Name: メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶラットの脳・脊髄にアデノ随伴ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法。末梢静脈投与で中枢神経系を広範囲に標的化し、遺伝子治療や神経疾患研究に応用可能です。

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この作品は、ALS 協会、Karyopharm ・ セラピューティクス社、Meira GTx、感謝しております、トーマス ・ ローソンから ALS 研究慈善寄付によって賄われていた。アドバイスやトレーニング、エリスの果樹園とドナ バーニーに感謝します。JAS が嘘をついた財団によって支えられたし、健康の国民の協会は GM103418 を付与します。

すべてのプロシージャ適切な NIH ガイドラインに従った。すべてのプロシージャは続く動物愛護とシュリーブ ポートにルイジアナ州立大学健康科学センターで使用の委員会によって承認された動物のプロトコルです。この手順で使用された 6 週齢の雌ラット。
 1 です。 必要なベクトルの用量/ボリュームを決定する <ol><li>ラットに注入すると、各動物に必要なウイルスのベクトルの量を決定するベクトル準備の力価 (集中) に基づく計量。以前ラット中枢神経系における効率的な表現に成功しているベクトルの用量を使用 (ジャクソン ら を参照してください 。6). 注: AAV9 TDP-43 または AAV9 GFP、典型的な線量は 3 x 10 13 - 1 x 10 14 ベクトル ゲノム/kg の間。6 週齢の若いラットの重さ約 150 g.</li>
	<li>は、体系的な比較のためのすべての動物の 1 kg あたり等価線量です。ボリュームは標準的なお勧めの注入量 (250 グラムのラットの 250-500 μ L) を超えないことを確認します。典型的な注入量は若いラットに 200 μ l.</li>
</ol> 2。作業ステーションを準備する <ol><li>すべての必要な消耗品を収集: ピペット先端およびマイクロ ピペット動物、動物、ガーゼ (1 頭につき 2-3) あたり 1 つのアルコール準備パッドあたり正方形 (約 5 x 5 cm) の 1 つのパラフィン フィルム</li>。
	<li>は、70% エタノールで表面をクリーニングして作業面を準備します。ダウン (~ 37 ° C) の低に設定温度に加熱パッドを配置します。加熱パッドの上にベンチのパッドを配置します</li>。
	<li>は、ガス麻酔 (イソフルラン) を準備します。十分な酸素とガス麻酔の手順を確認します。70% エタノール誘導商工会議所と麻酔マスクをきれいにし、ベンチのパッドに麻酔マスクを配置します</li>。
</ol> 3。ベクターの準備 <ol><li>室温でベクトルを解凍し、各動物のための 1 つの滅菌遠心チューブのラベルします</li>。
	<li>ピペット AAV のボリュームで決定適切なチューブに 1.1 をステップし、必要な注入量 (ここでは、200 μ l) までボリュームを持って一日リンガー &#39; s ソリューションまたは生理食塩水</li>。
	<li>パルス渦 1 〜 2 秒のためのサンプルとしてパルス 5 遠心管の底に、サンプルを持参して s</li>。
	<li>チューブとパラフィン膜の角にラットの総注入量をピペットで移しなさい</li>。
	<li>1 mL シリンジに 30 ゲージ針を配置します</li>。
	<li>パラフィン フィルムのベクターに下向き傾斜面と針の場所。すべてのウイルスは、針と注射器までシリンジのプランジャーを戻るに引き抜きます。練習すれば簡単になる針の中に空気の泡を描画を避けるために注意してください</li>。
</ol> 4。ラットを準備 <ol><li>1 L/min まで酸素を切りイソフルラン麻酔を 5% に設定します。すべての接続ホースとバルブの向きを確認して誘導室にガス麻酔が流れることを確認します</li>。
	<li>ラットが応答するまで、ガス麻酔誘導室約 3 分でラットを配置します</li>。
	<li>は、つま先をつまんで麻酔の十分な深さを確保します。つま先ピンチ後足または脚の運動ができません</li>。
	<li>イソフルラン麻酔を麻酔の維持のための 2% に削減し、麻酔は麻酔マスクに流れているので、活栓を調整します</li>。
	<li>ラットの場所 &#39; s 麻酔マスクの鼻、それがその側に横たわっているラットを調整します</li>。
	<li>外側尾静脈を識別します 。
	注: 外側尾静脈約 10 と 2 o にある &#39; 12 尾の背の上部に時計 o &#39; 時計。その側に横たわっているラット、外側尾静脈中に直面する必要があります</li>
	<li>は、アルコール パッドで準備注入領域を拭いてください。注射部位は尾の長さを 3 分の 2 です</li>。
</ol> 5。ベクトルを注入 <ol><li>をしっかり尾わずか 1 本指による注入領域の上外側尾静脈経由で直接; これは静脈を拡張します</li>。
	<li>ベベル上向き、同じ方向に見える尾静脈針を合わせます</li>。
	<li>しっぽを押さえて尾静脈を押すと他の手を避けるために偉大な世話ながら尾静脈を皮膚を突き刺し</li>。
	<li>通常血流を許可するように尾静脈からの圧力を解放します</li>。
	<li>は、静脈に針を移動します。針は尾静脈を穿刺するように、少し引きプランジャー。針が静脈の血液が針に流れます。
	<ol><li>針必要に応じて位置を変更します。その後、針を安定させるために注射部位の下に注射部位の上で手を動かすし、尾に対して注射器の端を保持します</li>。
	</ol></li> <li>尾 (約 20 μ L/s) にベクトルをゆっくり挿入します 。
	注: 静脈は、ベクトルの流れるとして色を失う可能性があります。ソリューションが外静脈注入された標識は、ブレブ、ベクトルを注入すると、皮膚、または抵抗のブランチングします。練習では、余分な血管の露出を最小限に抑えることができます</li>。
	<li>ベクターを投与されている後、ラットから針を除去し 30-60 の出血を止めるために注射部位に対してガーゼのパッドを押す</li>
</ol> 6。クリーンアップ <ol><li>オフ、イソフルレン麻酔と酸素。それが意識を取り戻すまでにラットを監視し、そのケージに戻します</li>。
	<li>は、シャープス コンテナーのすべての針を慎重に配置します。可能性のある適切なバイオハザード容器に AAV で汚染されている他のすべてのディスポーザブル材料の処分します。70% エタノール ワーキング ステーションをきれいします</li>。
</ol> 7。後肢エスケープ反射を評価 注: 後肢欠損が生じますベクター投与量に応じて、TDP 43 遺伝子導入後 2 ~ 6 週間。
<ol><li>の破片の平らな面クリアで 2 本の指でつかむラット &#39; s 本体から約 2 cm の尾します。前肢は、ラットの腹部の下側を見ながらぶら下がっているまでにラットをそっと持ち上げます。
	<ol><li>遺伝子導入後の実験経過を通じて毎週プロシージャを実行 (例えば、遺伝子導入後 12 週間まで). 
		注: もこの方法で前肢の赤字をスコアが、後肢欠損は使用されるベクトル量によっては、このモデルで発生する可能性が高いです</li>。
	</ol></li> <li>、10 時に正中線に向かって 1 つまたは両方の後肢を握り締める場合 10 s. メモのため、後肢を観察 s.</li>
	<li>繰り返しこのテストは 30 で 3 回の合計 s トライアルの間。1 つまたは両方の後肢は、3 つの試験のそれぞれの clenched は、ラットは、運動機能障害を示しています。一貫性のあるすべての 3 つの試験で食いしばりがある場合、現在どちらかの片側または両側の後肢の赤字 (ノート) で手動でデータを記録します</li>。
</ol> 8。Rotarod の運動機能を評価 <ol><li>、rotarod を設定する、rotarod の下にあるベンチのパッドを配置し、(~0.3 回転/秒で速度増加) が 2 分間かけて 4 40 回転/分 (rpm) に加速度を設定します。12 週間の時間コース 2、4、8、被験者を実行し、遺伝子の後 12 週間転送します</li>。
	<li>を許可します。20 分テスト部屋に順応するラット</li>
	最初に、rotarod を使用して、まず 4 rpm のスピードで rotarod を起動し、rotarod のラットを配置するラットを訓練するには、<li>。徒歩で 4 回転、1 回転してから加速を開始ラットとそれが落ちるまで、rotarod の上を歩くラットを許可します。ラット 40 少なくとも一貫して歩くことができるまでトレーニングを続ける s。この方法で健康な若いラットに容易に訓練されます。
	<ol><li>顕著な運動障害があるラットの場合、40 の落下にベースライン遅延を達成するからラットを防ぐことができますを s、ラット rotarod 得点を開始する前に 3-5 トレーニングの試みを提供します</li>。
	</ol></li> <li>Rotarod テストを開始する、rotarod のラットを配置し、rotarod の加速を開始。ラットが rotarod; から落ちる時間に注意してください。これは、秋に待ち時間です。ラットは、120 の後、rotarod に残っている場合 s、この時点でのセッションをキャップ、rotarod からラットを削除、120 の秋の遅延時間を記録 s.</li>
	<li>は、3 つの試験の合計 2 回のテストを繰り返します。疲労の影響を最小限に抑えるために離れて試験、少なくとも 5 分をスペースします。3 つの試験の点数の平均値します。健常者のラットは典型的にはの落下に平均待機時間 &#62; 40 s.</li>
	<li>ケージに戻ってラットを置き、rotarod と周辺地域の 70% エタノールをきれいします</li>。
</ol> 9。小脳における GFP 発現定量化 <ol><li>ラットを麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とし、4% パラホルムアルデヒドを灌流します。脳と脊髄の解剖し、組織を固定液に一晩浸して、30% ショ糖液に移動します。平衡後、カット ステージ 4 , 5 , 6 を凍結との滑走式ミクロトームで 50 μ m のコロナ セクション</li>。
	<li>は、小脳虫部、小脳の中央の葉には等間隔に配置する小脳の 3-6 セクションを選択します。信号を最大化する GFP の蛍光ラベルします。1: 500 で GFP の一次抗体を使用し、1: 300 4 , 5 , 6 の希釈でアレクサ 488 共役二次抗体を使用します 。
	注: を参照してください 4 , 5 , 6 サンプリングの詳細についてを参照、ステイニングします</li>。
	<li>は、顕微鏡を用いた低倍率レンズで興味の定義された領域内の各セクションを photomicrograph します。使用 2.5 × 対物 (エヌ 0.12) とフィルター設定 10、450-490/515-565 励起/蛍光)。カメラの設定のまま (露出時間、例えば、2 s) 分析するサンプルを横切って同じです。として保存します。TIF ファイル</li>。
	<li>は、広く利用可能なサイオン イメージ プログラムで顕微鏡写真を開く; 2 つのウィンドウが開きます。閉じるウィンドウとして示される &#34; インデック スカラー &#34;.</li>
	<li>選択 &#34; オプション &#34;、その後 &#34; 密度 SliceŔ 色合いの範囲はルックアップ テーブル (LUT) ウィンドウで赤色に表示されます。ウィンドウで特定 GFP ラベルのみを入力するカーソルを使用し、非固有の背景画像でピックアップを開始したときを停止します 。
	注: これを定量化する顕微鏡に蛍光の領域を強調表示します。設定は、具体的にはのすべての目に見えない蛍光セルをキャプチャする最適化必要があります。練習では、このメソッドは正確に特定の蛍光を強調します</li>。
	<li>蛍光領域を測定する前にまず正しい単位 (ピクセル) でテストの測定がされるように。これを行うには、クリックして &#34; 分析 &#34;、その後 &#34; セット ScaleŔ4 行目が言う必要があります &#34; 単位 &#34;。ドロップ ダウン リストから選択をクリックしてピクセル単位で測定するためのピクセル &#34; [ok] &#34;。解析オプションを切り替える &#34; 含めるインテリア穴 &#34; 分析のセルの体全体を含めることを確保するためです</li>。
	蛍光の面積を測定する <li>をクリックして &#34; 分析 &#34; し &#34; メジャー &#34;。この値を表示するをクリックして &#34; 分析 &#34; をクリックして &#34; ショー ResultsŔ結果ウィンドウが表示されます。というラベルの見出しの下での蛍光の面積測定になります &#34; エリア &#34;.</li>
	<li>の測定の間で標準化するように、LUT の] ウィンドウで強調表示されている値を変更しないでください</li>。
	<li>すべての測定値が記録されている、かつては平均各動物 (動物あたり 3-6 節) からの値です。適切な統計テストを使用すると、グループ間導入されたエリアを比較します。 6</li></ol>

<ol><li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li>
<li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Methods+Clin.+Dev%22%5BJournal%5D)">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+targeting%2C+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+vector+%26%2334%3Bmagic+bullet%26%2334%3B%3A+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Gene vector &#34;magic bullet&#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li>
<li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+embolism%3A+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Physiol.+Funct.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li>
</ol>

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AAV ベクターの様々 な配送ルートをテストされている: イントラ実質、内 cerebroventricular、内莢膜、静脈内、鼻腔内、筋肉内、等。各ルートは、特定の利点と欠点があります。成人ラット AAV の尾静脈投与は中枢神経系の一貫性のある情報伝達を実現するための信頼性の高い方法です。末梢注入方法注入カニューレの中枢神経組織への導入を回避、低侵襲。このメソッドによって達成することができます効率的な中枢神経系式は、テクニックの最大の利点です。他の実用的な利点は注入法は非常に高速 (開始から終了までの動物につき約 10 分) と、尾静脈注射は高度な技術ではなく、したがってすぐにマスターすることができます。確かに、主な欠点は高価ベクトルの多くが必要ですか、AAV の準備が 1 x 1013ベクトル ゲノム/ml 以下なら可能性の問題となります。ターゲット設定機能ベクトル化と有利な将来は、遺伝子治療臨床研究に与えられた遺伝子デリバリーは、末梢ルートおよびこうして比較的非侵襲的、このアプローチ可能性があります。一方、もっと直接内脳脊髄液注射が有利前臨床および臨床的アプローチの 2 つの理由: より限られたベクトルの広...

組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、あまり生体内でのニューロンの伝達効率がよく、中枢神経系研究のための不可欠なツールです。AAV のベクトルが異なる遺伝子とタンパク質アイソ フォーム、さまざまな組織、別のホスト種、および管理の別の路線を勉強のため非常に汎用性。周辺は、比較的非侵襲、ニューロン中枢神経系全体を最初に変換する静脈注射の記載・ フォウストらとドゥケらによってマウスに AAV を管理ことができますたとえば、(を参照してくださいゼウス紙 Gombash et al.(2014 年))。1,2,3この遺伝子配信アプローチをどちらかの緑色蛍光タンパク質 (GFP) を効率的に表現するラットの使用または ALS 関連タンパク, transactive 応答 43 kDa (TDP-43) 中枢神経系の DNA 結合タンパク質。4,5,6,7,8,9ラットでの作業は、ラットの代謝および生理学的パラメーターはマウスと比べて人間に近い、行動および毒性学的試金のラットのために特別に設計されていますので重要です。さらより多くの遺伝子組み換えラット線が可能になっている AAV 遺伝子伝達研究で利用可能します。
メソッドは、ラットと成果の迅速で信頼性の高い定量広大な中枢神経系遺伝子伝達の詳細です。大規模な中枢神経系の情報伝達は、TDP 43 脊髄全体に表現することによってラットの ALS の症状を模倣する使用されます。メソッドが使用されるジャクソンら若いラットに TDP 43 ベクトルの尾静脈注射6,8,2 つの方法で獲得した TDP 43 による運動障害が数週間後、 9 : 反射と rotarod と、デイトンら・ ジャクソンらとエスケープ5,6,7,9制御 GFP ベクトル、事後分析での小脳の蛍光の面積はジャクソンらにおいて伝達効率の指標として計算は6,8小脳の解析周辺遺伝子デリバリー後中枢神経系伝達性の迅速かつ信頼性の高いインデックスをあると証明したし、さまざまな周辺機器、中央へ遺伝子導入を試みるアプローチを適用する必要があります。

<table><tbody><tr><td>スケール</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene バケツ</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 mL</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンガー液</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>ミニボルテクサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309626</td><td>25g 針が付属 attached. 注射用 27-30g 針と交換</td></tr><tr><td>30g 針</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>イソフルラン USP 250 mL</td></tr><tr><td>麻酔マスク</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>100-2524</td><td>2インチ x 2インチ (5cm x 5cm)</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>ガス麻酔気化器</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>クラシック T3</td></tr><tr><td>ガス麻酔スカベンジャー</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>シアーズ</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>ベンチパッド</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>ロタロッド</td><td>Panlab/ハーバード 装置</td><td>76-0772</td><td>ラット 4匹/マウス</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>デコンラボラトリーズ社</td><td>2401</td><td>140プルーフ</td></tr><tr><td>70% イソプロパノール</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>サイオンイメージ</td><td>サイオンコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP タグ ポリクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>一次抗体 - 1:500 希釈</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>二次抗体 - 1:300 希釈</td></tr><tr><td>Axioskop 40 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR)、オプトジェネティクス、cre lox ターゲットなどをクラスター化、神経科学の主試薬です。本稿の目的は、AAV の尾静脈注射を介してラットにおける広大な中枢神経系 (CNS) 遺伝子導入を試みている調査官を支援するためにです。広範な病理学の条件に関連する大規模な式をその大きいサイズとマウスと比較された人間に生理学的な類似性のため重要なラット モデル。この例のアプリケーションでは、大規模な神経伝達を使用して、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄全体に影響を与える神経変性疾患を模倣します。効率的な大規模な中枢神経系の情報伝達は、前臨床試験で治療上の蛋白質の要因を提供する使用できます。数週間の後注入式間隔の後、伝達の効果が評価されます。緑色蛍光タンパク質 (GFP) の制御ベクトルの小脳の GFP の量は基本的なイメージング プログラムによって、迅速かつ確実に推定されます。ALS によって誘導される運動疾患表現型関連タンパク質 transactive 応答 43 kDa (TDP-43) の DNA 結合タンパク質は、赤字脱出反射と rotarod で獲得しています。疾患モデル作製、遺伝子治療以外に、ここで説明した大規模な遺伝子ターゲットの潜在的な用途があります。このメソッドの利用拡大は、神経科学と川和で仮説を迅速に役立ちます。

TDP 43 誘導運動障害が生じれば、AAV tdp-43 使用 (図 1) 投与量に応じて 2-6 週間以内。部分的にまたはない障害; 失敗した尾静脈注射になりますAAV の効果血流に到達する必要があります。AAV GFP の成功した射出脳と脊髄を通じて GFP 発現ベクター投与量依存的になります。ドライブ式に、サイトメガロ ウイルスの鶏 β アクチン ハイブリッド プロモーター CAG プロモーターとしても知られている強力な組換えプロモーターを用いた中枢神経系だけでなく、肝臓や心臓などの他のいくつかの組織での効率的な表現があります。4,5,10内ラット中枢神経系、AAV9 や AAV の PHP を使用する場合。B ベクトル、パターンは主に神経伝達とだけ疎、散発的なグリア伝達です。4</s...

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

このアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子導入の全体的な目的は、ラットの脳および脊髄を広範囲にわたって遺伝的に操作することです。本手法は、遺伝子導入分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これはin-vivoで遺伝子を導入するための非常に効率的な方法であり、したがって、極めて強力で汎用性の高い技術です。この手順は迅速かつ再現性が非常に高いものです。私たちは、ラットの脊髄全体に筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質を発現させるために、この広範囲な遺伝子導入アプローチを複数の論文で使用してきました。同僚のRobert Daytonがこの手順を実演します。Mychal GramesがRobertをサポートします。まず、ワークステーションの準備を行います。最初に、表面を70% ethanolで洗浄してください。次に、作業エリアにヒートパッドを設置し、温度を37 degree celsiusに設定します。ヒートパッドの上にベンチパッドを置きます。処置に必要な酸素とイソフルランが十分に備わっているか確認してください。導入チャンバーと麻酔マスクを70% ethanolで洗浄し、麻酔マスクをベンチパッドの上に置きます。動物1匹につき、約5 x 5 cmのパラフィンフィルム1枚、アルコール綿1枚、ガーゼ2〜3枚を用意し、あわせてピペットチップとマイクロピペットを準備します。次に、ベクターを室温で融解させ、動物1匹につき1本の滅菌マイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。必要な量のAAVを適切なチューブに分注し、乳酸リンゲル液または生理食塩水を用いて目的の注入量まで調整します。サンプルを1〜2秒間ボルテックスした後、5秒間パルス遠心分離し、サンプルをチューブの底に集めます。全注入量をチューブからピペットで吸い出し、パラフィンフィルムの正方形の上に滴下します。次に、1 mLシリンジに30ゲージの針を装着します。針の刃先を下に向け、パラフィンフィルム上のベクターに刺入します。ウイルスがすべて針とシリンジ内に回収されるまで、シリンジのプランジャーを引き戻します。麻酔システムを用いて、ラットに適切に麻酔をかけます。足指をピンチして反応がないことを確認し、十分な麻酔深度にあることを担保します。その後、ラットをワークエリアに側臥位で配置し、ノーズコーンを用いて麻酔を維持します。ラットを側臥位にすることで、一方の側尾静脈が上を向いた状態になります。注入部位は尾の付け根から3分の2の長さの地点です。アルコール綿で注入部位を拭きます。注入部位のわずかに上側で尾をしっかりと保持し、指1本で側尾静脈を直接的に圧迫すると、静脈が拡張します。針の刃先（ベベル）を上に向け、尾静脈の見える部分に針を同じ方向に合わせます。尾静脈を保持しているもう一方の手で静脈を圧迫しないよう細心の注意を払いながら、尾静脈上の皮膚を刺穿します。その後、尾静脈への圧迫を解除し、正常な血流を確保します。次に、針を静脈内に挿入します。針が尾静脈を貫通しているか確認するため、プランジャーを軽く引きます。針が静脈に入っていれば、針の中に血液が流れ込みます。必要に応じて針の位置を調整した後、シリンジの端を尾に押し当てて針を固定します。その後、秒速約 20 µL の速度でゆっくりとベクトルを尾に注入します。注入が不十分な場合、動物の一部のみが導入され、結果が有用にならない可能性が高くなります。しかし、練習を積めば、良好な注入は非常に再現性が高く、信頼できるものになります。ベクターの投与が完了したら、尾から針を抜き、注入部位にガーゼパッドを30〜60秒間押し当てて止血を促します。その後、イソフルラン麻酔と酸素を停止します。ラットが意識を取り戻すまで監視し、その後ケージに戻します。AAVで汚染されている可能性のある材料は適切なバイオハザード容器に廃棄し、ワークステーションを70% ethanolで清掃します。凍結ステージ付きのスライディングミクロトームを使用して、AAVを注入した動物の固定および凍結保護済みの脳から、厚さ50 micronの冠状断切片を作製します。GFPの免疫染色を行いスライドに封入した後、顕微鏡を用いて低倍率レンズで、定義された関心領域の各切片を写真撮影します。解析するすべてのサンプルでカメラ設定を同一に保持し、データをTIFFファイルとして保存してください。広く普及しているScion Imageプログラムで写真を開きます。2つのウィンドウが開きます。「index color」と表示されているウィンドウを閉じてください。「options」を選択し、次に「density slice」を選択します。ルックアップテーブルウィンドウの赤色部分に、シェードの範囲が表示されます。ウィンドウ内でカーソルを使用し、特異的なGFPラベル部分のみを塗りつぶし、画像内で非特異的な背景が拾われ始めた時点で停止します。次に、analyzeをクリックし、スケールを設定します。4行目のunitsのドロップダウンリストからpixelsを選択し、okayをクリックします。蛍光面積を測定するには、[analyze]をクリックし、次に[measure]をクリックします。続いて、[analyze]および[show results]をクリックします。結果ウィンドウが表示され、「area」という見出しの下に蛍光面積の測定値が表示されます。すべての測定値の記録が完了したら、動物1匹あたり3〜6セクションの値の平均を算出します。適切な統計検定を用いて、群間での導入領域を比較してください。この代表的な画像は、AAV 9 GFPを尾静脈注射してから4週間後のラット小脳におけるGFP免疫蛍光を示しています。画像解析ソフトウェアを使用して、蛍光領域を選択的にハイライトし、ハイライトされたピクセル数を定量化しました。これは、非導入動物のGFP画像です。GFP注入動物と同じパラメータを用いてこの画像を解析すると、非常に低いレベルのバックグラウンド信号が検出されます。習熟すれば、ラット1匹あたりの注入は約5分で完了します。結論として、本手法はラットの中枢神経系（CNS）に効率的に遺伝子を導入する方法であり、一度の遺伝子導入で持続的な発現と長期的な効果が得られます。最も重要な点は、末梢から中枢神経系を操作できることです。比較的非侵襲的な静脈内ベクター注入により、脳および脊髄、すなわち中枢神経系（CNS）に到達します。

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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メソッドおよびアデノ随伴ウイルスラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

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