Name: ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶビーズベースのマルチプレックスアッセイによる人涙液サイトカイン解析法。Schirmerストリップで採取した少量サンプルから複数アナライトを同時検出し、眼疾患における炎症メカニズム解明に活用できます。

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研究活動は、タン ・ トク ・ セン病院個別のシード資金調達プログラム 2015; からセンターの助成金によって支えられました。シンガポールの目の研究所パイロット助成と基金のタン ・ トク ・ セン病院ピッチを付与します。

、シンガポールのタン ・ トク ・ セン病院倫理委員会で承認された本研究で使用するプロトコル。
 1 涙サイトカイン解析 <ol><li>涙のコレクション: <ol><li>試験椅子座ると彼/彼女の頭はヘッドレストを配置する件名をお願いします。</li>。
		<li>見て、慎重に開いて (ワットマン濾紙号 41 製) シルマー ストリップ ストリップの丸い端を眼の下の円蓋に置き、5 分間目を閉じて主題を指示する対象を求めます。涙を収集しながら、眼の表面の接触を最小限に抑えるため細心の注意を取る。 30</li> <li>ストリップを削除し、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに彼/彼女の目を開いて件名をお願いします。サイトカインのプロファイリングのテストまで研究室または-80 o C でストアにチューブをすぐに転送します</li>。
	</ol></li> <li>Tear サンプル涙流れストリップからの溶出: <ol><li>涙流れストリップを (テストする涙の量を標準化) に 0.5 cm の長さにカットし、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに配置</li>。
		<li>追加 30 μ l</li>
		<li>別 1.5 mL 遠心チューブに上清を移すし、ストリップを破棄します。氷の上の管を含んでいるサンプルを置き、サイトカイン プロファイリング溶出 tear サンプルをすぐに利用します</li>。
	</ol></li> <li>試薬の調製: 注: ビーズ基づくマルチプレックス アッセイによって各サンプルでテストされる 40 の 1 つがインターロイキン (IL)-1 α、il-1 β、IL Rα、IL-2、IL 3、IL 4、IL-5、IL-6、IL-7、イリノイ 8、IL 9、IL-10IL 12 p40、IL 12 p70、IL-13、IL-15、IL-17A インターフェロン-α IFN (インターフェロン-α) 2、IFN-γ-γ-誘導マクロファージ由来のタンパク質 10 (IP 10, CXCL10)、ケモカイン (MDC)、マクロファージ炎症性タンパク質 (MIP)-1 α と MIP 1 β、単球走化性タンパク質 (MCP)-1、MCP-3、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、TNF β、増殖に制御される遺伝子 (GRO)、腫瘍増殖因子アルファ (TGF-α)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF)-2、血小板由来成長因子 (PDGF)-AA、PDGF-AB/BB、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、エオタキシン フラクタルカイン、可溶性の CD40 リガンド (sCD40L)、Fms のようなチロシン キナーゼ 3 配位子 (フェルマーの最終定理-3 L) 起動時に規制されており、通常 T 細胞発現し、分泌 (RANTES)。
	<li>部屋の温度 (20-25 o C) と渦に抗体ビーズ溶液 (50 X) バイアル 1 分のバイアルをもたらす</li> <ol>
		<li>アッセイに必要な井戸の数をカウントし、合計抗体ビーズ カクテル溶液 (25 μ L/ウェル) とアッセイに必要な各抗体ビーズ溶液 (50 X) の量を計算します</li>。
		<li>は、希釈ビーズの残りの金額を追加することによって目的の最終的なボリュームに各抗体ビーズ ソリューションおよび塗りつぶしの金額を追加することによってカクテルのソリューションを準備します。各抗体のカクテルでの最終濃度が 1 X であることを確認します。少なくとも 20% を常に準備ピペッティング エラーの場合カクテル ソリューションの余分なボリューム 。
		注: 例として、96 ウェルの試金のための準備抗体ビーズ カクテル溶液の 3000 μ L。各抗体ビーズ ソリューションの必要量 = 3000/ストック濃度各抗体ビーズ ソリューション;3000/50 = 各抗体ビーズ ソリューション <ol><li>41 抗体ビーズ ソリューションのそれぞれの追加 60 μ L の 60 μ L (60 × 41 = 2460 μ L) カクテルにボトルし、最終の 3000 μ L にする抗体ビーズ混合物にビーズの希釈溶液の 540 μ L を追加実用的なソリューション (1 X).</li>
			<li>ミックス ビーズ カクテル ソリューションが適切使用、する前に。アッセイは最大 30 日間の 2 8 o C で残りのボリュームを保存後</li>。
		</ol></li> <li>1 QC や QC 2 株を 250 μ L の脱イオン水を追加することによって品質管理 (QC) を準備します</li>。
		<li>ミックスが適切数回ボトルを反転して渦 10 s. 転送のためにソリューション ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用に正しくラベルし、最大 30 日間使用できる-20 ° C で残りの溶液を保存します</li>。
		<li>10 X 30 mL に 270 mL の脱イオン水を加えて洗浄バッファーの準備は緩衝液を洗浄し、よく混ぜる (希釈する前に部屋の温度に 10 X バッファーをもたらすと混合することによってすべての塩の析出物を溶解)。30 日間使用することができます 2-8 ° C で未使用の洗浄バッファー (1 X) を格納します</li>。
		<li>は、ストックのバイアルに 250 μ L の脱イオン水を追加してヒトサイトカイン標準在庫 (すべての検体 10,000 pg/mL) を準備します。いくつかの時間と渦 10 バイアルを反転で混ぜる米 10 分間放置し、ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用に正しくラベルに原液を転送すること。アッセイ後-20 ° c は、30 日間使用することができます残りの溶液を格納します</li>。
		<li>割増シリアル希薄によって作業ヒトサイトカイン標準を準備 (50 μ L - &#62; 200 μ L)、2000 を取得するアッセイバッファーで 400、80、16、および 3.2 pg/mL</li>。
		<li>標準的な準備の後 60 分以内の作業標準を使用し、空白/背景としてアッセイ バッファーを使用 (-pg/mL).</li>
	</ol></li> <li>マルチプレックス アッセイを用いたサイトカインがビーズでプロファイリング: <ol><li>96 ウェル マイクロ プレートにそれらを追加する前に 5 〜 10 秒の室内温度と渦にすべての試薬をもたらします。O C 試金、前に氷上冷凍涙抽出物を解凍し、1000 X g で 5 分間遠心分離機-80 で溶出涙サンプルが格納されている場合</li>
		<li>ヒトサイトカイン基準を操作するための垂直方向の設定で分析作業シートを準備 [0 (空白)、3.2、16、80、400、2,000、10,000 pg/mL] QC1、QC2 とサンプル</li>。
		<li>それぞれに洗浄バッファー X 1 の追加 200 μ L プレートのプレート シーラーでは封印、室温 (20-25 o C) 10 分でプレート シェーカーでそれを維持</li>
		<li>プレートを反転して 1 X 洗浄バッファーをデカントし、タップそれ吸水タオルに数回井戸の洗浄バッファーの任意の残留量を削除します</li>。
		<li>各作業ヒトサイトカイン標準、QC1、QC2、空白の追加 25 μ L を (アッセイバッファー) と適切な井戸にサンプル</li>。
		<li>追加 25 μ L を各ウェルにアッセイバッファー</li>。
		<li>1 X の追加 25 μ L 抗体ビーズ カクテル溶液を各ウェルに。抗体ビーズ溶液は光に敏感、プレート板シーラーでシール、アッセイ中光からそれを保護するためにアルミ箔でカバーします</li>。
		<li>4 o C 一晩シェーカーでプレートをインキュベートします</li>。
		<li>は、自動磁気プレート ワッシャー プレート ラックに板を配置します。井戸の底で磁気ビーズを解決し、よく内容を吸引する 1 分間座ってみましょう。200 μ L/ウェル洗浄バッファーを追加し、1 分間座っているし、よく内容を吸引せてください。もう一度洗浄を繰り返します (プレート洗浄、次のキットの製造業者 &#39; の指示).</li>
		<li>各検出抗体ソリューションの追加 25 μ L まあ、プレート シール、アルミ箔でカバー、シェーカーで 60 分間室温でインキュベートします</li>。
		<li>追加 Streptavidi の 25 μ L各ウェルに n フィコエ リスリン ソリューション プレート シール、アルミ箔でカバー、シェーカー上で 30 分間室温でインキュベートします</li>。
		<li>は、洗濯機は磁気プレートにプレートを配置します。それは 1 分間座っているし、よく内容を吸引してみましょう。200 μ L/ウェル洗浄バッファーを追加します。それは 1 分間座っているし、よく内容を吸引してみましょう。もう一度洗濯を繰り返します</li>。
		<li>もそれぞれ、抗体ビーズを再懸濁しますに室温で 5 分間シェーカーにプレート シース液の追加 150 μ L.</li>
		<li>は、ビーズを使って直ちにプレート ベース多重アッセイ プレート リーダーを読むし、5 パラメーター曲線近似アルゴリズムを用いたサイトカイン濃度を分析します。涙サイトカイン プロファイリングのフロー図は、 図 1 に示す</li>。
	</ol></li> <li>アッセイ プレート (楽器を設定) とデータ分析を読む: <ol><li>ビーズのスイッチ ベースの多重アッセイ リーダーと前暖かい 30 分レーザー</li>
		<li>は、ビーズによる多重分析ソフトウェアを起動します。下で、&#39; 自動メンテナンス &#39; タブを選択し、&#39; 校正検証 &#39; オプション。各試薬は 30 s の場所 5 の校正及び検証のビーズのバイアル渦滴各試薬指定の井戸に。脱イオン水、70% エタノールで指定された貯水池を埋める</li>。
		<li>新しいプロトコルを作成する <ol><li>を開く、&#39; プロトコル &#39; ページし、&#39; プロトコル &#39; タブをクリックします &#34; を作成する新しい ProtocolŔ、&#39; 設定 &#39; タブが開きます</li>。
			<li>で、&#39; 名 &#39; ボックスに、プロトコルの名前を入力します</li>。
			<li>の右側のボックスに説明を入力、&#39; 名前 &#39; ボックス</li>。
			<li>で、&#39; バージョン &#39; ボックスに、プロトコルのバージョンを入力します</li>。
			<li>で、&#39; メーカー &#39; ボックスに、プロトコルの製造元の情報を入力します</li>。
			<li>定義の設定、&#39; 取得設定 &#39; 次のようにセクションします。設定 &#39; ボリューム &#39;: 100 μ &#39; タイムアウト &#39;: 60 s;&#39; DD ゲート &#39;: 8,000 に 15,000;&#39; レポーター利得 &#39;: 標準的な光電子増倍管;&#39; 型ビーズ &#39;: 磁気ビード</li>。
			<li>定義の設定、&#39; 分析の設定 &#39; セクションでは、選択する &#39; 定量 &#39; 分析の種類として。設定 &#39; 規格番号 &#39;: 6;&#39; コントロールの数 &#39;: 0;ダニ、&#39; 複製の意味 &#39; ボックス; 
			ダニ、&#39; サンプルを取得しながら結果の分析 &#39; ボックス</li>。
			<li>をクリックして &#34; NextŔ、&#39; 検体 &#39; タブが開き、検体番号付きグリッドの目的検体 (ID ビーズ) をクリックします</li>。
			<li>クリック アンド タイプに対応する試料名、&#39; 名 &#39; 試料グリッドの右側にある列 (検体 &#39; 名とその対応するビーズ地域の詳細については、表 1 に記載された).</li>
			<li>クリックで (すなわち pg/mL) の測定単位を入力、&#39; ユニット &#39; の左にあるボックス、&#39; すべて適用 &#39; ボタン。クリックして &#34; すべて適用 &#34;.</li>
			<li>クリック アンド タイプ希望のビーズで (すなわち 50) 各試料のカウント、&#39; カウント &#39; ボックス。クリックして &#34; のすべてを適用 &#34;.</li>
			<li>クリック &#34; NextŔ プレート レイアウト] タブが開きます。基準と選択のための井戸を強調 &#34; 2 &#34; 下でカウントを複製しをクリックして、&#34; S &#34; 標準のボタン。背景にこの手順を繰り返します &#34; B &#34; とサンプル &#34; U &#34; 井戸</li>。
			<li>をクリックして &#34; を保存 &#34;.</li>
		</ol></li> <li>新しい基準/コントロールの多くを作成 <ol><li>オープン、&#39; プロトコル &#39; ページ、そして、&#39; 標準 &#38; コントロール &#39; タブをクリックします &#34; 新しい標準/コントロール多くの作成 &#34;.</li>
			<li>オープン、&#39; プロトコルの選択 &#39; ボックス。1.5.3 のステップで作成したプロトコルを選択します</li>。
			<li>規格の情報に応じてキー: Std/Ctrl キット番号、Std/Ctrl キット名、有効期限、および製造元</li>。
			各検体 (すなわち 10000 pg/mL) の最も高い標準の値でキーを <li>。希釈下 5 で鍵をつけ &#34; すべて適用 &#34; 予想される濃度基準の残りの部分を自動的に生成する.</li>
			<li>をクリックして &#34; を保存 &#34;.</li>
		</ol></li> <li>既存のプロトコルからの新しいバッチを作成する <ol><li>オープン、&#39; バッチ &#39; ページし、クリックして &#34; 既存のプロトコルから [新しいバッチ] タブを作成 &#34; です</li>。
			<li>にバッチ名を入力、&#39; バッチ名 &#39; のバッチについての説明を入力、&#39; オプションの説明を入力してください &#39; ボックス</li>。
			<li>以前 (手順 1.5.3) で生成されたプロトコルをクリックします</li>。
			<li>クリックして &#34; を開く次のタブは、NextŔ、&#39; 性感染症 &#38; Ctrls &#39; タブ表示測定基準および選択の詳細 &#34; 次 &#34;.</li>
			<li>に、&#39; プレート レイアウト &#39; タブ、このバッチのよくコマンドを割り当てるし、クリックして &#34; 保存 &#34; バッチ情報を保存、&#39; 保留中のバッチ &#39; リスト</li>。
			<li>は、ビーズによる多重アッセイ プレート リーダーにプレートを読み込む 5 分振る、保留中のバッチ リストからバッチを実行します。取得したデータを .csv ファイル形式で保存されます</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>データ解析 <ol><li>rbx の変換ソフトウェアを使用して .rbx の結果データ (ファイル) の形式に基づくビーズ マルチプレックス アッセイ ソフトウェアから生成された .csv ファイルを変換します。変換ソフトを起動選択 xPONENT ファイル下 .csv ファイルを選択し、クリックして、、&#34; を生成する &#34; ボタン;.rbx ファイルは、選択した出力フォルダーに保存されます</li>。
		<li>解析ソフトウェアを起動し、.rbx ファイルを開きます</li>。
		<li>4 pl/5PL カーブ フィットを使用して標準的な曲線を最適化します。
		<ol><li>選択で次、&#39; 標準曲線 &#39;] タブ: &#39; 回帰型 &#39;: &#39; 物流 5PLƆ &#39; 軸変換 &#39;: &#39; ログ - 線形 (y) Ɔ ダニ、&#39; 濃度範囲線を表示 &#39; ボックス; ダニ、&#39; 表示不明なサンプル &#39; ボックス。ダニ、&#39; 表示コントロールのサンプル &#39; ボックス。ダニ、&#39; すべての検体に適用 &#39; ボックス。ダニ、&#39; ショー レポート最適化後 &#39; ボックス</li>。
			<li>をクリックして、&#34; 最適化 &#34; 自動最適化のためのボタン</li>。
		</ol></li> <li>ラベルの下でサンプルの id &#39; サンプル情報の入力 &#39;] タブ</li>
		<li>で観察された濃度を取得、&#39; レポート テーブル &#39; タブし、クリックして、&#34; レポート テーブルをエクスポート &#34; さらに分析用のスプレッドシート ファイルにデータを生成します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).</li>
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<li>Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine+profiling+of+tears+from+dry+eye+patients+by+means+of+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).</li>
<li>Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+array+characterization+of+inflammatory+mediators+in+allergic+and+normal+tears+in+the+open+and+closed+eye+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments.</a> Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。経済的利害関係や利害の対立はありません。

サイトカインは、小さな細胞から分泌されるタンパク質と免疫応答を調節する強力な免疫変調器です。32涙目と病気の発症のメカニズムを理解し、眼の健康の状態を判断するために役立つプロファイル サイトカインに関する研究の様々 な病態に関連しているサンプルで様々 なサイトカインの発現疾患の重症度、診断と進行。2,5低蛋白質濃度と小さなサンプル ボリューム涙サイトカインの分析のための ELISA のような試金の使用を制限する従来の方法の主要な課題であります。33ビーズによるマルチプレックスアッセイが免疫は、elisa 法に明確な利点があります。ビーズによるマルチプレックスアッセイ複数検体の分析のため少量のサンプルを必要とする、機密性の高い、体液蛋白質の picogram 濃度の検出が可能です。34
ここでビーズ基づくマルチプレックス アッ...

涙は、涙腺と付属腺によって生成され、眼の外側の表面をコートします。涙液膜は外側の脂質層の可溶性タンパク質が含まれています内部の水層で構成され、ムチンと膜結合ムチン。涙は、微生物の侵入を防ぐため栄養素を供給し、眼の表面に潤滑を提供します。涙は、空気と角膜への酸素輸送のための組織間のインターフェイスとして機能します。1涙液層はタンパク質、炭水化物、脂質、電解質の成ってです。緑内障、ドライアイ、春季カタル、糖尿病のような眼と全身疾患との涙液タンパク質間の関連付け、甲状腺関連眼窩と癌がいくつかの研究で確認されました。2,3,4涙のサンプルが収集できるマイクロキャピ ラリー チューブまたは涙の流れストリップ (シルマー ストリップ)。また、シルマーのテストは、角膜・屈折矯正手術診療所、結果はサイトカイン解析アッセイに使用可能性があります実行される標準的な手順です。非侵襲的なサンプルのコレクション、バイオ試料のアクセシビリティと様々 な生理学的、病理学的条件と組成物を引き裂く協会作る映画いくつかの眼と全身疾患のバイオ マーカーの潜在的なソースを引き裂きます。4,5,6
サイトカインは、涙は、眼表面の健康と様々 な眼疾患の炎症性条件の研究に重要な役割を果たしています。7涙のサンプルでいくつかのサイトカインの異常な濃度は、ドライアイ、春季カタル (VKC)、アトピー性角結膜炎 (AKC)、季節性アレルギー性結膜炎、ぶどう膜炎に関連する報告されました。8,9,10,11,12,13涙液タンパク質は、質量分析法、ウェスタンブロット法・酵素抗体法 (elisa 法) のような従来の方法で分析できます。14,15しかし、これらのメソッドの制限、感度不良、各患者における複数の涙サイトカインの解析に必要なサンプル量が多い。16,17ビーズによるマルチプレックスアッセイ複雑な混合試料の複数検体を分析するために開発され正常に異なった病気で複数のサイトカインを分析する涙サンプルに適用。6,サンドイッチ elisa 法の18 A の組み合わせと流れ cytometry 技術は、単一サンプル複数検体の定量化のための ELISA よりも敏感になることこれらのアッセイを有効にします。19様々 ないくつかの病態生理学的条件における免疫応答における臨床サンプルや細胞培養上清にこの方法を適用できます。20,21,22,23,24
ELISA の試金方法の相関を報告している比較ビーズによる多重いくつか研究がなされています。トイレらに比べてビーズ レジスチン、人間の血清または血漿試料中のグレリンとレプチン、アディポネクチンの検出のため従来 elisa 法による多重アッセイをベースし、強い相関を報告 (r &#62; 0.9)、アッセイの間。25デュポンらの il-1 β の検出ビーズによるマルチプレックスアッセイと ELISA との間の強い相関関係を報告した IL 4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-ϒ、TNF-α フィトヘマグルチニンでリポ多糖刺激全血妊娠中の女性から収集されます。26 ・ ピカリングら報告ヘモフィルス インフルエンザb 型多糖類に対する血清抗体の検出のためビード基づくマルチプレックス アッセイと ELISA との間別の強い相関 (r = 0.96)、のトキソイド破傷風(r = 0.96)、およびジフテリア(r = 0.91)。27ビアジーニら報告高い正の相関 (r = 0.852) 基づくビーズ マルチプレックス アッセイと炭疽アンチ PA の IgG 血清試料中の検出のための ELISA の間。28王ら報告アミロイド β 42 のアルツハイマー病バイオ マーカーの検出のためビード基づくマルチプレックス アッセイと ELISA の相関 (r = 0.77)、総タウ (r = 0.94)、およびアミノ酸 181 にリン酸化タウ (r = 0.82) で脳脊髄液のサンプル。29これらの研究はビーズの適用によるマルチプレックスアッセイ様々 な有望なビードによるマルチプレックスアッセイを作る臨床サンプル、小さいサンプル ボリュームの要件、標準的な elisa 法との相関を示しています。異なる疾患表現型のサンプルの型が異なる場合の複数検体の検出のための従来の ELISA 法に代わる。ここでサイトカインのシルマー ストリップを使用して健康な被験者から集められた涙サンプルの 41 検体プロファイリングのビーズによる多重試金のための標準化されたプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>Milliplex MAP ヒトサイトカイン/ケモカイン磁気ビーズパネル -1 kit</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D luminex instrument&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xPonent software&nbsp;</td><td>Luminex Corp, オースティン, テキサス州, 米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBXGenerator ソフトウェア</td><td>BIO-RAD, フランス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, フランス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレート シェーカー</td><td>コーニング, 米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN マイクロプレート ウォッシャー</td><td>Tecan, スイス</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries inc, 米国</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>メトラー・トレド、カリフォルニア州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 微量遠心チューブ</td><td>Axygen、米国</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>シルマー 涙流試験ストリップ</td><td>アイケア&キュア、米国</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D キャリブレーションキット</td><td>Luminex Corp、米国テキサス州オースティン</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D 検証キット</td><td>Luminex Corp、米国テキサス州オースティン</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr><td>眼科用検査用アームチェア</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

涙液膜は、潤滑、栄養、基になるセルに保護を実現、目の外部表面を覆う脂質、タンパク質やミネラルの複雑な混合物です。涙の分析は、予測、診断、および様々 な眼疾患の予後バイオ マーカーの同定のための新興エリアです。涙は簡単にアクセスできる、非侵襲的な彼らのコレクション。したがって、高度なテクノロジは変化タンパク質や代謝物組成と病態との関連を研究する涙の複数検体の同定に隆起を集めています。涙サイトカインは、眼の表面の健康を研究するための理想的なバイオ マーカーでもドライアイと春季カタルのような別の眼表面疾患のメカニズムを理解するのに役立ちます。ビーズによるマルチプレックスアッセイは、感度の高いサンプルの少量の複数検体の検出の能力を持っています。ここで涙サンプル コレクションの標準化されたプロトコルについて述べる、サイトカインは、ビーズを使用したプロファイリングの抽出と分析による多重アッセイ。

涙流れストリップを使用して 4 健常者の 8 件目から採取した涙とサイトカイン レベルは、上記のプロトコルを使用して分析しました。すべての被験者は男性および 4 人の被験者の年齢は 36、42、44、52 歳それぞれ。眼表面の健康とドライアイ疾患を評価した臨床試験 (涙映画解散時間、シルマー テスト、角膜染色、結膜染色、蓋/マイボーム腺検査、角膜の涙徴候と視覚的な兆候と症状) によると、国際ワーク ショップ目乾燥、2007 年ガイドラインおよび科目のどれも任意の徴候やドライアイの症状を示した。31
分析 41 サイトカインのうち 31 サイトカインが検出しました。 すべての涙のサンプルで IL 17A、MIP 1 β、TNF α が 4 科目の 7 目で IL 4 は IFN-γ は IL-1 a 3 subj の 5 目で検出された 3 科目の 6 の目で検出された 4 学科の 6 の目で検出されました...

涙映画サイトカインの解析は、様々 な眼疾患の勉強に役立ちます。ビーズによるマルチプレックスアッセイは簡便かつ高感度、少量サンプルの複数のターゲットのテストを有効にします。ここで涙映画サイトカインを使用してプロファイリングするためのプロトコルを説明ビーズ基づくマルチプレックス アッセイ。

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

本プロトコルの全体的な目的は、シャーマー試験紙を用いて採取したヒト涙試料中のサイトカインプロファイルを、ビーズベースのマルチプレックスアッセイを用いて解析することです。この手法は、さまざまな眼疾患におけるサイトカインの役割など、眼科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、少量の試料で複数の分析物を同時に解析できることです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のポストドクであるPraveen Balneです。テキストのプロトコルに従って被験者から涙を採取した後、ティアフローストリップを0.5 centimetersの長さに切り、滅菌済みの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入れます。30 microlitersのアッセイバッファーを加え、チューブを室温で5分間インキュベートします。次に、チューブを14,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、ストリップを廃棄します。その後、サンプルを含むチューブを氷上に置き、溶出した涙液サンプルを直ちにサイトカインプロファイリングに使用します。ビーズベースのマルチプレックスアッセイを実施するには、すべての試薬を室温に戻し、5〜10秒間ボルテックスします。溶出した涙液検体をアッセイ前に-80°Cで保存していた場合は、凍結した涙液抽出物を氷上で解凍し、1,000 ×gで5分間遠心分離します。ヒトサイトカイン標準物質のQC-1、QC-2、および検体を処理するためのアッセイワークシートを垂直構成で作成します。プレートの各ウェルに1X洗浄バッファーを200 µLずつ加え、プレートシーラーで密閉します。次に、プレートシェーカーを用いて室温で10分間インキュベートします。その後、プレートを反転させて1X洗浄バッファーを捨て、吸収性のあるペーパータオル上で数回叩き、ウェル内に残った洗浄バッファーを完全に取り除きます。次に、各ヒトサイトカイン標準物質のワーキングソリューション（QC-1、QC-2）、アッセイバッファーのみのブランク、およびサンプルを、それぞれ 25 µL ずつ適切なウェルに添加します。各ウェルにアッセイバッファーを 25 µL 添加します。その後、各ウェルに 1X 抗体ビーズカクテル溶液を 25 µL 添加します。抗体ビーズ溶液は光に敏感であるため、プレートを密閉し、アッセイ中の遮光のためにアルミホイルとプレートカバーで覆います。プレートをシェーカーに乗せ、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、プレートを自動磁気プレートウォッシャーのプレートラックに設置し、磁気ビーズがウェルの底に沈殿するまで1分間静置します。自動磁気プレートウォッシャーを用いて、ウェルの内容物を吸引し、1ウェルあたり200 microlitersの洗浄バッファーを加えます。プレートを1分間静置した後、同様にウェルの内容物を吸引し、洗浄をもう一度繰り返します。各ウェルに25 microlitersの検出抗体溶液を加えます。プレートを密封します。アルミホイルとプレートカバーで覆い、シェーカーを用いて室温で60分間インキュベートします。次に、各ウェルにStreptavidin Phycoerythrin溶液を25 µLずつ加え、プレートを密封してカバーをかけ、シェーカーを用いて室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートをマグネティックプレートウォッシャーにセットし、1分間静置します。次に、ウェルの内容物を吸引し、1ウェルあたり200 µLの洗浄バッファーを加えます。1分間静置した後、ウェルの内容物を吸引し、洗浄工程をもう一度繰り返します。各ウェルに150 µLのシース液を加えます。次に、プレートをシェイカーに設置し、室温で5分間振盪して抗体ビーズを再懸濁させてから、プレートの読み取りとサイトカイン濃度の分析に進みます。テキストプロトコルに従ってアッセイプレートを読み取るには、バッチページを開き、「既存のプロトコルから新しいバッチを作成する」タブをクリックしてください。バッチ名のボックスにバッチ名を入力し、「オプションの説明を入力」ボックスにバッチに関する説明を入力します。以前に作成したプロトコルをクリックし、次に「次へ」をクリックします。次に開くタブは「標準品およびコントロール」タブです。アッセイ標準の詳細を確認し、「次へ」を選択します。「プレートレイアウト」タブで、バッチのウェルコマンドを割り当て、「保存」をクリックしてバッチ情報を保留バッチリストに保存します。プレートをビーズベースマルチプレックスアッセイプレートリーダーにセットし、保留バッチリストからバッチを実行します。RBX変換ソフトウェアを起動し、「select exponent files」の下で、ビーズベースのマルチプレックスアッセイソフトウェアから生成されたcsvファイルを選択します。次に、「generate」ボタンをクリックします。選択した出力フォルダにrbxファイルが保存されます。次に、解析ソフトウェアを起動し、rbxファイルを開きます。その後、4PL-5PL曲線適合を用いて、標準曲線を最適化します。標準曲線を最適化するには、標準曲線タブで、回帰タイプに「logistics 5PL」を、変換に「log X, linear Y」を選択します。続いて、「濃度範囲線を表示」、「未知試料を表示」、「コントロール試料を表示」、「すべての分析物に適用」、「最適化後にレポートを表示」の各チェックボックスをオンにします。「最適化（optimize）」ボタンをクリックして自動最適化を行います。「サンプル情報の入力（enter sample info）」タブで、サンプルの識別名をラベル付けします。最後に、「レポートテーブル（report table）」タブで観測濃度を確認し、「レポートテーブルの書き出し（export report table）」をクリックして、後続の解析に使用するスプレッドシート形式のデータファイルを生成します。36歳から52歳の健康な男性4名の計8眼から涙液サンプルを採取した。ビーズベースのマルチプレックスアッセイを用いて解析した41種類のサイトカインのうち、31種類がすべての涙液サンプルで検出された。例えば、IL-17A、MIP-1b、およびTNFaは4名の被験者の7眼で検出され、IL-4は4名の被験者の6眼で検出された。さらに、3名の被験者の6眼からインターフェロンガンマが検出されました。3名の被験者の5眼からはインターロイキン-1aが検出されました。2名の被験者の3眼からはエオタキシンおよびインターロイキン-9が検出されました。Interleukin-3が1つの眼で検出され、MIP-1aはいずれのサンプルからも検出されませんでした。検出された41種類のサイトカインの平均値±標準偏差による濃度を、この散布図に示しています。Interleukin-1raは、すべてのサンプルで高度に発現していました。サイトカインのIP-10、GRO、MCP-1、PDGF-AA、Fractalkine、Interleukin-a、EGF、PDGF-BB、VEGF、およびG-CSFもng/mLレベルで高発現しており、その他のサイトカインはpg/mLレベルで発現していました。ここで示されているように、涙液サイトカインで最も低かった測定濃度はTNF-aであり、平均値±標準偏差は27.25 ± 19.97 pg/mLでした。すべてのサンプルで検出された31種類のサイトカインについて、T検定を行った結果、右眼と左眼の間で濃度に統計的な有意差を示したものは認められませんでした。この手法を習得すれば、適切に実施することで1.5日で完了させることができます。このビデオを視聴することで、涙液中のサイトカインプロファイリングのためのビーズベース・マルチプレックスアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

bead-based-multiplex-assay-for-analysis-of-tear-cytokine-profiles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ヒトの涙液中のサイトカインを分析するためのビーズベースのマルチプレックスアッセイを示しています。この方法により、1つのサンプルから複数のサイトカインを同時に分析できるため、さまざまな病態生理学的条件での免疫応答を研究するための感度が向上します。...

ヒト涙液サンプル中のサイトカインを分析するためのマルチプレックスビーズベースのアッセイ

このビデオでは、サンプル中の複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイを実演しています。サイトカイン特異的抗体に結合した異なるマイクロスフェアの混合物を使用して、サンプル中に存在するサイトカインに結合します。ストレプトアビジンタグ付きレポーターは、ビオチン化検出抗体を使用して結合サイトカインに固定化されます。フローサイトメトリーは、マイクロスフェアのユニークなサイズと内部蛍光強度に基づいて結合したサイトカインを同定し、レポーターの蛍光強度はサイトカインの数を示します。...

複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。...

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer...

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

このプロトコルでは、シルマーストリップを使用して涙のサンプルを収集する方法と、非侵襲的な涙蛋白質バイオマーカーを発見するための統合された定量的なワークフローについて説明します。懸濁液トラップサンプル調製ワークフローにより、迅速で頑健な涙液サンプル調製と質量分析が可能になり、標準的な溶液内手順よりも高いペプチド回収率とタンパク質同定が得られます。...

液体クロマトグラフィータンデム質量分析による涙液プロテオミクスのためのタンパク質懸濁液トラップサンプル調製

サイトカイン放出アッセイ参照試薬を使用することで、免疫療法モノクローナル抗体の再現性と標準化された in vitro...

モノクローナル抗体の安全性予測のためのサイトカイン放出アッセイの頑健性を確認するための参照試薬の使用

本記事では、糖尿病網膜症の新しい診断ツールとして、裂傷からmiR-15aを採取・検出するプロトコルについて説明しています。...

涙由来の外色体miR-15aを糖尿病網膜症の新たな診断ツールとして

マウスモデルの涙からRNAおよびタンパク質バイオマーカーを同定することは、さまざまな疾患の早期診断に大きな期待が寄せられています。この原稿は、マウスの涙液からのmRNAおよびタンパク質単離の有効性と効率を最適化するための包括的なプロトコルを提供します。...

mRNA およびタンパク質解析のためのマウスの涙液採取の最適化

このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。...

バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

本プロトコルは、微細毛細血管管を通じて採取されたヒト涙液中の17β-エストラジオールおよびテストステロンを検出・定量するための最適化された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法を記述しています。このアプローチにより、涙ホルモンレベルの低侵襲測定が可能になります。...

酵素結合免疫吸着アッセイを用いたヒト涙膜における性ホルモン検出

学ぶビーズベースのマルチプレックスアッセイによる人涙液サイトカイン解析法。Schirmerストリップで採取した少量サンプルから複数アナライトを同時検出し、眼疾患における炎症メカニズム解明に活用できます。

ビーズベースの涙サイトカイン解析マルチプレックスアッセイ

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