野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量

本手法の全体的な目的は、HPLC分析を用いて、野生型およびCMAHノックアウトマウスの肝臓および乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルノイラミン酸を検出することです。この方法は、糖科学の分野における疑問、具体的にはCMAHマウスモデルの遺伝子型がこれらの動物の実際のシアル酸含量に及ぼす影響を明らかにすることに役立ちます。遺伝的スクリーニングと比較して本手法が持つ主な利点は、ヘテロ接合体マウスについても相対的なシアル酸レベルを決定できることです。

本手法の評価は、当研究室の大学院生であるCui CaoとWang Wenjiaoが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、CMAHノックアウトマウスからマウス乳およびマウス肝組織を回収し、本手順を開始してください。乳からシアル酸を単離するには、50 µLの乳を1.5 mL centrifuge tubeに移し、調製した酢酸水溶液1.2 mLを加えます。

肝組織からシアル酸を単離するには、20～50 mgのマウス肝臓を緩慢に解凍し、ダウンス式組織ホモジナイザーに移します。1.2 mLの水性酢酸溶液を加え、緩やかな剪断によって10秒間組織をホモジナイズします。得られた懸濁液を1.5 mL遠心チューブに移します。

次に、酸性化した乳または組織懸濁液を80°Cで4時間インキュベートします。その後、サンプルを14,000 ×gで10分間遠心分離します。上清の上層1000 µLを、新しい1.5 mL遠心チューブに移します。

室温で遠心蒸発を行い、溶媒を除去して完全に乾燥させます。サンプルを500 µLの蒸留水で再溶解させます。次に、コック付きの空の3 mLチューブに、サンプルあたり200 mgのアニオン交換樹脂を移し、マイクロアニオン交換カラムを調製します。

樹脂中の塩化物イオンを酢酸イオンに置換するため、2 millilitersの酢酸水溶液を加えます。溶媒が樹脂の上端に達した直後にストップコックを閉じます。2 millilitersの蒸留水を静かに加え、ストップコックを開きます。

溶媒の大部分が樹脂の最上部に達した時点で、すぐにフローを停止させます。樹脂が常に溶媒で覆われていることを確認してください。その後、過剰な酢酸を除去するため、2 mLの蒸留水を用いて樹脂カラムをさらに2回洗浄します。

得られた500 µLのサンプル溶媒を樹脂カラムに移し、通り抜けた液（フロースルー）を廃棄します。2 mLの蒸留水で樹脂を穏やかに洗浄します。1 mLの50 mM酢酸アンモニウム溶液を用いて、樹脂からサンプルアニオンを1.5 mL遠心チューブに溶出させます。

室温で遠心蒸発させ、溶媒を完全に除去して乾燥させる。分析天秤を用いて 5 〜 8 mg の N-Acetylneuraminic acid を量り取り、1.5 mL 遠心チューブに入れる。正確な重量を記録し、1 mg あたり 164 µL の蒸留水を加える。

N-グリコリルノイラミン酸を、1 mgずつの分注品など、適正価格で少量入手します。化合物に蒸留水を154 µL直接加え、約20 mMのNeu5Gcストック溶液を作成します。この溶液を1.5 mL遠心チューブに移します。

この溶液は-20 °Cで最大12ヶ月間保存可能です。各ストック溶液から5 µLずつを、新しい1.5 mL遠心チューブに合わせます。次に、室温で遠心蒸発させ、溶媒を完全に除いて乾燥させます。

マウスミルク、マウス肝臓、または混合シアル酸標準物質から得られたシアル酸試料に、OPD溶液を20 µL加えます。試料を30秒間激しくボルテックスします。その後、試料を暗所で80 °Cにて4時間インキュベートします。

サンプルを5分間冷却した後、80 µLの蒸留水を加えます。次に、チューブを14,000 ×gで1分間遠心分離します。その後、上清から80 µLを300 µL高回収HPLCバイアルに移します。

誘導体化されたシアル酸試料は、4～6°Cで最大1週間保存可能です。オンライン蛍光検出器を備えた標準的なHPLCシステムを用いて試料を分析します。分析には、長さ250 mm、直径4.6 mmの逆相C18カラムを使用してください。

溶媒Aおよび溶媒Bを調製し、プロトコルに従ってHPLCのランを設定した後、50 µLのサンプルをHPLCシステムに注入します。蛍光検出器を用い、励起波長373 nm、蛍光波長448 nmで溶出液をモニタリングします。最後に、テキストプロトコルに記載されている方法でNeu5Gcの相対量を算出します。

ここでは、ホモ接合体ノックアウトCMAHマウスおよびヘテロ接合体ノックアウトCMAHマウス由来の乳試料から得られた、蛍光標識シアル酸の代表的なHPLCクロマトグラムを示しています。野生型マウスの結果も併せて示しています。同様に、マウス肝臓由来の蛍光標識シアル酸のクロマトグラムをここに示します。

Neu5Gcの相対量を比較すると、CMAHホモ接合体ノックアウトマウスにはNeu5Gcが含まれていないのに対し、CMAHヘテロ接合体ノックアウトマウスおよび野生型マウスには10〜75%のNeu5Gcが含まれていることがわかります。手順を適切に行い、習熟すれば、サンプル調製は8時間以内に完了できます。また、サンプルはHPLCオートサンプラーを用いて一晩かけて分析することが可能です。

本手順を行う際は、シアル酸の単離と誘導体化の手順を同日に行うことが重要です。本手順の後、得られた蛍光信号の性質を確認するために、質量分析などの他の手法を実施することができます。本技術の開発により、研究者は生物学的試料におけるシアル酸の分布を探索することが可能になります。

濃縮酢酸およびギ酸の取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常に保護具の着用などの予防措置を講じてください。