Name: Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ アミロイド-β42ペプチドの合成と成体ゼブラフィッシュ脳への注入法。神経幹細胞に対するアミロイド毒性の影響と再生応答を探索し、アルツハイマー病モデルを構築する再現性の高い手法です。

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この作品は、DZNE とヘルムホルツ協会 (VH-NG-1021)、CRTD、によって支持されたドレスデン工科大学 (FZ 111、043_261518) と DFG (KI1524/6) (c. k.);ライプニッツ学術連合 (SAW-2011 IPF-2) と BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) で、(Y.Z.)。我々 も感謝したいウルリケ ・ ホフマン ペプチド合成用とナンディニ アショーカ、Prayag Murawala エリー田中については手順を撮影中。

この議定書、EU ガイドラインによって提案された標準的な手順 (2010/63) と生物学および薬 (EuFishBioMed) でカールスルーエ研究所の技術 (キット) の魚モデルのヨーロッパの社会。後、ここに記載されているすべてのメソッド (Landesdirektion ドレスデン; 文書番号 TVV-52/2015 年) 倫理委員会によって承認されました。
 1 です Aβ42 ペプチド作製 <ol><li>合成ペプチド (表 1 参照) 標準的な 9-fluorenylmethoxycarbonyl (fmoc 保護) 化学を用いた 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-。自動固相ペプチド合成 52 結合試薬として tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU)。合成スケールは 100 µmol です</li>。
	<li>は、(積載量 0.2 モル/g の) 固相として 500 mg fmoc 保護保護樹脂の自動ペプチド合成装置をロードします。溶存 fmoc 保護保護アミノ酸濃度 0.5 M を読み込む必要なボリュームとそれぞれのシンセサイザーの計算 。
	注: 計算が 2 回と 5 回過剰樹脂 47 各ビルディング ブロックの各 fmoc 保護保護アミノ酸の結合を有効にするのに作られています</li>。
	<li>は、dimethlyformamide (DMF) のペプチド合成のための必須の試薬を溶解します。たとえば、非反応したアミノ基をキャップに 0.48 M、45 %v/v N メチルモルホリン (NMM) (ベース) と 5 %v/v 無水酢酸 (キャップの混合物) の濃度で HBTU、アクティベーターを準備します</li>。
	<li>切断はトリフルオロ酢酸 (TFA) から成る作りたて胸の谷間混合撹拌装置を使用して固体のサポートを継続的に混合することによって樹脂からすべてのペプチド: Triisopropylsilane(TIS): 水: ジチオトレイトール (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5(v/v): 2.5 (m/v)、4 h の 100 µmol の合成スケールの 10 mL を使用します</li>。
	<li>100 mL 冷たいジエチル エーテルを胸の谷間の混合物を追加することによって裂かれた製品の沈殿物します。孔径 0.45 μ m のポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターおよび 20 mL 冷たいジエチル エーテルで洗浄を含むろ過装置を通過します</li>。
	<li>フィルター ペーパーからフィルター処理されたペプチドを収集し、ディゾルブ 100 mg 5 mL で沈殿したペプチドの脱イオン蒸留水: 1:1 でアセトニ トリル</li>。
	<li>逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) ビード サイズ 10 μ m の多孔質ポリスチレン ジビニル ベンゼン列装備セミ分取 HPLC のを介して浄化。
	<ol><li>は予熱して列および 50 ° c 加熱装置列を使用して管理します。5% から 100% 溶剤 B 4 mL/分で 25 分以上にグラデーションを適用することにより、自動化された分数のコレクターを使用してすべての主要な画分を収集 
		注意: 溶剤 A、0.1% 水と溶剤 B で TFA は 0.1% アセトニ トリル 52 TFA</li>。
		<li>220 でクロマト グラムを監視 nm、適切なピークを収集し、分析 LC さんを使用して</li>
	</ol></li> <li>確認分析をリバースで純度相の超高圧液体クロマトグラフィー (高精度) 220 nm UV 検出器を用いた分析の C18 カラム (ビード サイズ 1.7 μ m) を通して試料を通過しながら監視することによって。質量分析法によるペプチド製品を確認します 。
	注: 高精度は、エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (MS) とタンデム四重極検出器に結合されています</li>。
	<li>では、丸底フラスコで目的のペプチドの正しい端数を凍乾ふわふわ粉によう 0.052 mbar の真空を適用することによって。-80 ° c-78 ° C 店で無期限に保持される凍結単位に真空ポンプをカップルします</li>。
	<li>アセトニ トリル混合物の 1 mM のストック溶液を調製する凍結乾燥のペプチドを使用して: DMF: 1 で分析グレード水: 実験のための 1:1。ペプチドは、このソリューションでは集約されていないと、少なくとも 6 ヶ月間このソリューションを格納できます</li>。
</ol> 2。注入混合物の調製 <ol><li>希釈凍結乾燥ペプチドのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10 mM ナ 2 HPO 4、2 mM KH 2 PO 4、pH 7.4) を準備します</li>。
	<li>は、PBS で 20 μ M の最終的な集中にペプチドを溶解します。このソリューションの新鮮なを準備します。よく混合し、注入まで氷の上保存します。ソリューションでの凝集を防ぐために 30 分を超えないようにします</li>。
</ol> 3。麻酔 <ol><li>準備麻酔薬、循環から定期的な魚水に 0.1% アミノ安息香酸エチル m アミロー スパン (MESAB) の原液システム。0.0025% (v/v) の最終的な集中に anaesthetization ソリューションを準備します</li>。
	<li>システム水の 5 リットルのコンテナー輸送にタンクから魚の数を削除します</li>。
	<li>半分埋めるプラスチック シャーレ (90 mm) 40 mL 麻酔薬と。注射のためこのお皿を使っています</li>。
	<li>まで蓋の動きが停止している麻酔薬で魚をインキュベートします</li>。
</ol> 4。Cerebroventricular マイクロインジェクション <ol><li>噴射装置の準備 <ol><li>準備ガラス注入毛細血管針引き手を使用して、次のパラメーターで: 加熱サイクル、537 のサイクル、250; 速度の引き1.5 s;時間、80 さん</li> <li>25 psi に圧力源の圧力設定をもたらすします</li>。
		<li>マイクロインジェクター パラメーターを下記に設定: ホールド 20 psi の圧力; 圧力を取り出し 10 psi; 期間値 2.5 ゲート値 100 さん</li>
		<li>は、注射液がガラス管をロードします。インジェクション ホルダーにガラス管を挿入します。45 ° 噴射角度を調整します 。
		注: 参照 27 , 46 で説明されているように詳細なプロトコルが発見ことができます</li>。
	</ol></li> <li>(ステップ 3.3) のように anaesthetization ソリューションで新しいペトリ皿に場所 1 つの魚いっぱい</li>。
	<li>鉗子、注射用オリエントで魚を保持します</li>。
	<li>は、2 つの外側のプレートが交わる視蓋に頭蓋骨の 30 G 針の先端を使ってスリットを生成します。脳組織に先端を挿入しないでください、これが原因で出血や損傷。 27 , 45 , 46 詳細を参照を参照してください</li>。
	<li>スリットにガラス管を挿入します。
	<ol><li>は、針の先端だけを使用し、頭蓋骨を 1 mm 以上に浸透しません。魚を押さえておくし、切開サイトを通じてガラスキャピラリ先端を挿入します</li>。
		<li>は、ガラスに向けて 45 ° の角度で終脳管の先端を合わせます。ソリューションの 1 μ L を注入します。注射後すぐに液体分散します</li>。
	</ol></li></ol> 5。回復 <ol><li>魚は、それが回復するまで輸送コンテナーに戻る場所。最適な水質を確保するため定期的に循環の魚の水にコンテナーを接続します 。
	注: 回復通常 1 分を取る必要があります。(これは実験者によって最適化が必要) 短時間麻酔で魚を保管しなければならない時間がかかっている場合</li>。
</ol > 6。ティッシュの準備と押します <ol><li>魚を犠牲にする前に、必要な期間待機します 。
	注: これは実験の質問に依存します。アミロイドの沈着は注射後 1 日も早く見ることができる</li>。
	<li>倫理的な規則に応じて適切なメソッドを使用して魚を犠牲に (例えば、0.1 M MESAB で魚を扱う).</li>
	<li>背側では、先の尖った鉗子を使用して視蓋の上の頭蓋骨を開いてカットし、解剖頭だけ後ろにメスの胸びれ</li>。
	<li>修正 2% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用してヘッド一晩でプラスチック製のチューブで当たり PFA の 4 ° c. の使用 3 mL ネジ蓋で 。
	注意: 適切な個人用保護具を着用は、PFA を処理するときです</li>。
	<li>に対する凍害保護作用と脱灰、0.1 M で三度頭を洗うためリン酸バッファー (pH 7.4) 20 %sucrose/20% エチレンジアミン (EDTA) ソリューションにそれらを転送し、4 で一晩インキュベート ° C</li>
	<li>樹脂の断面にティッシュを埋め込むことでドライアイス (ブロックを固定するのには約 3-5 分) 組織学プラスチック金型 gelatin/20% 7.5% ショ糖液でヘッドを固定します。-80 ° c のサンプルを格納または (cryosectioning) の次の手順に進みます</li>。
	<li>として記述されている 28 , 42 クライオスタットを用いた 12 μ m 厚い凍結切片にヘッドをセクションします。スライド ガラスに直接凍結切片を転送し、長期的な使用のための-20 ° C で保存します</li>。
</ol> 7。免疫組織化学染色と顕微鏡 注: 加湿チャンバー内でインキュベーションのすべての手順を実行します。すべての洗浄手順は、各 10 分。
<ol><li>乾燥室温で 30 分間のセクション。解凍後、PBS で 2 回、PBSTx セクションを洗う (0.03% と PBS トリトン X 100).</li>
	<li>で 4 ° C 一晩一次抗体 (抗 Aβ42 抗体; PBSTx の 1: 500 希釈) と加温の翌日、洗って一度 PBS と 2 回 PBSTx です。</li>。
	<li>DAPI と共に二次抗体 (蛍光結合検出、1: 500 希釈) とセクションを孵化させなさい (1 μ g/mL) 室温で 2 時間 PBSTx で</li>。
	<li>PBSTx で 3 回洗う。最終洗浄後 100 μ L 70% グリセロールを使用して coverslip のスライドをマウントします</li>。
	<li>(たとえば、488 励起範囲で 20 X PL APO エヌ 0.7 客観的かつ標準的な緑フィルター共焦点顕微鏡を用いた取得蛍光画像 図 2) 39.</li></ol>

著者がある何も開示するには

アミロイド ペプチドは、変異またはさまざまなタグを含めるに変更できます。例えば、スクランブル アミロイド ペプチドを生成することができますとペプチドの N 末端ペプチド最後の蛍光タグでラベルまたはキャリア ペプチド39が付いたできます。同様に、このプロトコルでは、キャリアのペプチドは、細胞浸透性ペプチド TR 深い輸送貨物に有効性のために脳組織39。さらに、本手法は、注入と有毒集計50,51を引き起こす可能性が様々 なペプチドの解析します。したがって、私たちのシステムは、ゼブラフィッシュ脳とそのような毒性の細胞影響を分析に有毒な蛋白質の手動注入の汎用解析法を提供しています。
アミロイド ペプチド集計迅速、かつその、株式、水 DMF アセトニ トリル水溶液、保管する必要があり、PBS 0.5 注入前に h と混合する必要があります。ソリューションの大規模な集計は、注射液が注...

広告は、ニューロンの損失によって特徴付けられる慢性の進行性疾患で大脳皮質1,2,3,4、5のシナプスします。広告の古典的な神経病理学的特徴アミロイドペプチドの成膜であり、原線維変化の形成のもつれ (Nft)6。老人斑、アミロイド斑とも呼ばれますは、脳実質5β プリーツ構造を形成するアミロイド β (a β) ペプチドで構成されます。AD 患者における Aβ42 の蓄積には、病気の進行の早期かつ重要な役割があります。広告は、シナプスの機能障害、障害の可塑性と神経細胞の損失7,8,9,10につながるイベントの連鎖をトリガーします。
魚類ゼブラフィッシュ成体脳研究幹細胞の可塑性11,12,13,14,15,の調節に優れたモデルとして16,17,18,19、20広告21,22,23 を含む中枢神経系 (CNS) におけるさまざまな病気 ,24。利用可能な実験方法19,20,25,26,27,28,29,の広大な配列のため30,31, これらの研究は有益であり、実現可能です。ゼブラフィッシュ中枢神経系13,15,32,33,34,35,36,37を補充することが 38, 神経細胞の損失19,39,40,41,42,43後、活性化分子のプログラムを使用しての一部 44。したがって、ゼブラフィッシュ神経変性疾患モデルの確立は、脊椎動物の脳の再生能力と幹細胞生物学に関する新規質問に対処を助けることができます。
最近では、合成 Aβ42 ペプチド (表 1)39を注入することによって成人脳のアミロイド毒性モデルを開発しました。この注射原因神経変性疾患表現型 (例えば, 細胞死、ミクログリア活性化、シナプス変性および記憶障害)、人間の脳の病理を彷彿を惹起するため、ゼブラフィッシュを使用ことができますを示すゼブラフィッシュ脳の神経変性、ペプチドを免疫組織化学的染色と大人ゼブラフィッシュ中枢神経系がすることができます再生の分子機構検出できる Aβ42 には、39が識別されます。このプロトコルを示す cerebroventricular (CVMI) の注入法27,39,45,46を用いたゼブラフィッシュ脳にアミロイド ペプチドの注入アミロイド沈着 (図 1) を模倣します。CVMI では、β シート構造として射出時に集約し、毒性を発揮するペプチドを提供する斬新な方法を提供します。ペプチドは、心室全体の吻尾軸45沿線をターゲット、脳全体均等に配布されます。さらに、このメソッドは、大人ゼブラフィッシュ脳アミロイドの包有物の NSPCs の形態学的および分子応答を解析できます。このような研究は私たち哺乳類で成功脳修復のため、洞察を提供します。本手法は、失われたニューロンと機能回復の補充を誘導する広告のような症状の後再生が成功応答の必要な分子機構を理解する使用できます。

<table><tbody><tr><td>Fmoc保護アミノ酸</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td></td><td>固相ペプチド合成用Fmocベースのアミノ酸 (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1030</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1180</td><td>ラセミ化抑制剤</td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>IRIS Biotech GmbH (マルクトレドヴィッツ、ドイツ)</td><td>SOL-003</td><td>ベース</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>IRIS Biotech GmbH (マルクトレドヴィッツ、ドイツ)</td><td>SOL-004</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>N-メチルモルホリン</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, ドイツ</td><td>A12158</td><td>ベース</td></tr><tr><td>1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>MERCK KGaA (ダルムシュタット, ドイツ)</td><td>822299</td><td>Fmoc deprotection reagent</td></tr><tr><td>ジクロルメタン (DCM)</td><td>MERCK KGaA (ダルムシュタット, ドイツ)</td><td>106050</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ギ酸 (FA)</td><td>MERCK KGaA (ダルムシュタット, ドイツ)</td><td>100264</td> HPLC トリフルオロ酢酸 (TFA) <td>用緩衝液成分</td></tr><tr><td>MERCK</td> <td>KGaA (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>808260</td><td>Clevage Mixture試薬</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane(TIS)</td><td>MERCK KGaA(ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>233781 ALDRICH</td><td>Clevage Mixture試薬</td></tr><tr><td>アセトニトリル(UPLC/LCMS用)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>アセトニトリル(HPLC用)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>83639.320</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>23811.326</td><td>ペプチド沈殿用溶媒</td></tr><tr><td>Dithiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>0281-25G</td><td>Clevage Mixture reagent</td></tr><tr><td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td><td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td><td>S30023</td><td>SPPS ペプチド合成用固相</td></tr><tr><td>5 ml シリンジ with included filters</td><td>Intavis AG (Cologne,ドイツ)</td><td>34.274</td><td>SPPSおよび固相</td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルター</td>からの開裂用の反応チューブ <td>ザルトリウス・ステッティム(フランス、オーバーニュ)</td><td>11806-50-N</td><td>沈殿ペプチドのろ過ポリ</td></tr><tr><td>フッ化ビニリデン(PVDF)シリンジフィルター</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>ペプチドシンセサイザーIntavis</td><td>、ケルン、ドイツ</td>のためのプレフィルタリング<td>ResPep SL</td><td>自動固相ペプチド合成装置</td></tr><tr><td>Water Alliance HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>半分取逆相高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)</td></tr><tr><td>PolymerX, ビーズサイズ 10&mu;m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. ドイツ</td><td>00G-4328-N0</td><td>多孔質ポリスチレンジビニルベンゼン HPLC カラム</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td><td>LCPAK0001</td><td>浄水システム</td></tr><tr><td>ろ過ユニット</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td><td>16307</td><td>ペプチド沈殿用ろ過ユニット</td></tr><tr><td>UPLC Aquity with UV Detector</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>M09UPA 664M</td><td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18, ビーズサイズ 1.7 &mu;m, 50x2.1 mm</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>186002350</td><td>Analytical C18 カラム</td></tr><tr><td>ACQUITY TQ 検出器</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>QBB908</td><td>エレクトロスプレーイオン化質量分析計 (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td><td>16706, 101542</td><td>Lyophilizer with vaccum</td></tr><tr><td>pump Paradigm plate reader</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB (エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>ベクトン-ディキンソン</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス, ライカ,ツァイス</td><td>メーカー</td><td></td>によって異なります</tr><tr><td>デュモンピンセット</td><td>ワールド精密機器</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>ギリー 解剖鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>501265</td><td></td></tr><tr><td>ガラス注入キャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>世界精密機器</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>空気圧PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>リングイルミネーター。リングライトガイド</td><td>パークランドサイエンティフィック</td><td>ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

アルツハイマー病 (AD) は毒性アミロイド-β42 の積み重ねで (Aβ42) ペプチドはシナプス変性、炎症、神経細胞の死につながる神経変性疾患を衰弱させると学習障害。人間は、神経幹細胞/前駆細胞 (NSPCs) および減らされた神経の増殖能力の障害のため一部広告の場合失われた神経細胞を再生できません。したがって、効率的な再生治療は、増殖を高める必要がありますもと NSPCs。 ゼブラフィッシュ (動脈分布) の神経因性の能力は再生の有機体、設計できるかを基本的な分子プログラムを学ぶことができます。広告に取り組むために治療のアプローチ。このため、ゼブラフィッシュの広告のようなモデルの生成が必要でした。私たちの方法論を使用して、組織の透過能力を持つ大人ゼブラフィッシュ脳に Aβ42 ペプチドの合成誘導体を導入し、病の病理と再生の応答を分析できます。既存のメソッドまたは動物モデル上の利点は、ゼブラフィッシュはどの脊椎動物の脳を自然に再生成でき、したがって内因性の NSPCs より良い人間神経変性疾患の治療に役立つ私たちを教えることができます。したがって、大人ゼブラフィッシュ脳にアミロイド毒性モデルは神経科学と臨床医学の分野で研究のための新しい道を開く可能性があります。また、このメソッドの単純な実行は、コスト効果の高い、効率的な実験的評価できます。本稿では、合成とゼブラフィッシュ脳への Aβ42 ペプチドの注入をについて説明します。

合成ペプチドを浄化するために使用された高速液体クロマトグラフィーと質量分析法は、精製したアミロイド β ペプチドの特徴に使用されています。A β ペプチドの分離を改善するために 50 ° C に加熱した HPLC カラムとすべての画分を採取しました。正しく合成ペプチドを識別するには、すべての画分の質量分析を行った。高精度のクロマト グラムは、化合物の純度を示しています。高精度 (すなわち、必要なアミロイド β ペプチドの比率を充電する正しい質量) に 1 つのピークが得られた HPLC 分画は、さらに実験 (図 2) の処理でした。
総計を形作るにおけるペプチドの機能を評価するには、様々 な分光学的手法39,48,<sup class="...

このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42 ペプチドの注入について説明します。集計。

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

本手法の目的は、アミロイドβ42ペプチドを合成し、成体ゼブラフィッシュの脳内に注入することで、アルツハイマー病に見られるアミロイド蓄積の特定のモデルを構築することです。この手法により、アミロイド毒性が神経幹細胞に及ぼす影響や、このような有害な条件下でどのように若返り反応を誘発できるかなど、神経科学分野における重要な課題に取り組むことが可能になります。本技術の主な利点は、報告されており、再現性があること、そして得られる表現型がヒトの脳におけるアルツハイマー病の状態を強く想起させることです。この手法の意義は、疾患条件下で神経幹細胞を活性化させることができる天然の脊椎動物モデルを提供することにあるため、アルツハイマー病の治療へと展開されます。したがって、ゼブラフィッシュは神経変性をどのように回復させるかを教えてくれる可能性があります。アミロイドベータ 42 ペプチドを調製するために、固相として 500 milligrams の FMOC 保護樹脂を自動ペプチド合成機に充填します。次に、各合成機の計算に基づいた必要量で、0.5 molar に溶解した FMOC 保護アミノ酸を充填します。0.48 Mの濃度になるように、ジメチルホルムアミド（DMF）を用いて活性化剤のHBTUを溶解させます。次に、塩基として45% (v/v)のN-メチルモルホリン（NMM）と、キャッピング混合液として5% (v/v)の無水酢酸をDMFに加えます。調製した試薬をシンセサイザーに充填し、自動合成機を用いてペプチドの固相合成を行います。シンセサイザーでのペプチド合成サイクル完了後、樹脂を反応チューブに移し、以下からなる調製直後の切断混合液10 millilitersを加えてペプチドを切断します。その後、固体支持体を切断混合液中で4時間連続的に混合し、固体支持体からペプチドを切断します。切断混合液を100 millilitersの氷冷ジエチルエーテルに加えることで、切断生成物を沈殿させます。孔径0.45 µmのPTFEフィルターを含むろ過ユニットで溶液をろ過します。次に、フィルターペーパーからろ過されたペプチドを回収します。そして、沈殿したペプチド100 mgをアセトニトリルと脱イオン水の1:1混合溶液5 mLに溶解させ、ボルテックスして粗ペプチドを溶解させます。次に、逆相HPLCを用いてペプチドを精製するため、粒子径10 $\mu$mの多孔性ポリスチレン-ジビニルベンゼンカラムを装着したセミプレパレイティブHPLCを用意します。カラム加熱ユニットを使用してカラムを予熱し、50 °Cに維持します。ペプチドをカラムに適用し、自動分画回収装置を用いてすべての主要画分を回収します。25分間で4 mL/minの流速にて、5%から100%のアクリロニトリルのグラジエントを適用します。クロマトグラムを22

modeling-amyloid-42-toxicity-neurodegeneration-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この動画では、受精したゼブラフィッシュの胚を実体顕微鏡で解体した後、コレステロール合成阻害剤を照射することで、幼虫の血管破裂や脳出血を発症させています。明確な赤い斑点で識別できる出血性の幼虫は、その後、さらなる分析のために顕微鏡下で分離されます。...

ゼブラフィッシュ幼生における薬物誘発性出血のモデリング

このビデオは、単量体のアミロイドペプチドを成体のゼブラフィッシュの前脳に注入してアミロイド毒性を発生させる手順を示しています。これは、アルツハイマー病で見られるニューロンの損傷を模倣しています...

アミロイドペプチド注入によるゼブラフィッシュ脳のアルツハイマー病モデルの確立

ここでは、生理的に、関連する高感度で特異的な開発のための体系的なアプローチを提示...

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

個々の細胞に指向性ストレスや死を引き起こすための標的操作は、達成するのが比較的困難でした。ここでは、細胞培養および生きた動物の個々の細胞を選択的にストレスを与えて死滅させるための単一細胞分解能アブレーションアプローチについて、標準的な共焦点UVレーザーに基づいて説明します。...

従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

この研究では、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖モデルを確立する方法について説明します。この目的は、構成的および傷害誘発性の神経発生のような生理学的過程に対する高血糖の影響を調べることである。この研究では、PET / CTを用いて放射標識分子（ここでは、[ 18 F] -FDG）を追跡するためのゼブラフィッシュの使用法が強調されています。...

ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

認知能力を評価するために設計された行動室を提示します。ゼブラフィッシュは、一度取得すると、8週間後にタスクを覚えていることを示すデータを提供します。我々はまた、高血糖ゼブラフィッシュが認知能力を変化させたことを示し、このパラダイムが認知と記憶を評価する研究に適用されることを示す。...

ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

私たちは、成人ゼブラフィッシュのマルマルー重量降下モデルを変更し、鈍力外傷性脳損傷(TBI)とその後の神経再生の基礎となるメカニズムに続く幅広い病理を調べた。この鈍力TBIモデルはスケーラブルであり、軽度、中等度、または重度のTBIを誘導し、ヒトTBIで観察された傷害の不均一性を再現する。...

成虫ゼブラフィッシュにおける鈍力損傷の影響を研究するスケーラブルモデル

学習と記憶は、発達障害、疾患依存性、または環境に依存する認知障害の研究において強力な指標です。ほとんどの認知評価には、特殊な機器と広範な時間のコミットメントが必要です。しかし、シャトルボックスアッセイは、従来のゲルボックスを利用して、成体ゼブラフィッシュ認知の迅速かつ信頼性の高い評価を行う自動調整学習ツールです。...

成人ゼブラフィッシュを用いた学習・記憶研究における認知評価のための連想学習ツールとしてのシャトルボックスアッセイ

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫モデルの脳室領域へのリポ多糖のマイクロインジェクションを実証し、結果として生じる神経炎症反応と神経毒性を研究します。...

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

現在のプロトコルの目標は、成魚のゼブラフィッシュの社会的選好アッセイを確立して使用するために必要な手順を概説し、エタノール誘発性の社会的欠陥を特徴付けるために使用できることを実証することです。...

ゼブラフィッシュの胎児アルコールスペクトラム障害をモデル化して、不利な胚環境が成体の社会行動に与える影響を特徴付ける

行動分析および高濃度画像を用いたゼブラフィッシュ幼虫におけるドーパミン作動性神経変性のin vivo表現型解析

学ぶ アミロイド-β42ペプチドの合成と成体ゼブラフィッシュ脳への注入法。神経幹細胞に対するアミロイド毒性の影響と再生応答を探索し、アルツハイマー病モデルを構築する再現性の高い手法です。

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

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