各記録のための拡張機能を使用して、拡張子を計算 = 変位 - F/kc (kc は 5.2.7 から)。</li>
		<li>力ピークが存在しない力拡張トレースの前後いずれかの平均を取ることによってベースライン力レベルを決定し、カンチレバーが表面に対して押していません。全体の力拡張曲線は、この平均値で、シフトことができます。</li>
		<li>ゼロの y 軸に沿って拡張機能が揃うようにデータを変換します。これは分子を拡張トレースの先頭をゼロに設定する必要がありますのでです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>興味の蛋白質を識別します。<ol>
<li>単一分子の指紋を提供する少なくとも 4 つの I91 イベントが付いている録音を識別します。これらの録音は、真の「単一分子測定」をキャプチャします。</li>
		<li>さらなる分析のための印の単一分子イベント イベントを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>輪郭の長さの増分を決定します。<ol>
<li>録音ごとに展開イベントにワームのようなチェーン モデルに合うよう<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq2.jpg">、 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/55989/55989eq3.jpg"> 、室温でpは永続化長さ (通常 0.4 を 1 nm)、 xはナノメートルの拡張子、 Lは輪郭線長ナノメートル。 注:ワームのようなチェーンのフォームは正確に補間されたソリューション、Bouchiatらのより厳密な数値解法を発見17. 蘇らに代替のフィッティング モデルを見つけることができます18。</li>
		<li>L は、2 つの連続した展開イベントの決定し、この違いは鋳造の値の差を計算「輪郭の長さの増分」.</li>
	</ol>
</li>
	<li>破断力を決定します。<ol>
<li>展開曲線に最大の低下の前に最高点を取ることによって特定の展開イベントの破断力を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy%3A+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li>
<li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+%CE%B2%CE%B3-Crystallin+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li>
</ol>

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プロトコルの重要なステップは、単一分子イベント「指紋」をポジティブ コントロールとして機能する 1.1.2、の手順に従って、エンベロープタンパク質の使用です。一般に、ある必要があります開くポリタンパク質蛋白質のイベント (I91、つまり約 28 約 200 pN と輪郭線長さ増分の展開力 nm) 興味の蛋白質が折り畳まれたされていることを明確に締結します。たとえば、興味の蛋白質は、どちらの側から 3 つの I91 ドメインが並ぶがとき、必要がありますそれは単一分子のイベントでは積極的に締結する少なくとも 4 つの I91 イベント。ポリタンパク質、または他の手段によって肯定的な制御がない場合、任意のデータは誤解する責任を負うです。
プラスミッドのクローニング法は遺伝子と関心のプラスミドに依存します。利用可能にした使用できるポリプロテイン プラスミドと共にこのプロトコル12。20,21のクローン作成のユニークな制限のサイ...

原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (SMF) の進歩は、機械操作と単一タンパク質分子の正確な評価に有効にしています。この特性は、タンパク質力学1,2,3タンパク質-リガンド相互作用4、蛋白質蛋白質の相互作用5、フォールディングについて知見を生産している、タンパク質ベース設計材料6,7,8。SMF は特にタンパク質を調べる場合に役立ちます AFM によるストレッチとして展開、継続的に増加輪郭線長を生じ、その剛性によると徐々 に拡張するタンパク質分子内における化学的および物理的債をできます。このタンパク質分子の overstretching 破裂イベントの結果力拡張曲線の急激な遷移を生成 (したり強制的にピーク)。力ピーク値は、力学の展開プロセス中にタンパク質の展開力と構造変化に関する直接的な情報を提供します。AFM を用いた最初の研究の一つは、タイチン1を測定し、タンパク質のアンフォールディングとリフォールディング集中化学薬品、極端な温度のような不自然な変性剤を使用せず生理条件下での新しい側面を発見します。
ここで原子間力顕微鏡だけを考えても SMF 実験をさまざまな楽器に行った.AFM は、4 つの主要な要素で構成されます: プローブ、検出器、試料ホルダー、圧電スキャナー。プローブは、片持ちの揺れる端に鋭い先端です。キャリブレーション後フックの法則を使用して力を正確に判断するカンチレバーの背面から反射されるレーザー光を用いた測定接続されている分子のストレッチ中に、片持ち梁の曲げ。ダイオード センターからのレーザービームの変位に比例した電圧を作り出す象限フォト ダイオード検出器に反射レーザー ビーム プロジェクト。流体の蛋白質のサンプルの基板は、サブナノ精度で制御することができます 3 D 圧電ステージ上にマウントされます。フォト ダイオード検出器からの電圧を読み取り、コンピューター制御の電圧供給を通じて 3 D ステージを制御コンピューター。これらの圧電アクチュエータの段階通常容量が装備されているまたは歪みゲージ センサー位置正確に測定圧電変位してフィードバック制御システムを通じて正しい履歴。圧電コント ローラーからセンサー信号出力は、工場出荷時校正は、ピエゾの電圧定数を使用して距離に変換されます。引っ張る実験例力拡張曲線は図 2に示します。
AFM SMF 実験の 2 つのタイプがある: 一定速度、一定力測定を引っ張るします。Oberhauserらのコンスタントフォース SMF 測定値の説明します。9、ここで我々 は一定速度の測定に焦点を当てる一方。典型的な原子間力顕微鏡等速引張実験は、カンチレバー先端に対して基板をゆっくり移動するピエゾに電圧を提供することによって行われます。典型的な実験は最初表面に対して押すとヒントです。引きの測定は、接触の引き出すため先端から基板を移動によって開始されます。場合蛋白質の最初の接触は先端、それが取得され、変位に対する力の展開のトレースで測定されます。先端と接触し、基板を戻され、タンパク質の折り畳みを決定力変位からことができます、リラックスしたトレースを測定します。

<table><tbody><tr><td>AFM試料ディスク、直径15mm</td>、<td>Ted Pella、Inc.</td><td>16218</td><td>ガラス基板のベースとして</td></tr><tr><td>丸型ガラスカバースリップ 直径 15mm Thick</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26024</td>は<td>、金コーティング</td></tr><tr><td>粘着タブ</td><td>テッドペラ株式会社</td>のガラス基板およびベースとして機能します。<td>16079</td><td>AFM試料ディスクに貼り付けて、ガラスカバースリップを取り付けるための粘着面を提供する</td></tr><tr><td>STDマルチモードヘッドアセンブリ</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>1B75C</td><td>AFMヘッド</td></tr><tr><td>ガラスプローブホルダー</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>MTFML-V2</td><td>マルチモードAFMによる流体中スキャン用ガラスプローブホルダー&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロレバーAFMプローブ</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>MLCT</td><td>窒化ケイ素カンチレバー、窒化ケイ素チップ付き、コンタクトイメージングモードに最適</td></tr><tr><td>Auコーティングチップ付きAFMプローブ</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>OBL-10</td><td>アンフォールディング力の少ないタンパク質を引っ張るためのカンチレバー</td></tr><tr><td>多機能データ収集(DAQ)カード、16ビット、1 MS/秒(マルチチャンネル)、1.25 MS/秒(1チャンネル)、32アナログ入力</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6259</td><td>AFMヘッドおよびピエゾアクチュエータからの信号のデータ収集</td></tr><tr><td>LISAリニアピエゾステージアクチュエータ</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-753.11C</td><td>基板の位置を制御し、引っ張り測定を行うピエゾアクチュエータ</td></tr><tr><td>XYピエゾステージ</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-541.2CD</td><td>ピエゾアクチュエータは、基板の位置を制御し、基板表面でスキャンします</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

ネイティブ 3 D 構造にそのアミノ酸配列からのタンパク質の折り畳み過程の定量生物学の重要な問題では。原子間力顕微鏡 (AFM) ストレッチと特定のアンフォールディングとリフォールディング特性の直接証拠を与える単一タンパク質分子の弛緩を有効にしてこの問題に対処することができます。原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (原子間力顕微鏡 SMF) は、高エネルギーは従来のばら積み (生化学) 測定不可能なタンパク質立体を一貫して測定するための手段を提供します。AFM SMF の原則を示すため、公開された多数の論文じゃない簡単に網羅的なプロトコルの不足のための SMF 実験を実施できます。本研究では、AFM の原理を簡単に説明して SMF の実験からのよい結果を達成するためにガイドラインとしてプロトコル、手順、およびデータ分析の詳細を広く。単一蛋白質機械的展開測定の代表的な SMF 結果を示すし、一般的、いくつかの戦略をトラブルシューティング問題が発生いたします。

この議定書から代表的な結果は、図 2のとおりです。両方のパネルは、タンパク質から代表的な力-伸長曲線を示します。上部下部 I91 蛋白質、蛋白質の金利、NI10C 分子の側面を示しています I91 エンベロープタンパク質の結果を示しています。これらの録音は I91 の特徴的な力を表示 (200 pN) と長さの増減値を輪郭 (28 nm) の配置および AFM の較正が成功したことを示します。これらの力伸長曲線は、ワームのような鎖 (破線) 分子の力に依存しない長さを決定して展開の残基の数を決定することによって分析できます。解析されると、輪郭の長さ単位 (後続の輪郭線長さの差)、展開力は展開速度とアンフォールディング経路19は蛋白質の安定性を決定する使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfi...

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

単一分子力分光法は、単一分子を力で操作できるようにすることで、原子スケールで分子生物学に関する膨大な洞察を提供することができます。ここでは、原子間力顕微鏡を用いた一定速度測定を行う。最終的にデータを使用して、タンパク質の安定性、展開速度、展開経路を決定することができます。手順を開始するには、非導電性接着剤タブをクリーンな15ミリメートル幅の鉄ディスクに取り付けます。カバーシートを取り外し、露出した接着剤に清潔でコーティングされていない、または金でコーティングされたガラススライドをしっかりと押し込みます。スライドを清潔で覆われたペトリ皿に保管します。次に、精製したポリタンパク質を遠心フィルターに濃縮し、次にカラムを逆にして、実験に使用するバッファーにタンパク質を溶出させる。280ナノメートルの吸光度に基づいて適切なタンパク質濃度を決定し、次いでタンパク質の1ミリリットル溶液あたり100マイクログラムの100マイクロリットルを調製する。60マイクロリットルのタンパク質溶液をスライドの中央に塗布します。これは、実験中に制御されていないサンプルの動きにつながるので、スライドと鉄ディスクの間に液体が滑らせないように注意してください。サンプルを室温で少なくとも10分間座らせます。まず、末端でカンチレバーを慎重にピックアップし、プローブ保持セルに入れる。片持ちレバーがしっかりと取り付けられていることを確認します。次に、AFMヘッドに保持セルを置きます。逆顕微鏡ステージにヘッドをセットし、電池パックをAFMヘッドに接続してレーザーに電力を供給します。顕微鏡検出器用のカメラを設置し、モニタやテレビ画面でレーザー光を可視化します。顕微鏡で導き、レーザーをカンチレバー先端に向けられるように位置する。サンプルの準備ができたら、10マイクロリットルの実験バッファーをプローブ保持セルの各ポートにフラッシュします。サンプルスライドから約40マイクロリットルの流体をデスキャンし、40マイクロリットルのバッファーを追加します。その間、測定のための原子間力顕微鏡の準備を始める。まず、マグネット上のピエゾモーターの上にスライドを置きます。AFMステージが高い位置にあることを確認し、サンプル液滴の上に片持ち持ちでステージ上にAFMヘッドを置きます。次に、AFMフォトダイオードの前に小さな紙を置きます。用紙のスポットが明るくなり、焦点が合うまでレーザーを調整し、用紙を取り外します。AFMソフトウェアを起動して、フォトダイオードからの信号を表示します。4 つのフォトダイオード象限でレーザー信号が最大になり、上部と下部の象限ペアの間の異なる信号がゼロになるように、AFM ヘッド ミラーを調整します。AFM のキャリブレーションを開始するには、AFM ヘッド信号のフィルタ設定を全帯域幅に切り、ピエゾがオフになっていることを確認します。AFM ソフトウェアでは、1 つの計算で 1,024 データポイントを使用して、パワースペクトルの 512 の計算の平均を測定します。カンチレバーの振動のメインモードに対応する第1のピークを横切って電力スペクトル密度を統合します。次に、圧電コントローラをオンにして、フィルタを500ヘルツに設定します。AFMヘッドを数百マイクロメートル下に素早く移動させながら、異なる信号を監視します。異なる信号で一貫したジャンプを見ながら、一度に数百マイクロメートル下に頭を動かし続けます。信号のジャンプが高さが増加し始めると、先端はサンプル表面に非常に近くなります。表面との先端接触時に偏向信号が飽和したら、ヘッドをわずかに上げてから、ピエゾ電圧を調整してAFMヘッドを100~5,000ナノメートル動かしてサンプル表面を見つけます。その後、約500ナノメートルのスキャンサイズで、先端が表面に接触するように、または約100ナノメートルのピエゾモーター移動で、引っ張り実験を行います。結果を使用して、ばね定数と感度を計算します。ソフトウェアでは、スキャンサイズを展開するポリタンパク質の理論上の合計サイズよりも40%大きく設定します。表面からスキャンサイズの80%になるように片持ち面を配置します。スキャン速度を毎秒 300 ナノメートルに設定します。引っ張り実験を行い、得られたピエゾ位置とフォトダイオード信号を測定します。測定全体を通して1時間ごとに実験バッファーを流体細胞に追加して、サンプルが乾燥しないようにします。I91ポリタンパク質の記録における展開イベントと、3つのI91ドメインがNI10C分子を両側に横たわっているポリタンパク質の、ワーム様鎖モデルを取り付けた。両方の記録は、I91の特性力と輪郭の長さの増分を示し、AFMキャリブレーションが成功したことを示す。N110C分子を含むポリタンパク質の記録は、新しい事象が展開する目的のタンパク質からのものであることを確認するのに十分なI91事象を示した。アンキリン反復の平均輪郭長は約10.5ナノメートルで、展開力は8~25ピコニュートンの間であった。隣接するタンパク質の展開イベントは、単一分子イベントをフィンガープリントする肯定的なコントロールを提供するので、ポリタンパク質を使用することが不可欠です。これがなければ、データは誤解を受けやすい。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

これは、目的、操作、そして斬新な重力の分光計からの代表的な結果を示すステップバイステップガイドです。...

繊維状タンパク質をストレッチし、測定する新しい重力分光器の使用を実証

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。...

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。...

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。...

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。...

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。...

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。...

中性子スピンエコー分光法 による タンパク質ダイナミクスの研究

アンサンブル力分光法(EFS)は、生物物理学およびバイオセンシング分野における生体分子構造のアンサンブルセットの機械的アンフォールディングおよびリアルタイムセンシングのための堅牢な技術です。...

せん断力によるアンサンブル力分光法

学ぶ原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法で、タンパク質の機械的特性と展開経路を測定する手法です。定速度測定によりタンパク質安定性と展開速度を解析し、分子生物学の理解を深めます。

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

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