トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング
2017年7月26日
Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。
このスクリーニング手順の全体的な目標は、Toll様受容体シグナル伝達を阻害できる新規の生理活性ナノ粒子を特定することです。この方法は、自然免疫細胞のToll様受容体シグナル伝達を標的とする新規ナノ阻害剤を物理的に同定するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で堅牢であり、レポーター細胞システムを使用して簡単に実行できることです。
この技術の応用は、Toll様受容体シグナル伝達がこれらの疾患の病因に関与していることがわかっているため、多くの炎症性疾患の治療にまで及びます。この方法は、金ナノ粒子に対する高度なスクリーニングを提供できますが、他のナノ粒子システムや治療用小分子、バイオロジーにも適用できます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように培地を準備します。
次に、100ミリリットルの超高純度エンドトキシンフリーの水をきれいな125ミリリットルのガラスフラスコに加えます。分泌された胚性アルカリホスファターゼ基質粉末を1袋加え、溶液が完全に溶解するまで穏やかに渦巻かせます。摂氏37度で1時間インキュベートし、基質が完全に溶解することを確認します。
0.2マイクロメートルのメンブレンを使用して、溶液をろ過します。使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。次に、25ミリリットルの超高純度エンドトキシンフリー水が入った50ミリリットルの遠心分離チューブに、ルシフェラーゼ基質粉末の1袋を追加します。
粉末が完全に溶解した後、使用する準備ができるまで摂氏4度で最大1週間保管してください。次に、テキストプロトコルに概説されているように、他のすべての試薬のストック溶液を調製します。細胞を培養して調製した後、培養フラスコから遠心チューブに移します。
細胞をGの300倍で5分間スピンダウンします。次に、それらをR-10培地に1 X 10の濃度で1ミリリットルあたり6細胞に再懸濁します。PMA溶液のアリコートを細胞懸濁液に添加し、最終濃度が50ナノグラム/ミリリットル
になるようにします。細胞懸濁液を滅菌試薬リザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェル平底培養プレートの各ウェルに移します。細胞培養インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートします。
この後、真空吸引器を使用して、培地を慎重に取り出します。倒立顕微鏡を使用して細胞をチェックし、誘導されたマクロファージがウェルの底に付着していることを確認します。各洗浄でウェルあたり100マイクロリットルのPBSを使用して細胞を2回穏やかに洗浄します。
次に、100マイクロリットルの新鮮なR-10培地を各ウェルに加えます。レポーターアッセイを行う前に、細胞を摂氏37度のインキュベーターで2日間休ませます。まず、テキストプロトコルに概説されているように、最適なLPS用量を決定します。
次に、180 マイクロリットルの温めた Quanti-Blue 溶液を、新しい 96 ウェル平底プレートの各ウェルに加えます。次に、各サンプルから20マイクロリットルの上清をプレートに移します。摂氏37度で1〜2時間インキュベートして、色がピンクから濃い青に発達するのを待ちます。
光学密度が1を超えたら、プレートリーダーを使用して655ナノメートルでの吸収を決定します。IRF活性化の分析を開始するには、各サンプルから10マイクロリットルの新鮮な上清を新鮮な96ウェルの透明な平底の白いプレートに移します。自動注入を使用して、各ウェルに50マイクロリットルのルシフェラーゼ溶液を追加します。
次に、すぐに発光をウェルごとに収集して線量反応曲線を作成し、ナノ粒子スクリーニングに最適なLPS濃度を決定します。次に、1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブ内の20容量のペプチド-GMPハイブリッド溶液をGの18,000倍で30分間遠心分離します。上清を慎重に捨てます。
ハイブリッドを1本の新しいチューブに移し、1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。この後、洗浄したハイブリッドを1容量のR-10培地に再懸濁します。濃縮ハイブリッドとR-10培地を含むLPSを等量混合し、ハイブリッドとLPSの最終濃度がそれぞれ100ナノモルと10ナノグラム/ミリリットルになるようにします。
次に、マクロファージ培養プレートから培地を取り出します。100マイクロリットルのハイブリッドLPS混合物を各ウェルに、各条件に対して3回の繰り返しで加えます。ネガティブコントロールとLPSコントロールを含めます。
摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、各ウェルの培地を別々の遠心分離チューブに移します。チューブをGの18, 000倍、摂氏4度で30分間遠心分離します。
上清を新しい96ウェルの丸い底板に移します。これらのサンプルでレポーターアッセイを開始するには、新しい96ウェル平底プレートの各ウェルに180マイクロリットルの予熱済みQuanti-Blue溶液を加えます。次に、各サンプルから20マイクロリットルの上清をこのプレートに移します。
37°Cで1〜2時間インキュベートし、濃い青色が光学密度1を超えるまで成長させます。この後、プレートリーダーを使用して、655ナノメートルでの吸収を記録します。次に、各サンプルから10マイクロリットルの新鮮な上清を96ウェルの透明な平底の白いプレートに移します。
自動インジェクターを使用して、各ウェルに50マイクロリットルのルシフェラーゼ溶液を追加し、すぐにウェルごとに発光を記録します。次に、潜在的な候補の阻害効果を検証し、テキストプロトコルに概説されているTLR特異性を評価します。この研究では、NF-Kappa B AP1の活性化は、LPSによるTLR-4の活性化がNF-Kappa B AP1の活性化とSEAPの生成をもたらすSEAP比色アッセイによって検出されます。
放出されたSEAPは基板を変換し、刺激時に放出されるSEAPの量に比例した色の変化を引き起こします。これは、655ナノメートルの吸光度を測定することで定量化されます。次に、LPSを介したIRFの活性化により、ルシフェラーゼが発現し、基質が触媒されて発光が生じました。
これらの用量反応から、1ミリリットルあたり10ナノグラムの最適なLPS濃度が決定され、以前に確立されたペプチド-GMPハイブリッドのライブラリーをスクリーニングします。このことから、NF-Kappa B AP1とIRFの両方について、LPSトリガーの活性化を阻害する強力な能力について、ハイブリッドのグループが特定されます。この阻害活性の検証は、LPSの濃度が増加すると、ハイブリッドの阻害効果が予想通り減少することを示しています。
その後、阻害活性を確認するためにイムノブロッティングを行います。リードハイブリッドは、p65リン酸化を減少させ、I-Kappa Bα分解を阻害し、IRF3リン酸化を遅らせることが見られ、リードハイブリッドP12がLPSを介したTLR-4シグナル伝達を阻害できることが確認されています。さらなる調査では、P12はTLR-2およびTLR-5を介したNF-Kappa B AP1シグナル伝達、およびTLR-3を介したIRF活性化も減少させることが明らかになり、P12が複数のTLR経路に対して強力な阻害活性を有することが示唆されています。
この手順に続いて、スクリーニング結果を検証し、偽陽性の発見を避けるために、イムノブロッティングや細胞毒性アッセイなどの他の手段を実施する必要があります。この技術は、その開発後、ナノメディシンの分野の他の研究者が、次世代の情報治療薬として、Toll様受容体シグナル伝達におけるナノ阻害剤を探求する道を開きました。
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概要
本記事では、toll-like receptor (TLR) シグナル伝達を抑制する新規の生物活性ナノ粒子の同定を目的としたスクリーニング手順について解説します。この手法では、迅速かつ堅牢で実施が容易なTHP-1細胞ベースのリポーターシステムを利用しており、炎症性疾患における治療への応用に適しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- ナノテクノロジー
背景
- Toll様受容体シグナル伝達は、さまざまな炎症性疾患に関与しています。
- 生理活性ナノ粒子は、TLR応答を調節することで治療上の利益をもたらす可能性があります。
- THP-1細胞は、潜在的な阻害剤をスクリーニングするための汎用性の高いプラットフォームとして機能します。
- 本手法は、さまざまなナノ粒子システムや治療用低分子化合物に適応させることが可能です。
研究の目的
- TLRシグナル伝達を標的とする新規ナノインヒビターを同定すること。
- 潜在的な治療応用のための堅牢なスクリーニング法を開発すること。
- 自然免疫細胞におけるTLRシグナル伝達の理解を深めること。
使用方法
- プロトコルに記載された培養培地の調製。
- スクリーニングのためのTHP-1細胞ベースのリポーターシステムの利用。
- さまざまなナノ粒子システムへの本手法の適用。
- TLRシグナル伝達を抑制する生物活性ナノ粒子の有効性の評価。
主な結果
- このスクリーニング法は迅速かつ堅牢である。
- 金ナノ粒子を用いることで、ハイスループットスクリーニングが可能になる。
- 本手法は、他のナノ粒子システムや低分子化合物にも適用可能である。
- 炎症性疾患の治療における潜在的な応用可能性が特定された。
結論
- 本手法は、TLRシグナル伝達阻害剤を特定するための有用なツールとなる。
- 生理活性ナノ粒子は、炎症における治療への応用が期待されている。
- このスクリーニング手法の潜在能力を最大限に引き出すためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
業界における重要性と実用性
このスクリーニング法は、食細胞である免疫細胞におけるToll様受容体シグナル伝達を調節する生理活性ナノ粒子の迅速な同定を可能にし、抗炎症療法の開発における重要な課題を解決します。NF-κB/AP-1およびIRFという2つの経路におけるTLR阻害を評価する、レポーターベースの高スループットアッセイを提供することで、免疫学に焦点を当てた創薬プログラムにおける初期段階のターゲットリスク低減およびリード化合物の同定を支援します。本アプローチはナノ粒子ライブラリーのスクリーニングに直接適用可能であり、低分子化合物にも拡張できるため、免疫調節候補物質のメカニズム検証のためのスケーラブルなプラットフォームを提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： MyD88依存性およびTRIF依存性の両方のTLRシグナル伝達経路に対するナノ粒子の影響を測定することにより、治療仮説を検証する。
- 運用的価値： 安定したTHP-1レポーター細胞株を用いることで、スクリーニングキャンペーン全体を通じてSEAPおよびルシフェラーゼ活性の一貫した定量的な読み取りを可能にする。
- 予測的価値： 広範な阻害スペクトル（例：TLR2、3、4、5）を持つリード化合物を特定し、経路のデリスキングおよびポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：遠心分離および洗浄によりナノ粒子-LPS複合体を調製し、遊離リガンドを除去することで、正確な投与量を確保します。
- 定量的出力：経路の活性化に比例した比色（SEAP）および発光（ルシフェラーゼ）信号を生成し、用量反応プロファイリングを可能にします。
- スケーラビリティ：96ウェル形式およびマルチチャンネルピペッティングに対応しており、ナノ粒子ライブラリの高スループットスクリーニングに適しています。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：検証済みのヒット化合物は、炎症性疾患に関与する複数のTLRにわたって阻害作用を示しており、トランスレーショナルな連続性が裏付けられている。
- メカニズムによるリスク低減：p65のリン酸化、IκBαの分解、およびIRF3の活性化に関するイムノブロッティングにより阻害を確認し、アッセイのアーティファクトを排除している。
- 前臨床との整合性：食細胞である免疫細胞（THP-1由来マクロファージ）を用いることで、in vivoでの有効性に関連するヒトの自然免疫応答をモデル化している。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬のディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、リード最適化や前臨床開発への投資前に、go/no-go判断の根拠となるメカニズム的な知見を提供します。
- 探索生物学：TLR駆動の転写因子活性化に対するナノ粒子介在性の抑制を定量化することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある定量的な出力（OD655およびルミネッセンス）を提供し、ナノ粒子の有効性と力価の比較を可能にします。
- 分析：SEAPおよびルシフェラーゼの読み取り値から用量反応曲線を生成し、抑制濃度（IC50）およびTLRパスウェイ間の選択性を決定します。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト免疫細胞におけるナノ粒子の効果を、慢性炎症に関与する疾患関連のTLRシグナル伝達カスケードへと結びつけます。
- 企業的な再利用：多様なナノ粒子組成、コア製剤、および治療用低分子化合物に適応可能な、再利用可能なスクリーニングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：TLRシグナルのNF-κBおよびIRFの両経路の抑制を確認することでメカニズム的なリスク低減を行い、免疫調節剤スクリーニングにおける偽陽性を減少させます。
- 運用の価値：ハンズオン時間を最小限に抑え、標準化された試薬調製（Quanti-Blue、ルシフェラーゼ基質）を用いた、堅牢で実施容易なレポーターアッセイを採用しています。
- 戦略的価値：広範なTLR阻害剤の早期特定を可能にし、治療上の有用性が限定的な経路特異的化合物を排除することで、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：直交する方法（免疫ブロット法）によるヒット化合物の検証および細胞毒性の評価を行い、偽陽性を回避することで、リスク調整後の研究推進をサポートします。
実施上の考慮事項
- 再現性を維持するために、細胞培養、レポーターアッセイの最適化、およびナノ粒子の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- デュアルリードアウト分析を行うため、吸光度（655 nm）および発光検出が可能なプレートリーダーへのアクセスが必要です。
- 結果に影響を及ぼす可能性のある遊離LPSや不純物を除去するため、標準化されたナノ粒子精製（遠心分離、洗浄）が必要です。
- R-10培地における粒子のサイズ、電荷、および凝集挙動に基づいた、LPS投与量およびナノ粒子濃度範囲の調整が必要です。
- 実用上の制限：アッセイの感度は、ナノ粒子によるクエンチングや比色/発光基質への干渉によって影響を受ける可能性があるため、カウンタースクリーニングコントロールが必要です。
