メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

このアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子導入の全体的な目的は、ラットの脳および脊髄を広範囲にわたって遺伝的に操作することです。本手法は、遺伝子導入分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これはin-vivoで遺伝子を導入するための非常に効率的な方法であり、したがって、極めて強力で汎用性の高い技術です。

この手順は迅速かつ再現性が非常に高いものです。私たちは、ラットの脊髄全体に筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質を発現させるために、この広範囲な遺伝子導入アプローチを複数の論文で使用してきました。同僚のRobert Daytonがこの手順を実演します。

Mychal GramesがRobertをサポートします。まず、ワークステーションの準備を行います。最初に、表面を70% ethanolで洗浄してください。次に、作業エリアにヒートパッドを設置し、温度を37 degree celsiusに設定します。

ヒートパッドの上にベンチパッドを置きます。処置に必要な酸素とイソフルランが十分に備わっているか確認してください。導入チャンバーと麻酔マスクを70% ethanolで洗浄し、麻酔マスクをベンチパッドの上に置きます。

動物1匹につき、約5 x 5 cmのパラフィンフィルム1枚、アルコール綿1枚、ガーゼ2〜3枚を用意し、あわせてピペットチップとマイクロピペットを準備します。次に、ベクターを室温で融解させ、動物1匹につき1本の滅菌マイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。必要な量のAAVを適切なチューブに分注し、乳酸リンゲル液または生理食塩水を用いて目的の注入量まで調整します。

サンプルを1〜2秒間ボルテックスした後、5秒間パルス遠心分離し、サンプルをチューブの底に集めます。全注入量をチューブからピペットで吸い出し、パラフィンフィルムの正方形の上に滴下します。次に、1 mLシリンジに30ゲージの針を装着します。

針の刃先を下に向け、パラフィンフィルム上のベクターに刺入します。ウイルスがすべて針とシリンジ内に回収されるまで、シリンジのプランジャーを引き戻します。麻酔システムを用いて、ラットに適切に麻酔をかけます。

足指をピンチして反応がないことを確認し、十分な麻酔深度にあることを担保します。その後、ラットをワークエリアに側臥位で配置し、ノーズコーンを用いて麻酔を維持します。ラットを側臥位にすることで、一方の側尾静脈が上を向いた状態になります。

注入部位は尾の付け根から3分の2の長さの地点です。アルコール綿で注入部位を拭きます。注入部位のわずかに上側で尾をしっかりと保持し、指1本で側尾静脈を直接的に圧迫すると、静脈が拡張します。

針の刃先（ベベル）を上に向け、尾静脈の見える部分に針を同じ方向に合わせます。尾静脈を保持しているもう一方の手で静脈を圧迫しないよう細心の注意を払いながら、尾静脈上の皮膚を刺穿します。その後、尾静脈への圧迫を解除し、正常な血流を確保します。

次に、針を静脈内に挿入します。針が尾静脈を貫通しているか確認するため、プランジャーを軽く引きます。針が静脈に入っていれば、針の中に血液が流れ込みます。

必要に応じて針の位置を調整した後、シリンジの端を尾に押し当てて針を固定します。その後、秒速約 20 µL の速度でゆっくりとベクトルを尾に注入します。注入が不十分な場合、動物の一部のみが導入され、結果が有用にならない可能性が高くなります。

しかし、練習を積めば、良好な注入は非常に再現性が高く、信頼できるものになります。ベクターの投与が完了したら、尾から針を抜き、注入部位にガーゼパッドを30〜60秒間押し当てて止血を促します。その後、イソフルラン麻酔と酸素を停止します。

ラットが意識を取り戻すまで監視し、その後ケージに戻します。AAVで汚染されている可能性のある材料は適切なバイオハザード容器に廃棄し、ワークステーションを70% ethanolで清掃します。凍結ステージ付きのスライディングミクロトームを使用して、AAVを注入した動物の固定および凍結保護済みの脳から、厚さ50 micronの冠状断切片を作製します。

GFPの免疫染色を行いスライドに封入した後、顕微鏡を用いて低倍率レンズで、定義された関心領域の各切片を写真撮影します。解析するすべてのサンプルでカメラ設定を同一に保持し、データをTIFFファイルとして保存してください。広く普及しているScion Imageプログラムで写真を開きます。

2つのウィンドウが開きます。「index color」と表示されているウィンドウを閉じてください。「options」を選択し、次に「density slice」を選択します。ルックアップテーブルウィンドウの赤色部分に、シェードの範囲が表示されます。

ウィンドウ内でカーソルを使用し、特異的なGFPラベル部分のみを塗りつぶし、画像内で非特異的な背景が拾われ始めた時点で停止します。次に、analyzeをクリックし、スケールを設定します。4行目のunitsのドロップダウンリストからpixelsを選択し、okayをクリックします。

蛍光面積を測定するには、[analyze]をクリックし、次に[measure]をクリックします。続いて、[analyze]および[show results]をクリックします。結果ウィンドウが表示され、「area」という見出しの下に蛍光面積の測定値が表示されます。

すべての測定値の記録が完了したら、動物1匹あたり3〜6セクションの値の平均を算出します。適切な統計検定を用いて、群間での導入領域を比較してください。この代表的な画像は、AAV 9 GFPを尾静脈注射してから4週間後のラット小脳におけるGFP免疫蛍光を示しています。

画像解析ソフトウェアを使用して、蛍光領域を選択的にハイライトし、ハイライトされたピクセル数を定量化しました。これは、非導入動物のGFP画像です。GFP注入動物と同じパラメータを用いてこの画像を解析すると、非常に低いレベルのバックグラウンド信号が検出されます。

習熟すれば、ラット1匹あたりの注入は約5分で完了します。結論として、本手法はラットの中枢神経系（CNS）に効率的に遺伝子を導入する方法であり、一度の遺伝子導入で持続的な発現と長期的な効果が得られます。最も重要な点は、末梢から中枢神経系を操作できることです。

比較的非侵襲的な静脈内ベクター注入により、脳および脊髄、すなわち中枢神経系（CNS）に到達します。