Name: 野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量 CMAHノックアウトマウス。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぼう HPLCを用いたマウス肝臓・乳汁中のシアル酸定量法。CMAHノックアウトマウスの遺伝子型別シアル酸レベル変化を解析し、グライコサイエンス研究に貢献します。

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この研究は、中国の自然科学財団（助成金番号31471703、A0201300537および31671854、JVおよびLL）および100の外国人才能計画（助成番号JSB2014012からJV）によって部分的に支持された。

動物被験者に関する手順は、SPFに収容された動物を用いて、実験的動物福祉に関する国家ガイドライン（科学技術省、中国、2006年）に従って、南京農業大学の実験動物センターの倫理委員会によって承認されている施設（許可ID：SYXK-J-2011-0037）。 1. Cmahノックアウトマウスモデル<ol><li>揚州大学（中国）の比較医学センターの野生型C57Bl / 6マウスを使用する。 注：CMAHノックアウトマウスもあるCMAH遺伝子のエクソン6から92個の塩基対を除去することによって商業的にCRISPR / Cas9 20ストラテジーを使用して前CMAHノックアウト研究17、19及び得られたのから提供された情報に基づいて生成されましたヒトCMAH遺伝子で欠失している19 。正のF 0 &lt;/サブ&gt; -mice（2人）は、ヘテロ接合F 1 -miceを得るために、野生型マウスと交配しました。ヘテロ接合F 1 -mice（5個体）と交差した後、ホモ接合CMAHノックアウトF 2 -mice正常（3個体）を得ることができました。 </li><li> 市販のDNA精製キットを用いて、Zangala 21で示される方法に従ってゲノムDNAを用いてマウスの遺伝子型決定を行う。 <ol><li>市販のDNAポリメラーゼおよびプライマー対5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;および5&#39;tttaaagtcccgggtgagaagc3&#39;を用いて、 Cmah遺伝子の対応するDNA断片を増幅する。 94℃で40秒間の変性、63℃で40秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸長からなる34回のPCRサイクルを用いて遺伝子増幅を行う。 </li><li> PCR産物を1％アガロースゲルで視覚化する。野生型個体については単一のバンド（0.5kb）を、野生型個体については二重バンド（0.4および0.5kb）を観察すべきである。ヘテロ接合性ノックアウト個体、およびホモ接合性ノックアウト個体の単一バンド（0.4kb）を含む。 </li></ol></li></ol> 2.サンプル収集<ol><li> Willingham らによって記載されたプロトコルを用いてマウスミルクを収集する。 22 。 </li><li>ゴンザレス（Gonçalves） らによって記載されたプロトコールを用いてマウス肝臓組織を収集する。 -80℃で23や店舗サンプル。 </li></ol>ミルクからのシアル酸の単離<ol><li>蒸留H 2 Oの88ミリリットルに氷酢酸12ミリリットルを添加することにより、2 M酢酸溶液100mLを調製</li><li>ミルク50μLを1.5 mL遠心チューブに移し、調製した酢酸水溶液1.2 mLを加えます。 </li><li>懸濁液を80℃で4時間インキュベートし、14,000 xgで10分間遠心する。 </li><li>上清のトップ1,000μLを新鮮な1.5mL遠心分離管に移し、rem室温で遠心蒸発によって溶媒を除去して乾燥させる（付着した真空ポンプに応じて、これは4〜20時間かかる）。蒸留H 2 Oの500μlのサンプルを再溶解</li><li> マイクロ陰イオン交換カラムを準備する。この工程は、アニオン性化合物を特異的に富化し、カゼインおよび中性化合物をミルクおよび肝臓サンプルから除去し、したがってシアル酸誘導体化のための蛍光発生OPD標識剤の選択性を増加させる。 <ol><li>陰イオン交換樹脂（Dowex 1X8）200 mgを空の3 mLカラムチューブに移して、それぞれのサンプルを移します。 </li><li>ステップ3.1で調製した2mLの酢酸水溶液を加えて、樹脂中の塩化物イオンを酢酸イオンで置換する。溶剤が樹脂の上部に達するとすぐに、コックを閉じます。 </li><li>優しく、蒸留H 2 Oの2 mLを加えストップコックを開いて、すぐに溶媒に達するの最もとして流れを止めます樹脂の頂部。樹脂が常に溶媒で覆われていることを確認してください。 </li><li>過剰の酢酸を除去するための蒸留H 2 O 2mLで樹脂カラムを2回洗浄します。 </li></ol></li><li>ステップ3.4のサンプル溶媒を500μL移します。樹脂カラム上に流し、フロースルーを廃棄する。穏やか1.5mLの中に50mMの酢酸アンモニウム溶液（蒸留H 2 O 100mLに溶解し、酢酸アンモニウムの386 mg）を1mLのを用いて蒸留H 2 Oで溶出2mLで樹脂からサンプルアニオンを樹脂を洗浄遠心チューブ。室温で遠心蒸発によって溶媒を除去して乾燥させる。 注：乾燥サンプルは、4〜6℃で12ヶ月まで保存できます。 </li></ol>肝臓組織からのシアル酸の単離<ol><li>マウス肝臓20〜50 mgを静かに解凍し、Dounce組織粉砕機（1 mLまたは2 mLの容量）に移します。 1.2mLの酢酸水溶液ステップ3.1で調製し、10秒間穏やかに剪断することによって組織をホモジナイズする。得られた懸濁液を1.5mLの遠心管に移す。 </li><li>ステップ3.3に従ってください。 3.6まで。 注：乾燥サンプルは、4〜6℃で12ヶ月まで保存できます。 </li></ol> 5.混合シアル酸標準液の調製<ol><li>分析用天秤に5〜8mgのN-アセチルノイラミン酸を1.5mL遠心分離管に量り入れる。正確な重量に注意し、各mgについて164μLの蒸留H 2 Oを加える（ すなわち 、Neu5Acの重量が7.2mgである場合、7.2x164 =1,181μLの蒸留H 2 Oを加える）。この結果、20mM Neu5Acストック溶液が得られ、-20℃で最大12ヶ月保存することができます。 </li><li> 1mgアリコートなどの中程度の価格で、より少量のN-グリコリルノイラミン酸を得る。約20mMのNeu5Gcストック溶液を得るために、154μLの蒸留H 2 Oを化合物に直接添加する。転送する1.5mLの遠心チューブに加えた。この溶液は、-20℃で最大12ヶ月間保存することができます。 </li><li>ステップ5.1および5.2の各ストック溶液から5μLを新鮮な1.5mL遠心分離チューブに混合し、室温で乾燥させる遠心蒸発によって溶媒を除去する。 注：混合シアル酸標準は、4〜6℃で最大12ヶ月間保存することができます。 </li></ol>シアル酸の蛍光誘導体化<ol><li> 100mLのo-フェニレンジアミンおよび208mgの亜硫酸水素ナトリウムからなる10mLのOPD溶液を10mLの蒸留H 2 O中に調製する。 </li><li>マウスミルク（ステップ3）、マウス肝臓（ステップ4）、または混合シアル酸標準（ステップ5）に由来するシアル酸サンプルに20μLのOPD溶液を加える。 30秒間激しくボルテックスし、サンプルを暗所で80℃で4時間インキュベートする（ すなわち 、マイクロチューブをアルミニウム箔で包む）。 </li><li>サンプルを5分間冷却し、80μ、蒸留H 2 OのL 1分間14,000×gでチューブを遠心分離。 </li><li>上清から80μLを300μL高回収率HPLCバイアルに移す。誘導体化されたシアル酸サンプルは、4〜6℃で最大1週間保存することができます。 </li></ol>シアル酸誘導体のHPLC分析<ol><li>オンライン蛍光検出器に接続された標準HPLCシステムを使用してサンプルを分析する。 </li><li>分析には、長さ250mm、直径4.6mmの標準寸法の逆相C18カラムを使用します。 </li><li> 200mLのストック溶液を800mLのLCMSグレード水で希釈することにより溶媒Aを調製する（LCMS-液体クロマトグラフィー質量分析法）。原液自体は以下のように調製することができる： <ol><li> 46gのギ酸を800mLのLCMSグレードのH 2 Oに加える。 </li><li>水酸化アンモニウム溶液（puriss.pa）を滴下してpHを4.5に調整する。 </li><li>溶媒をLCMSグレードのH 2 Oで1,000mLまで充填してください。このストック溶液は、4〜6℃で3ヶ月まで保存できます。 </li></ol></li><li>溶媒Bについては、LCMS級アセトニトリルを使用します。 </li><li> 次の勾配溶離を用いて1mL /分の流速でシアル酸誘導体を分離する： <ol><li>まず溶剤Aに混合した溶剤Bを10％加える。 </li><li> 0分から15分まで、直線勾配で60％まで溶媒Bの割合を徐々に増加させる。 </li><li> 15分から16分まで、溶媒Bの割合を60％から90％の直線勾配で急速に増加させる。これにより、HPLCカラムの洗浄​​が開始される。 </li><li> HPLCカラムをさらに洗浄するには、溶媒Bのレベルを16分〜18分の間に90％に保ち、その後溶媒Bのレベルを18分〜19分の間に徐々に10％に徐々に低下させる。 </li><li> HPLCカラムを19〜24分の10％Bの開始条件に再平衡させる。 </li></ol></li><li>に50μLのサンプルをHPLCシステムに注入する。 </li><li> 373 / 488nmの蛍光検出器励起/発光波長を用いて溶離液をモニターし、誘導体化されたシアル酸は、約9分（Neu5Gc-OPDについて）および10分（Neu5Ac-OPDについて）の予想保持時間で期待することができる。 </li><li> F Neu5Gc [％] = 100×A Neu5Gc /（A Neu5Ac + A Neu5Gc ）のように、Neu5Ac（A Neu5Ac ）およびNeu5Gc（A Neu5Gc ）の蛍光ピーク面積からのNeu5Gc（F Neu5Gc ）の相対量を計算する。ヘテロ接合性及び野生型マウスのF のNeu5Gcの値はマウスの年齢と2％の間の組織のタイプ（に応じて広範囲に変化し得るのに対し、ホモ接合CMAHノックアウトマウスからミルクおよび肝臓のサンプルの場合にはF のNeu5Gcは 、0％であるべきですおよび&gt; 90％）、予測誤差マージンは±12％です。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

本明細書に提示されたプロトコールは、乳及び肝臓試料のNeu5Gcの相対量を分析及び定量することにより、ホモ接合Cmahノックアウトマウスの表現型評価を可能にする。分析は、蛍光検出を伴う標準的なHPLC設定を用いて行った。この手順の最も重要なステップは、陰イオン交換カラムの調製および陰イオン交換クロマトグラフィーの実施である。樹脂を適切に沈殿させ、適切な洗浄および溶出画分を集めることは、少しの練習を要する。 あるいは、本明細書で使用する誘導体化剤OPDは、より高価な誘導体化剤DMB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン）で容易に置換することができる。さらに、得られたシアル酸誘導体を工程6.5から分析した。蛍光検出（ すなわち 、MS-2020検出器と結合したShimadzu Nexera UPLCシステム）の代わりに質量分析検出を用いて分析することもできる。 Aステップ7.2-7.6を適用すると、382.0および398.0のm / z比（これらはそれぞれ、Neu5Ac-OPDおよびNeu5Gc-OPDのH + -</sup...

N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）は、ほとんどの哺乳動物において最も一般的なシアル酸である1 。内因性のNeu5Acを合成することができるが、人間が原因CMP-Neu5Acをヒドロキシラーゼ2、3 CMAHをコードする遺伝子上の主要エクソン欠失へのNeu5Gcを産生することができません。しかし、動物性食品は、抗のNeu5Gc抗体の産生につながるのNeu5Gc 4、5、6の栄養源となり、したがってのNeu5Gc 7に対する免疫応答を誘発することができます。 Neu5Gcこの食物効果は、慢性炎症および種々の他の疾患8、9、10に寄与することが疑われます。 hでのNeu5Gcの効果を包括的に理解するために食品由来のシアル酸の影響を体系的に研究するための動物モデルが非常に望ましい。ノックアウトマウスの解析のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくプロトコールは十分に確立されており、遺伝子型評価のための簡便な方法であるが、代謝レベルでの表現型の機能解析にはより特異的な分析方法が必要である。 Cmahノックアウトマウスモデルの表現型は、肝臓または乳試料中のシアル酸の組成物を単離および分析することによって評価することができる。シアル酸をレゾルシノール11またはチオバルビツール酸12と反応させると、発色団生成物が形成され、プレートリーダベースの設定を用いて簡単に分析することができるが、シアル酸のみを分析することができる酸含量を決定することができる。あるいは、シアル酸の分析は、ガスクロマトグラフィー13 、MALDI-ToF質量分析14または電流測定法15 。しかし、最も一般的に適用されるシアル酸分析方法は、加水分解放出に基づく蛍光誘導体化およびその後の高速液体クロマトグラフィー16、17、18が続きます。

<table><tbody><tr><td>化学薬品:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルノイラミン酸</td><td>シグマ</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>N-グリコリルノイラミン酸</td><td>シグマ</td><td>50644</td><td>1 mgアリコートは十分でなければなりません</td></tr>o<tr><td>-フェニレンジアミン</td><td>シグマ</td><td>694975</td><td></td></tr>亜<tr><td>硫酸水素ナトリウム</td><td>J&K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>ツール/材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL SPEチューブ</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td>空<td>固相抽出カラム</td></tr><tr><td>SPEチューブの流れを停止するための</td><td>ルアーストップコック</td><td>シグマ</td><td>S7396</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400メッシュ</td></tr><tr><td>ダウンスティッシュグラインダー</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>tight fit</td></tr><tr><td>HPLC Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>HPLC用蛍光検出器</td><td>島津</td>製作所 <td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>Phenomenex</td><td>HypercloneODS</td><td>250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>LCMS グレード H2O</td><td>Merck Millipore</td> <td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS グレード アセトニトリル</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hypergrade</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss. P.a.</td></tr></tbody></table>

野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量<em&gt; cmah</em&gt;ノックアウトマウス。

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH（シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ）は、哺乳動物におけるシチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸の酸化を担う。しかしながら、ヒトは、 CMAH遺伝子の一次エクソン欠失のために、シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸をシチジンモノホスフェート-N-グリコリルノイラミン酸に酸化することができない。 CMAH活性の欠如の影響および影響をより詳細に理解するために、マウスにおけるCmahノックアウトモデルは、基礎および応用研究に非常に興味深い。このマウスモデルの表現型を決定するための分析方法は、本明細書中に詳細に記載されており、野生型およびCmahノックアウトマウスの肝臓および乳汁中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の両方の検出に基づく。内因性シアル酸は、放出され、o-フェニレンジアミンで誘導体化されて蛍光発生誘導体を生成し、その後、HPLCによって分析することができる。提示されたプロトコルは、様々な他の起源の乳および組織サンプルの分析にも適用され、N-グリコリルノイラミン酸の栄養および健康への影響を調査するのに有用である可能性がある。

記載された分析方法の概略図は図1に示されており、野生型およびCmahノックアウト突然変異体マウスの乳および肝臓サンプルからのシアル酸の単離およびこれらの成分の蛍光誘導体化およびHPLC分析が含まれる。 図2および図3は、ホモおよびヘテロ接合ノックアウトCmahマウス（ - / - および+/-）および野生型マウス由来の乳および肝臓試料の誘導体化シアル酸の代表的なHPLCクロマトグラムを示す。 図4は、HPLCピーク面積から計算した分析マウス試料のN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）の相対量を示す。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/f...

我々は、マウス肝臓および牛乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の定量のためのHPLCベースの方法を記載する。

野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量<em&gt; CMAH</em&gt;ノックアウトマウス。

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

本手法の全体的な目的は、HPLC分析を用いて、野生型およびCMAHノックアウトマウスの肝臓および乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルノイラミン酸を検出することです。この方法は、糖科学の分野における疑問、具体的にはCMAHマウスモデルの遺伝子型がこれらの動物の実際のシアル酸含量に及ぼす影響を明らかにすることに役立ちます。遺伝的スクリーニングと比較して本手法が持つ主な利点は、ヘテロ接合体マウスについても相対的なシアル酸レベルを決定できることです。本手法の評価は、当研究室の大学院生であるCui CaoとWang Wenjiaoが行います。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、CMAHノックアウトマウスからマウス乳およびマウス肝組織を回収し、本手順を開始してください。乳からシアル酸を単離するには、50 µLの乳を1.5 mL centrifuge tubeに移し、調製した酢酸水溶液1.2 mLを加えます。肝組織からシアル酸を単離するには、20～50 mgのマウス肝臓を緩慢に解凍し、ダウンス式組織ホモジナイザーに移します。1.2 mLの水性酢酸溶液を加え、緩やかな剪断によって10秒間組織をホモジナイズします。得られた懸濁液を1.5 mL遠心チューブに移します。次に、酸性化した乳または組織懸濁液を80°Cで4時間インキュベートします。その後、サンプルを14,000 ×gで10分間遠心分離します。上清の上層1000 µLを、新しい1.5 mL遠心チューブに移します。室温で遠心蒸発を行い、溶媒を除去して完全に乾燥させます。サンプルを500 µLの蒸留水で再溶解させます。次に、コック付きの空の3 mLチューブに、サンプルあたり200 mgのアニオン交換樹脂を移し、マイクロアニオン交換カラムを調製します。樹脂中の塩化物イオンを酢酸イオンに置換するため、2 millilitersの酢酸水溶液を加えます。溶媒が樹脂の上端に達した直後にストップコックを閉じます。2 millilitersの蒸留水を静かに加え、ストップコックを開きます。溶媒の大部分が樹脂の最上部に達した時点で、すぐにフローを停止させます。樹脂が常に溶媒で覆われていることを確認してください。その後、過剰な酢酸を除去するため、2 mLの蒸留水を用いて樹脂カラムをさらに2回洗浄します。得られた500 µLのサンプル溶媒を樹脂カラムに移し、通り抜けた液（フロースルー）を廃棄します。2 mLの蒸留水で樹脂を穏やかに洗浄します。1 mLの50 mM酢酸アンモニウム溶液を用いて、樹脂からサンプルアニオンを1.5 mL遠心チューブに溶出させます。室温で遠心蒸発させ、溶媒を完全に除去して乾燥させる。分析天秤を用いて 5 〜 8 mg の N-Acetylneuraminic acid を量り取り、1.5 mL 遠心チューブに入れる。正確な重量を記録し、1 mg あたり 164 µL の蒸留水を加える。N-グリコリルノイラミン酸を、1 mgずつの分注品など、適正価格で少量入手します。化合物に蒸留水を154 µL直接加え、約20 mMのNeu5Gcストック溶液を作成します。この溶液を1.5 mL遠心チューブに移します。この溶液は-20 °Cで最大12ヶ月間保存可能です。各ストック溶液から5 µLずつを、新しい1.5 mL遠心チューブに合わせます。次に、室温で遠心蒸発させ、溶媒を完全に除いて乾燥させます。マウスミルク、マウス肝臓、または混合シアル酸標準物質から得られたシアル酸試料に、OPD溶液を20 µL加えます。試料を30秒間激しくボルテックスします。その後、試料を暗所で80 °Cにて4時間インキュベートします。サンプルを5分間冷却した後、80 µLの蒸留水を加えます。次に、チューブを14,000 ×gで1分間遠心分離します。その後、上清から80 µLを300 µL高回収HPLCバイアルに移します。誘導体化されたシアル酸試料は、4～6°Cで最大1週間保存可能です。オンライン蛍光検出器を備えた標準的なHPLCシステムを用いて試料を分析します。分析には、長さ250 mm、直径4.6 mmの逆相C18カラムを使用してください。溶媒Aおよび溶媒Bを調製し、プロトコルに従ってHPLCのランを設定した後、50 µLのサンプルをHPLCシステムに注入します。蛍光検出器を用い、励起波長373 nm、蛍光波長448 nmで溶出液をモニタリングします。最後に、テキストプロトコルに記載されている方法でNeu5Gcの相対量を算出します。ここでは、ホモ接合体ノックアウトCMAHマウスおよびヘテロ接合体ノックアウトCMAHマウス由来の乳試料から得られた、蛍光標識シアル酸の代表的なHPLCクロマトグラムを示しています。野生型マウスの結果も併せて示しています。同様に、マウス肝臓由来の蛍光標識シアル酸のクロマトグラムをここに示します。Neu5Gcの相対量を比較すると、CMAHホモ接合体ノックアウトマウスにはNeu5Gcが含まれていないのに対し、CMAHヘテロ接合体ノックアウトマウスおよび野生型マウスには10〜75%のNeu5Gcが含まれていることがわかります。手順を適切に行い、習熟すれば、サンプル調製は8時間以内に完了できます。また、サンプルはHPLCオートサンプラーを用いて一晩かけて分析することが可能です。本手順を行う際は、シアル酸の単離と誘導体化の手順を同日に行うことが重要です。本手順の後、得られた蛍光信号の性質を確認するために、質量分析などの他の手法を実施することができます。本技術の開発により、研究者は生物学的試料におけるシアル酸の分布を探索することが可能になります。濃縮酢酸およびギ酸の取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常に保護具の着用などの予防措置を講じてください。

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