メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント
2017年8月25日
ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。
このアデノ随伴ウイルスベクター遺伝子導入の全体的な目標は、ラットの脳と脊髄を広範囲に遺伝子操作することです。この方法は、遺伝子導入分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、生体内で遺伝子を導入する非常に効率的な方法であり、したがって、非常に強力で非常に用途の広い技術です。
この手順は迅速で再現性が高いです。私たちは、この大規模な遺伝子導入アプローチを使用して、ラットの脊髄全体に筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質を発現させ、いくつかの論文で発表しています。私の同僚であるロバート・デイトンが手順を実演します。
マイカル・グラメスがロバートを補佐します。ワークステーションを準備することから始め、まず、70%エタノールで表面を清掃します。次に、作業エリアに加熱パッドを置き、摂氏37度まで温めるように設定します。
加熱パッドの上にベンチパッドを置きます。手順に十分な酸素とイソフルランがあることを確認してください。誘導チャンバーと麻酔マスクを70%エタノールで洗浄し、麻酔マスクをベンチパッドに置きます。
動物1匹につき約5×5cmのパラフィンフィルム1枚、動物1匹につきアルコール調製パッド1枚とガーゼパッド2枚または3枚、ピペットチップ、マイクロピペットが手元にあることを確認してください。次に、ベクターを室温で解凍し、動物ごとに1本の滅菌マイクロ遠心チューブを標識します。必要な量のAAVを適切なチューブにピペットで移し、乳酸リンガー溶液または生理食塩水を使用して、その量を希望の注射量まで上げます。
サンプルを1〜2秒間ボルテックスした後、5秒間パルス遠心分離機でサンプルをチューブの底に運びます。チューブから取り出してパラフィンフィルムの正方形に全注入量をピペットで移します。次に、1ミリリットルの注射器に30ゲージの針を置きます。
ベベルを下に向けて、パラフィンフィルム上のベクターに針を置きます。すべてのウイルスが針と注射器に入るまで、シリンジプランジャーを引き戻します。麻酔システムを使用してラットに適切に麻酔をかけます。
つま先のつま先つまみに対する反応がないことにより、適切な麻酔面を確保します。次に、ラットを横向きの作業エリアに置き、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。ネズミを横にして、1つの側尾静脈が上を向く必要があります。
インジェクションは尾の長さの3分の2下にあります。アルコール調製パッドで注射部位を拭きます。.尾を注入領域の少し上にしっかりと保持し、1本の指を外側尾静脈の真上に当てると、静脈が拡張します。
斜角を上にして、針を目に見える尾静脈と同じ方向に合わせます。もう一方の手で尾を持って尾の静脈を押さないように細心の注意を払いながら、尾の静脈に皮膚を突き刺します。尾静脈から圧力を解放して、正常な血流を確保します。
次に、針を静脈に移動します。針が尾静脈に穴を開けたことを確認するには、プランジャーを少し引き戻します。針が静脈内にある場合、血液は針に流れ込みます。
必要に応じて針の位置を変更した後、シリンジの端をテールに当てて針を安定させます。.ベクターを毎秒約20マイクロリットルで尾部にゆっくりと注入します。注射が不十分な場合、動物は部分的に形質転換されるだけで、結果はおそらく役に立たないでしょう。
しかし、練習を重ねれば、優れた注入は非常に再現性と信頼性があります。ベクターが投与されている場合は、尾から針を取り外し、ガーゼパッドを注射部位に押し付けて、出血を30〜60秒間止めます。.イソフルラン麻酔と酸素をオフにしてください。
ネズミが意識を取り戻すまで監視し、その後ケージに戻します。AAVで汚染された可能性のある材料は、適切なバイオハザード容器に廃棄し、ワークステーションを70%エタノールで清掃します。AAVを注入した動物の固定および凍結保護された脳から、凍結ステージ付きのスライド式ミクロトームを使用して、50ミクロンの冠状切片を取得します。
GFPの免疫染色を行い、スライドにマウントした後、顕微鏡を用いて、定義された関心領域の各切片を低倍率レンズで顕微鏡撮影します。解析するすべてのサンプルでカメラ設定を同じに保ち、データをTIFFファイルとして保存します。広く利用可能なScion Imageプログラムで顕微鏡写真を開きます。
2つのウィンドウが開き、インデックスカラーで示されたウィンドウを閉じます。オプションを選択し、次に密度スライスを選択します。さまざまな色合いがルックアップテーブルウィンドウに赤で示されます。
ウィンドウで、カーソルを使用して特定のGFPラベリングのみを入力し、画像内で非特定の背景が取得され始めたら停止します。次に、[分析] をクリックしてスケールを設定します。4行目に単位と表示されているはずで、ドロップダウンリストからピクセルを選択し、[OK]をクリックします。
蛍光領域を測定するには、[分析] をクリックし、[測定] をクリックします。次に、[分析して結果を表示] をクリックします。結果ウィンドウが表示され、蛍光領域の測定値は、領域とラベル付けされた見出しの下に表示されます。
すべての測定値が記録されたら、動物ごとに3〜6セクションの値を平均化します。適切な統計的検定を使用して、グループ間で形質導入された領域を比較します。この代表的な画像は、AAV 9 GFPの尾静脈注射の4週間後のラット小脳におけるGFP免疫蛍光を示しています。
画像解析ソフトウェアを使用して、蛍光領域を選択的に強調表示し、強調表示されたピクセルを定量化しました。これは、形質導入されていない動物のGFP画像です。この画像をGFP注入動物と同じパラメータを使用して解析すると、非常に低いレベルのバックグラウンドシグナルが検出されます。
一度習得すれば、ラット1匹あたり約5分で注射を行うことができます。結論として、この技術は、ラットCNSに遺伝子を効率的に導入する方法を説明しており、1回限りの遺伝子送達は持続的な発現と長期的な効果を生み出します。最も重要なことは、中枢神経系が末梢から操作されていることです。
比較的非侵襲的な静脈内ベクター注射は、脳と脊髄、CNSに到達します。
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概要
本記事では、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた、ラットの中枢神経系（CNS）への広範囲な遺伝子導入法について解説します。本手法は脊髄に影響を及ぼす疾患を模倣することを目的としており、1回の末梢投与により治療用タンパク質の導入を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝子治療
- 神経科学
- ベクター開発
背景
- アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、in-vivo遺伝子導入に有効です。
- 遺伝子導入は、神経疾患の理解に役立ちます。
- これまでの研究において、この手法がさまざまな用途に活用されてきました。
- この技術は、効率性と再現性に優れていることで知られています。
研究の目的
- ラットの脳および脊髄を遺伝的に操作すること。
- 中枢神経系（CNS）疾患の治療における遺伝子導入の可能性を探索すること。
- 迅速かつ汎用性の高い遺伝子導入手法を提供すること。
使用した手法
- 遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスベクターの使用。
- 広範な導入を目的とした末梢投与。
- 疾患関連タンパク質を発現させるための本手法の適用。
- 同僚による手順の実演。
主な結果
- 筋萎縮性側索硬化症（ALS）関連タンパク質の発現に成功。
- 脊髄全域における遺伝子導入の効率性を実証。
- 複数の論文を通じて、本手法の妥当性を検証。
- 遺伝子導入技術の汎用性を強調。
結論
- この手法は、CNS研究における強力なツールとなります。
- 本手法は、遺伝子治療への応用に関する知見を提供します。
- さらなる研究により、その治療的ポテンシャルを拡大させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
この手法は、静脈内AAV投与によるラットの中枢神経系への効率的かつ広範囲な導入を可能にし、神経変性疾患モデルにおける前臨床的なターゲット検証およびメカニズムのリスク低減をサポートします。このアプローチは、脳および脊髄において広範な外来遺伝子発現を達成するための、再現性のある非侵襲的な経路を提供し、神経遺伝学における仮説検証や治療用タンパク質送達研究を促進します。その有用性は、生物学的な個体差を減少させ、ターゲットへのエンゲージメントおよびパスウェイ調節における予測精度を高めることで、前臨床ワークフローを加速させる点にあります。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：生理学的に適切なラットモデルにおいて、中枢神経系（CNS）全体にトランスジェニック遺伝子を発現させることで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用の価値：1回の末梢投与で持続的なトランスジェニック遺伝子発現を可能にし、機能的な標的バリデーションを支援します。
- 予測的価値：脳および脊髄の各領域において用量依存的な導入効率を示すことで、標的に対する信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状態： 定義されたCNS領域におけるGFP蛍光定量により、定量可能なトランスジーン発現リードアウトを生成します。
- 再現性： 個体間で非常に一貫した導入レベルを実現し、信頼性の高いアッセイ標準化を可能にします。
- 拡張性： 迅速な注射手順（ラット1匹あたり約5分）と技術的ばらつきが最小限であるため、多個体研究に適しています。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患モデリング：脊髄全体を導入することで、ALSなどの神経変性疾患に見られる広範な病理を模倣します。
- トランスレーショナルな連続性：表現型評価のための長期的なトランスジェーン発現を可能にし、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行います。
- バイオマーカーの整合性：中枢神経系（CNS）領域における治療用タンパク質のデリバリーおよびターゲットエンゲージメントの評価をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、発見から前臨床に至る一連の流れに適合しており、早期のターゲット仮説の検証、スケーラブルなアッセイ開発、および疾患関連システムにおける縦断的な表現型評価を可能にします。
- 探索生物学： 広範なCNSへのトランスジーン導入により、パスウェイの解明および生物学的リスクの低減を促進します。
- スクリーニング： 化合物やコンストラクトの評価に向けた、標準化され定量的なトランスジーン発現出力を提供します。
- 分析： 画像解析ツールを用いた、蛍光ベースの導入効率の定量化を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 広範なCNS病理および治療用タンパク質発現をモデル化することで、前臨床段階の継続性を支援します。
- エンタープライズ再利用： 複数のターゲットおよび治療モダリティにわたる、CNS標的遺伝子導入のための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 一貫した広範囲の中枢神経系（CNS）への導入を可能にすることで、ターゲット検証におけるメカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 迅速かつ明確に定義された静脈内投与プロトコルを通じて、再現性と標準化を確保します。
- 戦略的価値： 信頼性の高い前臨床CNS導入データを提供することで、Go/No-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 疾患関連ラットモデルにおけるターゲットエンゲージメントを検証することで、リスク調整後の開発推進を支援します。
実施上の検討事項
- 齧歯類のハンドリング、静脈内注射、および無菌操作の専門知識が必要です。
- AAVベクターの作製、麻酔装置、および蛍光イメージングシステムへのアクセスに依存します。
- 注射量、ベクタータイター、および注射後のインキュベーション期間について、チーム間での標準化が必要です。
- 異なるセロタイプ、プロモーター、および導入遺伝子のペイロードに応じた適応検討が含まれます。
- AAVに対する潜在的な免疫応答や、個体間による尾静脈へのアクセス性のばらつきによる制限があります。
