原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法
February 28th, 2019
詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.
単一分子力分光法は、単一分子を力で操作できるようにすることで、原子スケールで分子生物学に関する膨大な洞察を提供することができます。ここでは、原子間力顕微鏡を用いた一定速度測定を行う。最終的にデータを使用して、タンパク質の安定性、展開速度、展開経路を決定することができます。
手順を開始するには、非導電性接着剤タブをクリーンな15ミリメートル幅の鉄ディスクに取り付けます。カバーシートを取り外し、露出した接着剤に清潔でコーティングされていない、または金でコーティングされたガラススライドをしっかりと押し込みます。スライドを清潔で覆われたペトリ皿に保管します。
次に、精製したポリタンパク質を遠心フィルターに濃縮し、次にカラムを逆にして、実験に使用するバッファーにタンパク質を溶出させる。280ナノメートルの吸光度に基づいて適切なタンパク質濃度を決定し、次いでタンパク質の1ミリリットル溶液あたり100マイクログラムの100マイクロリットルを調製する。60マイクロリットルのタンパク質溶液をスライドの中央に塗布します。
これは、実験中に制御されていないサンプルの動きにつながるので、スライドと鉄ディスクの間に液体が滑らせないように注意してください。サンプルを室温で少なくとも10分間座らせます。まず、末端でカンチレバーを慎重にピックアップし、プローブ保持セルに入れる。
片持ちレバーがしっかりと取り付けられていることを確認します。次に、AFMヘッドに保持セルを置きます。逆顕微鏡ステージにヘッドをセットし、電池パックをAFMヘッドに接続してレーザーに電力を供給します。
顕微鏡検出器用のカメラを設置し、モニタやテレビ画面でレーザー光を可視化します。顕微鏡で導き、レーザーをカンチレバー先端に向けられるように位置する。サンプルの準備ができたら、10マイクロリットルの実験バッファーをプローブ保持セルの各ポートにフラッシュします。
サンプルスライドから約40マイクロリットルの流体をデスキャンし、40マイクロリットルのバッファーを追加します。その間、測定のための原子間力顕微鏡の準備を始める。まず、マグネット上のピエゾモーターの上にスライドを置きます。
AFMステージが高い位置にあることを確認し、サンプル液滴の上に片持ち持ちでステージ上にAFMヘッドを置きます。次に、AFMフォトダイオードの前に小さな紙を置きます。用紙のスポットが明るくなり、焦点が合うまでレーザーを調整し、用紙を取り外します。
AFMソフトウェアを起動して、フォトダイオードからの信号を表示します。4 つのフォトダイオード象限でレーザー信号が最大になり、上部と下部の象限ペアの間の異なる信号がゼロになるように、AFM ヘッド ミラーを調整します。AFM のキャリブレーションを開始するには、AFM ヘッド信号のフィルタ設定を全帯域幅に切り、ピエゾがオフになっていることを確認します。
AFM ソフトウェアでは、1 つの計算で 1,024 データポイントを使用して、パワースペクトルの 512 の計算の平均を測定します。カンチレバーの振動のメインモードに対応する第1のピークを横切って電力スペクトル密度を統合します。次に、圧電コントローラをオンにして、フィルタを500ヘルツに設定します。
AFMヘッドを数百マイクロメートル下に素早く移動させながら、異なる信号を監視します。異なる信号で一貫したジャンプを見ながら、一度に数百マイクロメートル下に頭を動かし続けます。信号のジャンプが高さが増加し始めると、先端はサンプル表面に非常に近くなります。
表面との先端接触時に偏向信号が飽和したら、ヘッドをわずかに上げてから、ピエゾ電圧を調整してAFMヘッドを100~5,000ナノメートル動かしてサンプル表面を見つけます。その後、約500ナノメートルのスキャンサイズで、先端が表面に接触するように、または約100ナノメートルのピエゾモーター移動で、引っ張り実験を行います。結果を使用して、ばね定数と感度を計算します。
ソフトウェアでは、スキャンサイズを展開するポリタンパク質の理論上の合計サイズよりも40%大きく設定します。表面からスキャンサイズの80%になるように片持ち面を配置します。スキャン速度を毎秒 300 ナノメートルに設定します。
引っ張り実験を行い、得られたピエゾ位置とフォトダイオード信号を測定します。測定全体を通して1時間ごとに実験バッファーを流体細胞に追加して、サンプルが乾燥しないようにします。I91ポリタンパク質の記録における展開イベントと、3つのI91ドメインがNI10C分子を両側に横たわっているポリタンパク質の、ワーム様鎖モデルを取り付けた。
両方の記録は、I91の特性力と輪郭の長さの増分を示し、AFMキャリブレーションが成功したことを示す。N110C分子を含むポリタンパク質の記録は、新しい事象が展開する目的のタンパク質からのものであることを確認するのに十分なI91事象を示した。アンキリン反復の平均輪郭長は約10.5ナノメートルで、展開力は8~25ピコニュートンの間であった。
隣接するタンパク質の展開イベントは、単一分子イベントをフィンガープリントする肯定的なコントロールを提供するので、ポリタンパク質を使用することが不可欠です。これがなければ、データは誤解を受けやすい。
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概要
この記事では、原子間力顕微鏡を用いてタンパク質分子の機械的特性と展開経路を測定する手順について詳しく説明しています。単分子力分光法を通じて、タンパク質の安定性と展開速度に関する洞察を提供します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 生物物理学
- 分子生物学
- 単分子技術
背景
- 単分子力分光法は個々の分子の操作を可能にします。
- 原子間力顕微鏡はこれらの測定の重要なツールです。
- タンパク質の力学を理解することは生物学的プロセスへの洞察を得るために重要です。
- 得られたデータはタンパク質の安定性と展開メカニズムに関する情報を提供します。
研究の目的
- タンパク質の機械的特性の測定を実証すること。
- 単一タンパク質分子の展開経路を示すこと。
- 良好な単分子記録の参考資料を提供すること。
使用された方法
- 原子間力顕微鏡を用いた定速度測定。
- 接着タブとガラススライドを使用したサンプルの準備。
- 準備したスライドを清浄な状態で保管すること。
- タンパク質の安定性と展開速度を決定するためのデータ分析。
主要な結果
- 単一タンパク質分子力学の成功した測定。
- 展開経路と速度の特定。
- 方法論の検証のための代表的な結果の提供。
- 分子レベルでのタンパク質の安定性に関する洞察。
結論
- 原子間力顕微鏡は単一タンパク質力学の研究に効果的です。
- データはタンパク質の挙動の理解を大幅に向上させることができます。
- 方法論は将来の単分子研究のガイドとなります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-molecule force spectroscopy using atomic force microscopy (AFM) enables direct quantification of protein mechanical stability and unfolding pathways, providing mechanistic insight not accessible through bulk assays. This capability is critical for de-risking early-stage target validation and informing predictive models of protein behavior under physiological stress. Integrating AFM-based measurements into discovery workflows enhances confidence in target selection and supports risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly quantifies protein stability and unfolding rates at the single-molecule level.
- Enables mechanistic de-risking by revealing high-energy conformational states.
- Supports functional target validation through precise measurement of unfolding events.
- Improves predictive confidence in target selection by clarifying folding pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mechanical fingerprints for protein constructs used in downstream assays.
- Facilitates reproducible, quantitative readouts for assay standardization.
- Enables robust comparison of protein variants or engineered constructs.
- Supports screening readiness by confirming assay system integrity at the molecular level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein misfolding or instability.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular mechanics to functional outcomes.
- De-risks translational advancement by confirming mechanistic hypotheses in physiologically relevant conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based force spectroscopy fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on protein folding and stability mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical readouts for assay qualification.
- Analytics: Provides force-extension curves and contour length measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular biophysics with preclinical model selection when protein misfolding is implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse protein targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule measurements for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and single-molecule data analysis.
- Demands specialized instrumentation and calibration protocols.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data comparability.
- Adaptation may be needed for different protein constructs or buffer conditions.
- Interpretation depends on robust positive controls to avoid data misattribution.
