Name: トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶTLRシグナル阻害ナノ粒子スクリーニング法。THP-1細胞を用いたレポーター系で、炎症性疾患治療への応用が期待される高速で頑健な手法です。

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著者は、上海第一人民病院（HY）からの出発基金、上海交通大学からのGaofeng Clinical Medicine Grant支援の上級機関（HY）の特別任命教授（東部奨学生）のためのプログラムからの支援を認めたいと思います（HY）、およびカナダのクローン病および大腸炎財団（CCFC）（SETおよびHY）からの資金提供を受けています。

1.細胞培養培地および試薬の調製<ol><li> RPMI-1640培地に10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムのサプリメントを加えて完全な細胞培養液R10を調製します。 <ol><li> NF-κB/ AP-1活性化の制御下でSEAPの発現を維持するためにR10に抗生物質Zeocin（200μg/ mL）を添加することにより、選択培地R10-Zを調製する。 SEAPとルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を発現する細胞を選択するには、ゼオシン（100μg/ mL）とブラストサイジン（10μg/ mL）の両方をR10に加える（R10-ZBとして）。 </li></ol></li><li> 清浄な125mLガラスフラスコ中で、100mLの超純粋エンドトキシンフリー水に基質粉末の1つの袋（ 例えば 、QUANTI-Blue）を溶解することによって、SEAP基質溶液を調製する。 <ol><li>溶液を静かに振り、37℃で1時間インキュベートして、基質の完全な溶解を確認します。 </li> &lt;滅菌（オプション）を確実にするために0.2μmメンブレンを使用して溶液をろ過し、使用前2週間まで4℃で保存します。 </li></ol></li><li>基質粉末（ 例えば 、QUANTI-Luc）の1つの袋を、滅菌50mL遠心分離管内の25mL超高純度エンドトキシンフリー水に溶解することによって、ルシフェラーゼ基質溶液を調製する。 <ol><li>粉末を完全に溶解した後、すぐに溶液を使用してください。あるいは、使用前に4℃（1週間まで）または-20℃（1ヶ月まで）で保存してください。 注意：両方の基質溶液は光に敏感であり、いつでも可能な限り露光を避けるべきです。溶液の複数の凍結融解サイクルは、基材の不安定性を引き起こし、その有効期間を短くする可能性がある。 </li></ol></li><li>分子量ジメチルスルホキシド（DMSO）中のホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）のストック溶液を500μg/ mLの濃度に調製する。原液のアリコートを作る（500μLチューブに10μL）を入れ、-20°Cで保存します。 </li><li> LPS（E-coli K12）原液を無菌エンドトキシンフリー水中に5mg / mLの濃度で調製し、-20℃で長期保存用に分注する。ストックLPSをリン酸緩衝食塩水（PBS）に100μg/ mLの濃度で希釈し、使用する前に-20℃で保存することにより、作用するLPS溶液を調製する。 注意：培養用試薬は、バイオセーフティキャビネット内で調製し、すべての容器を使用前に滅菌する必要があります。 PMAおよびLPS溶液の繰り返しの凍結融解サイクルは避けるべきである。 </li></ol> 2. THP-1レポーター細胞由来マクロファージの培養<ol><li> 2つのTHP-1レポーター細胞株：THP-1-XBlueおよびTHP-1-Dual細胞を使用する。前者はNF-κB/ AP-1によって制御されるSEAPレポーター遺伝子を有し、後者は二重レポーター遺伝子システム、同じSEAPレポーター遺伝子およびIRF制御ルシフェラーゼ遺伝子を有する。ザ選択培地以外の培養手順は同一である。 <ol><li> 10mLのR10培地中で作業細胞ストック（約5×10 6細胞）を解凍し、細胞を300×gで5分間スピンダウンする。 10mLのR10培地に細胞を再懸濁し、T75培養フラスコに移す。細胞が1×10 6細胞/ mLの密度に達するまで培養培地を2〜3日おきに交換する。 </li><li>細胞増殖がその能力に達すると、細胞を通過させて細胞密度を2〜5×10 5細胞/ mLの範囲に減少させるので、細胞は増殖し続けることができる。 </li><li>少なくとも1継代後、選択培養培地：THP-1-XBlueについてはR10-Z、THP-1-デュアルについてはR10-ZBの細胞を培養し始める。選択培養培地で細胞を少なくとも1回継代培養した後、細胞は実験の準備が整う。 注意：細胞の過剰増殖は、重大な細胞死につながる可能性があります。細胞生存率は&gt; 98％を維持すべきである。通行回数を記録しておく多くの継代（20継代以上）後に異なる挙動を示す可能性があります。 注：細胞培養フラスコはコストを節約するために数回再使用することができます。しかし、このプラクティスは、異なるフラスコ間での一般的な汚染および交差汚染のリスクを増大させる可能性がある（異なる細胞株を同時に取り扱う場合）。培地交換および細胞通過の間、遠心分離を300xgで5分間に設定する。 </li></ol></li><li> レポーター細胞アッセイを行うために、96ウェル平底細胞培養プレートに細胞を播種し、それらをマクロファージに分化させる。手順は次のとおりです。 <ol><li>フラスコから遠心チューブに細胞を移し、5分間300xgで細胞をスピンダウンし、1×10 6細胞/ mLの濃度でR10培地にそれらを再懸濁する。最終濃度50ng / mLの細胞懸濁液にPMA溶液のアリコートを添加する。 </li><li> 100μLの細胞懸濁液を96ウェルの各ウェルに移すマルチチャンネルピペットを使用してプレートを洗浄した。プレートを37℃（細胞培養インキュベーター内）で24時間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、真空アスピレーター（またはマルチチャンネルピペットを使用）を用いて注意深く培地を除去し、PBS（100μL/ウェル）で細胞を2回静かに洗浄する。各ウェルに100μLの新鮮なR10培地を加える。レポーターアッセイを行う前にインキュベーターで2日間細胞を休止する。 注意：PMA刺激後に細胞が正常な静かな状態に落ち着くようにするには、休息するステップが非常に重要です。これは、非刺激条件下でレポーター遺伝子のバックグラウンドシグナルを有意に減少させることができる。 注：PMAで24回刺激した後、細胞はマクロファージ様表現型に分化し、ウェルの底に細胞接着の特徴をもち、偽妊娠の形態学的特徴を有する。 </li></ol></li></ol> 3.レポーター細胞を用いた潜在的TLR4ナノインヒビターのスクリーニング</p&gt; 注記：TLR4シグナル伝達は、MyD88依存性経路とTRIF依存性経路の両方を利用するため、幅広いTLRシグナル伝達経路を網羅する主要な標的として選択される。 THP-1-XBlueレポーター細胞は、主にNF-κB/ AP-1活性化を検査するために使用されるが、THP-1-デュアル細胞は、TRIF依存性シグナル伝達からのIRF活性化のためである。 <ol><li> スクリーニングの前に用量反応曲線を作成することにより、最適なLPS用量を特定する。 <ol><li>作用するLPS溶液をR10培地（log10スケールで希釈する）中で0.01〜100 ng / mLの最終濃度に希釈する。プレート設計をレイアウトし、96ウェル丸底培養プレートで希釈する。希釈後、各ウェルに最低110μLの溶液が含まれていることを確認してください。 </li><li>静かに真空吸引器を用いて細胞を播種したプレート（2.2.3から）から培地を除去する。 </li><li>希釈プレート（3.1.1）に調製したR10培地を含むLPSを移すi試料のレイアウトに従って培養プレートに移す。プレートを37℃（細胞培養インキュベーター内）で24時間インキュベートする。 </li><li> 24時間後、上清（80μL/ウェル）を注意深く新しい96ウェル丸底プレートに移す。これらの溶液で比色および/またはルシフェラーゼルミネッセンスアッセイを直ちに実施するか、アッセイの開発前に4℃（数時間）または-20℃（日）で保存します。 注：プレートレイアウトの設計は、実験とデータ分析のためにシンプルで明確でなければなりません。各条件について、2-4回の反復を考慮する必要があります。常に陰性対照群（LPSヌル）を含む。 NF-κB/ AP-1活性化のためにTHP-1-XBlue細胞を使用することが推奨される。なぜなら、デュアル細胞はマクロファージに分化した後にNF-κB/ AP-1活性化のバックグラウンドが比較的高いからである。しかし、NF-κB/ AP-1およびIRF活性化の両方を報告するために二重細胞を使用することが可能である。 </li></ol></li><li> 色を開発するIRF活性化のためのNF-κB/ AP-1活性化およびルシフェラーゼルミネッセンスアッセイのイミトリックアッセイ。 <ol><li> NF-κB/ AP-1活性化を評価するために、各サンプルの上清20μLを新しい96ウェル平底培養プレートに移す。予熱したSEAP基質溶液180μLを各ウェルに加える。プレートを37℃で1〜2時間インキュベートして発色させる（ピンク〜ダークブルー）。プレートリーダー上で655nmでの吸収を集める。 注意：インキュベーション時間は、発色（30分〜一晩のインキュベーション）に基づいて変化させることができます。発色（OD&gt; 3）の飽和を避けながら、暗い色の光学濃度（OD）が1を超えるまで待つことをお勧めします。 </li><li> IRF活性化の分析のために、各サンプルの上清10μLを96ウェル透明平底白板に移す。ルシフェラーゼ溶液（50μL）を添加し、直ちに発光wまあまあ。 注記：ウェルからウェルまで、およびプレート間でのルミネッセンス読み取りの一貫性を保証するために、自動注入機能を備えたルミネセンスプレートリーダーを使用することを強くお勧めします。基質溶液を手動で注入する場合は、ウェルごとに一定のインキュベーション時間と読み取り設定を確保してください。 </li></ol></li><li> 10ng / mLのLPS刺激（3.1に基づく）を有する様々なペプチド-NDPハイブリッドについてのスクリーニングアッセイを行う。レポーターアッセイの開発については、3.2の同じ手順に従ってください。 <ol><li>遠心分離法を用いてR10培地中で200nMにペプチドGNPハイブリッドを濃縮する。 20,000倍量のハイブリッド溶液（10nM）を18,000×gで30分間遠心分離し、上清を慎重に捨てる。ハイブリッド（チューブの底にある）をチューブに集め、PBSで2回洗浄し、ハイブリッドをR10培地の1つのボリュームに再懸濁する。 </li><li>同量の濃縮ハイブリッドとハイブリッドおよびLPSの最終濃度がそれぞれ100nMおよび10ng / mLになるように、R10培地を含むLPS（20ng / mL）を添加した。 </li><li>培養プレートから培養液を除去し（2.2.3）、混合液100μLを各ウェルに加える（条件ごとに3回）。ネガティブコントロール（培地のみ）およびLPSコントロール（ハイブリッドなしの10ng / mL LPS）を含む。 </li><li> 37℃で24時間インキュベートした後、各ウェルの培地をチューブに移し、チューブを18,000×g、4℃で30分間遠心する。 96ウェル丸底プレートに上清（50〜80μL/チューブ）を集め、3.2で説明したようにレポーターアッセイを行う。 注意：遠心分離後に上清を捨てるときは、チューブの底にハイブリッドをかき混ぜないでください。 注：ステップ3.3.4の遠心分離は、非内在化ナノ粒子ハイブリッドを培養培地から取り除くために非常に重要であり、ハイブリッドのコロニーへの干渉を回避することができる測色/ルミネッセンス測定。これは、金ナノ粒子がその大きさおよび凝集に応じて広い波長の光を吸収することができるためである。 </li></ol></li></ol>潜在的候補者の阻害効果の検証注：スクリーニングから潜在的候補者の阻害効果を確認するために、2つのアプローチが用いられる。 1つは、固定されたハイブリッド濃度（またはその逆）での刺激物（LPS）の用量反応を調べることである。もう一つはイムノブロッティングによるNF-κB/ AP-1およびIRF3シグナルの阻害を直接見ることである。 <ol><li>アプローチ1では、3.3で説明したのと同じ手順に従って、100 nMの鉛ハイブリッドと1 ng / mLと10 ng / mLの2つのLPS濃度でレポーターアッセイを行います。比較のためのハイブリッドコントロールとして、スクリーニング結果に基づいて非ハイブリッドを含める。 </li><li> イムノブロッティング法の場合は、標準experimental手続き。 <ol><li> R10培地中のTHP-1細胞を培養し、細胞を12ウェル培養プレート（2×10 6細胞/ウェル）に播種し、細胞を50ng / mLのPMAで24時間処理してからマクロファージに分化させ、 2日間。 </li><li>細胞分化後、ハイブリッド（100nM）の有無にかかわらず、10ng / mLのLPSで細胞を刺激する（最大4時間）。様々な時点（0,5,15,30,60,120および240分）で、イムノブロッティングのために細胞溶解物を調製する。コントロールとして非アクティブなハイブリッドを含める。 </li><li> IκBα、リン酸化されたp65、およびリン酸化されたIRF3のシグナルを調べて、NF-κBおよびIRF3の活性化に対する鉛ハイブリッドの阻害効果を調べる。 β-アクチンシグナルとトータルIRF3シグナルを内部コントロールとしてプローブする。 注：シグナル伝達は、しばしばレポーター酵素SEAPおよびルシフェラーゼ（24時間）の発現よりもはるかに速く（数時間以内に）起こる。それはまた、24時間後の試験したハイブリッドの生存率アッセイを別の検証方法として用いた。 </li></ol></li></ol> 5. TLR特異性の評価注：リードペプチド - GNPハイブリッドのTLR特異性を調べるために、TLR2、TLR3およびTLR5を含む他のTLRシグナル伝達経路を試験する。 THP-1由来のマクロファージは、マクロファージ34におけるTLR7,8,9発現の欠如のために、これらのTLRの刺激にうまく応答しないため、TLR7,8および9は除外される34 。 <ol><li> TLR2（Pam3CSK4）、TLR3（ポリI：C）およびTLR5（フラジェリン）に特異的なリガンドの様々な濃度（1ng / mL〜25μg/ mL）を、マクロファージ由来の両方のレポーター細胞で試験して、 3.1および3.2の手順。 </li><li> 5.1から得られた濃度の鉛ハイブリッド（100nM）と各TLRリガンドとの混合物で細胞を処理して、鉛hの阻害特異性を評価する3.3に記載されている実験手順に従った。比較のための対照として非ハイブリッドを含める。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

TLRは多くの炎症性疾患の病因に関与しているので、免疫応答および炎症状態の調節のための治療標的として浮上している。しかし、TLRシグナル伝達経路を阻害するための治療薬の臨床開発はこれまで成功していない。 TLR7およびTLR9を阻害する抗マラリア薬のヒドロキシクロロキンは、臨床使用35、36です。同様に、化合物の限られた数は、前臨床試験37、38におけるLPS媒介性炎症反応に強力な阻害効果を示しエリトラン、TLR4アンタゴニスト、を含む臨床試験に進行した、臨床フェーズI / IIで陽性の結果を示しました。試験39、40、41、最終的に第III相試験は、死亡率を減少させることができませんでした重度の敗血症の患者<sup ...

Toll様受容体（TLR）は、感染に対する第一の防御線に寄与する先天性免疫系の重要な要素の1つである。 TLRは、病原体関連分子パターン（又はのPAMP）のレパートリーを認識し、シグナル伝達1,2のカスケードを介して防御反応を装着することによって侵入する病原体を検出するための責任があります。 10のヒトTLRが同定されている。リガンドが不明瞭なままであるTLR10を除いて、各TLRはPAMPの明確で保存されたグループを認識することができる。例えば、主に細胞表面上に位置するTLR2およびTLR4は、それぞれ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌からのリポタンパク質および糖脂質を検出することができる。エンドソームコンパートメントに主に存在するTLR3、TLR7 / 8およびTLR9は、ウイルスおよび細菌由来のRNAおよびDNA産物を検出することができる3 。 PAMPによって刺激されると、TLRはpro-infを放出することによって必須の免疫応答を引き起こす炎症メディエーター、エフェクター免疫細胞の動員および活性化、およびその後の適応免疫イベントの調整4 。 TLRシグナル伝達は、単純に二つの主要な経路5,6に分類することができます。 1つは、アダプタータンパク質骨髄分化因子88（MyD88） - MyD88依存性経路に依存する。 TLR3を除くすべてのTLRは、この経路を利用して、活性化B細胞（NF-κB）およびマイトジェン関連プロテインキナーゼ（MAPK）の核因子κ軽鎖エンハンサーを活性化し、TNF- α、IL-6およびIL-8が含まれる。第2の経路は、インターフェロン（IFN）調節因子（IRF）およびNF-κBを活性化するTIRドメイン含有アダプター誘導性インターフェロン-β（TRIF）（TRIF依存性経路またはMyD88非依存性経路）を利用し、 I型IFNである。損なわれていないTLRシグナル伝達微生物およびウイルス感染からの私たちの毎日の防御にとって重要です。 TLRシグナル伝達経路の欠損は免疫不全を引き起こし、しばしばヒトの健康に有害である。 7 しかし、TLRシグナル伝達は「両刃の剣」であり、過度の制御されていないTLR活性化は有害である。過活動TLR応答は、多くの急性および慢性ヒトの炎症性疾患における病因8、9に貢献しています。全身性炎症および多臓器損傷によって特徴付けられる例えば、敗血症のために、TLR2およびTLR4は、敗血症の病態生理10、11、12で重要な役割を果たしていると、感染症に向けて急性、圧倒的な免疫応答の主な原因です。さらに、TLR5は、嚢胞性線維症の患者の慢性肺炎症に寄与することが分かっている13、 14 。また、異常調節エンドソームTLRシグナル（例えば、TLR7およびTLR9）が強く、全身性エリテマトーデス（SLE）及び関節リウマチ（RA）15、16を含むいくつかの自己免疫疾患の発症および進行に関連しています。これらの収束している証拠は、TLRシグナル伝達が多くの炎症性疾患の潜在的治療標的であることを示している17 。 TLR応答の薬理学的調節は、多くの炎症状態において有益であると予想されるが、残念ながら、現在TLR 9、17、18シグナル伝達を阻害するために臨床的に利用可能な非常に少ない化合物です。これは、免疫恒常性および疾患の病理に関与するTLR経路の複雑さおよび重複に一部原因がある。したがって、新しい、potenを探して複数のTLRシグナル伝達経路を標的とする治療剤は、基本的なギャップを埋めることができ、TLR阻害剤を臨床病院に進めるという課題を克服することができる。 ナノサイエンスおよびナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスは、それらのユニークな特性19、20、23のために次世代のTLRモジュレーターとして浮上しています。ナノスケールの大きさは、これらのナノ治療は、より良い生体分布および持続循環24、25、26を有することを可能にします。彼らはさらに、所望の薬力学を満たすために官能化することができると薬物動態は27、28、29プロファイル 。より興味深いことに、これらの新規なナノデバイスの生物活性は、それらの固有の特性から生じ、これは単に治療剤の送達媒体として作用するのではなく、特定の医療用途に使用することができる。例えば、ナノ粒子様高密度リポタンパク質（HDL）は、TLR4リガンドLPS 23を捕捉することによりTLR4シグナル伝達を阻害するように設計されました。加えて、我々は、装飾されたペプチドが金ナノ粒子の表面特性を変化させ、そしてそれらは、様々な生体活動30、31、32、33を有することを可能にすることができるペプチド、金ナノ粒子ハイブリッドシステムを開発しました。これにより、次世代のナノ治療薬としての特殊なクラスの薬物（または「ナノ薬物」）となります。 このプロトコールでは、貪食免疫細胞32中の複数のTLRシグナル伝達経路を強力に阻害することができるペプチド - 金ナノ粒子（ペプチド - GNP）ハイブリッドの新規なクラスを同定するためのアプローチを提示する32 。 </sup&gt; 33 。このアプローチは、市販のTHP-1レポーター細胞系に基づいている。レポーター細胞は、2つの安定した誘導性レポーター構築物からなる：転写因子NF-κBおよびアクチベータータンパク質1（AP-1）によって誘導されるプロモーターの制御下に分泌胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を保持する。他方は、インターフェロン調節因子（IRF）によって誘導可能なプロモーターの制御下に分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。 TLR刺激に際して、シグナル伝達はNF-κB/ AP-1および/またはIRFの活性化をもたらし、レポーター遺伝子をSEAPおよび/またはルシフェラーゼを秘密にする。そのような事象は、それらの対応する基質試薬を分光光度計または照度計で容易に検出することができる。以前に確立されたペプチドGNPハイブリッドのライブラリーをスクリーニングするこのアプローチを用いて、我々はTLR4シグナル伝達経路を強力に阻害し得る鉛候補を同定した。リードペプチド含有ペプチドの阻害活性は、次いでGNPハイブリッドをイムノブロッティングの別の生化学的手法を用いて検証し、他のTLR経路で評価した。このアプローチは、TLRシグナル伝達経路を標的とする新規薬剤の迅速で効果的なスクリーニングを可能にする。

<table><tbody><tr><td>THP-1-XBlueレポーター細胞</td><td>InvivoGen</td><td>thpx-sp</td><td>細胞培養継代を20未満に保つ</td></tr><tr><td>THP-1-デュアルレポーター細胞</td><td>InvivoGen</td><td>thpd-nfis</td> 細胞<td>培養継代を20未満に保つ</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (L-グルタミンなし)</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30096.02</td><td>37°Cまでウォームアップ;使用前のC;サプリメントを追加して、完全な培地を作るためのサプリメントを追加します R10</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (認定)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12484028</td><td>熱不活性化; RPMI-1640</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td>で 10% <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30034.02</td><td>2 mM 完全な培地で R10</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360-070</td><td>1 mM 完全な培地 R10</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、1X、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30028.02</td><td>細胞洗浄および試薬調製に使用</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td>SEAP基質</td></tr><tr><td>QUANTI-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qlc2</td><td>ルシフェラーゼ基質</td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td>レポーター細胞</td></tr><tr>用選択抗生物質<td>ブラストシジン</td><td>InvivoGen</td><td>抗bl-1</td><td>レポーター細胞用選択抗生物質</td></tr><tr><td>分子生物学用ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>試薬調製に使用</td></tr><tr><td>分子生物学用ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌K12</td><td>InvivoGenの細胞分化に使用</td><td>tlrl-eklps</td><td>TLR4 リガンド</td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pms</td><td>TLR2/1 リガンド</td></tr><tr><td>ポリ (I:C) HMW</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pic</td><td>TLR3 リガンド</td></tr><tr><td>S. Typhimurium (FLA-ST) 由来のフラジェリン、超高純度</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-epstfla</td><td>TLR5 リガンド</td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>比色分析アッセイを読む</td></tr><tr><td>インジェクター付きInfinite M200 Proマルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>lmaniscience</td></tr><tr><td>Microfuge 22R遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>温度制御マイクロ遠心分離機(最大18,000 g)</td></tr><tr><td>Allegra X-15R 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>N/A</td><td>温度制御汎用遠心分離機(細胞培養用)</td></tr><tr><td>Costarアッセイプレート、96ウェルホワイト、透明平底、組織培養処理</td><td>Corning Costar</td><td>3903</td><td>発光アッセイに使用</td></tr></tbody></table>

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll様受容体（TLR）応答の薬理学的調節は、多くの炎症性疾患の治療において非常に有望である。しかし、これまでTLRシグナル伝達を弱めるために利用可能な化合物は限られており、臨床的に承認されたTLR阻害剤（抗マラリア薬ヒドロキシクロロキンを除く）は臨床的に使用されていない。ナノテクノロジーの急速な進歩に照らして、ナノデバイスを用いた免疫応答性の操作は、これらの疾患を治療するための新しい戦略を提供する可能性がある。本明細書では、貪食免疫細胞におけるTLRシグナル伝達を阻害する新規な生物活性ナノ粒子を迅速に同定するためのハイスループットスクリーニング法を提示する。このスクリーニングプラットフォームは、比色アッセイおよびルシフェラーゼアッセイを用いてTHP-1細胞ベースのレポーター細胞上に構築される。レポーター細胞は、2つの誘導性レポーター構築物の安定した組込みによって、ヒトTHP-1単球細胞株から操作される。 1つは、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を発現する転写因子NF-κBおよびAP-1によって誘導可能なプロモーターの制御下にあり、他方はインターフェロン調節因子（IRF）によって誘導可能なプロモーターの制御下で分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。TLR刺激に応答して、対応する基質試薬を用いて検出することができるSEAPおよび/またはルシフェラーゼを産生する。我々の以前の研究で確立されたペプチド - 金ナノ粒子（GNP）ハイブリッドのライブラリーを例として、プロトタイプのリガンドであるリポ多糖（LPS）によって引き起こされるTLR4シグナル伝達カスケードの2つのアームを効果的に阻害することができる1つのペプチド-NDPハイブリッドを同定した。この発見は、イムノブロッティングを含む標準的な生化学技術によって検証された。更なる分析により、この鉛ハイブリッドは、TLR2,3,4,5を含む複数のTLR経路に作用する広い阻害スペクトルを有することが確立された。この実験的アプローチにより、raナノ粒子（または他の治療化合物）は、貪食免疫細胞における特異的TLRシグナル伝達を調節することができる。

全体的な実験手法を図1に示します 。 2つのTHP-1レポーター細胞株、THP-1-XBlueおよびTHP-1-Dualを用いて、NF-κB/ AP-1およびIRFの活性化をそれぞれプロービングすることにより、TLR応答を迅速にスクリーニングする。 NF-κB/ AP-1の活性化は、SEAP比色アッセイによって検出することができるが、IRF活性化は、ルシフェラーゼルミネセンスによってモニターする。単球THP-1細胞は、生来の貪食免疫細胞に対する免疫調節活性についてナノデバイスをスクリーニングするためにマクロファージに容易に誘導することができる。レポーターシステムを用いて、ハイスループットの様式でスクリーニングを行うことができる。このようなアプローチは、新しい免疫療法剤の発見、特にTLRシグナル伝達のような先天性免疫シグナル伝達を標的とすることに多目的である。 <p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

このスクリーニング手順の全体的な目的は、toll-like receptorシグナル伝達を抑制できる新規の生物活性ナノ粒子を同定することです。本手法を用いることで、自然免疫細胞におけるtoll-like receptorシグナル伝達を標的とする新規ナノインヒビターを物理的に同定することが可能になります。本技術の主な利点は、レポーター細胞系を用いることで、迅速かつ堅牢に、そして容易に実施できる点にあります。toll様受容体のシグナル伝達がこれらの疾患の病態に関与していることが判明しているため、本手法の応用範囲は多くの炎症性疾患の治療にまで及びます。本方法は金ナノ粒子を用いた高スループットスクリーニングを可能にしますが、他のナノ粒子システムや、治療用低分子化合物、バイオ分子にも適用可能です。この手順を開始するために、テキストプロトコルに従って培地を調製してください。次に、清潔な125 mLのガラスフラスコに100 mLの超純水（エンドトキシンフリー）を加えます。分泌型胚性アルカリホスファターゼ基質粉末を1袋加え、完全に溶解するまで溶液を静かに撹拌します。基質を完全に溶解させるため、37 °Cで1時間インキュベートします。0.2 µmのメンブレンを用いて溶液をろ過します。使用するまで4 °Cで保存してください。次に、25 mLの超純水（エンドトキシンフリー）を入れた50 mL遠心チューブに、ルシフェラーゼ基質粉末1袋を加えます。粉末が完全に溶解した後、使用するまで最大1週間、4 °Cで保存します。次に、テキストプロトコルに記載されている通り、他のすべての試薬のストックソリューションを調製します。細胞の培養および調製後、培養フラスコから遠心管に細胞を移します。細胞を300 ×gで5分間遠心分離します。次に、R-10培地を用いて細胞密度が1 X 10⁶ cells/mLになるように再懸濁します。最終濃度が50 ng/mLとなるように、PMA溶液を細胞懸濁液に分注して加えます。細胞懸濁液を滅菌済みの試薬リザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを用いて、細胞懸濁液 100 µL を 96ウェル平底培養プレートの各ウェルに分注します。細胞培養インキュベーター内で 37 °C で 24 時間インキュベートします。その後、真空吸引装置を用いて、培地を注意深く除いてください。倒立顕微鏡を用いて細胞を確認し、分化させたマクロファージがウェルの底に接着していることを確認します。1回につき1ウェルあたり100 µLのPBSを用いて、細胞を静かに2回洗浄してください。次に、各ウェルに新鮮なR-10培地を100 µL加えます。レポーターアッセイを行う前に、37 °Cのインキュベーター内で細胞を2日間静置させます。まず、テキストプロトコルに従って、最適なLPS投与量を決定します。次に、あらかじめ加温したQuanti-Blue溶液180 µLを、新しい96ウェル平底プレートの各ウェルに加えます。その後、各サンプルの上清20 µLをプレートに転写します。37 °Cで1〜2時間インキュベートし、色がピンクから濃い青色に呈色するまで待ちます。光学密度が1を超えた後、プレートリーダーを用いて655ナノメートルにおける吸光度を測定します。IRF活性化の解析を開始するには、各サンプルから10µLの新鮮な上清を、新しい96ウェル透明平底白プレートに分注します。オートインジェクションを用いて、各ウェルに50µLのルシフェラーゼ溶液を加えます。その後、直ちにウェルごとにルミネッセンスを測定し、用量反応曲線を作成して、ナノ粒子スクリーニングに最適なLPS濃度を決定します。次に、1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れたペプチド-GMPハイブリッド溶液20サンプルを、18,000 ×gで30分間遠心分離します。上清を慎重に除きます。ハイブリッドを新しい単一のチューブに移し、1 mLのPBSで2回洗浄します。その後、洗浄したハイブリッドを等量のR-10培地で再懸濁します。濃縮したハイブリッドとLPS含有R-10培地を等量ずつ混合し、ハイブリッドの最終濃度を100 nM、LPSの最終濃度を10 ng/mLにします。次に、マクロファージ培養プレートから培地を除去します。各ウェルにハイブリッドLPS混合液を100 µLずつ加え、各条件につき3連で調製します。陰性対照とLPS対照も含めてください。37°Cで24時間インキュベートします。その後、各ウェルの培地を別々の遠心チューブに移します。チューブを18,000 ×g、4°Cで30分間遠心分離します。上清を新しい96ウェル丸底プレートに転送します。これらのサンプルのレポーターアッセイを開始するには、あらかじめ加温したQuanti-Blue溶液 180 µLを、新しい96ウェル平底プレートの各ウェルに加えます。その後、各サンプルの上清 20 µLをこのプレートに転送します。濃い青色に発色し、吸光度が1を超えるまで、37°Cで1〜2時間インキュベートします。その後、プレートリーダーを用いて655 nmでの吸光度を測定します。次に、各サンプルから10 µLの新鮮な上清を、96ウェルの透明平底ホワイトプレートに分注します。自動インジェクターを用いて、各ウェルにルシフェラーゼ溶液を50 µLずつ添加し、直ちにウェルごとに発光量を記録します。その後、潜在的な候補物質の抑制効果を検証し、テキストプロトコルに記載されている通りにTLR特異性を評価します。本研究では、NF-Kappa B AP1の活性化をSEAP比色アッセイによって検出します。このアッセイでは、LPSによるTLR-4の活性化がNF-Kappa B AP1の活性化とSEAPの産生をもたらします。放出されたSEAPが基質を変換し、刺激に伴って放出されたSEAPの量に比例した色変化が起こります。これは655ナノメートルにおける吸光度を測定することで定量化されます。次に、LPSを介したIRFの活性化によりルシフェラーゼが発現し、基質を触媒して発光を生成させます。これらの用量反応から、以前に構築されたペプチド-GMPハイブリッドライブラリーをスクリーニングするための最適なLPS濃度を10 nanograms per milliliterと決定しました。これにより、NF-Kappa B、AP1、およびIRFのすべてにおいて、LPS誘発性の活性化を強力に抑制する能力を持つハイブリッド群が同定されました。この抑制活性を検証したところ、期待通りLPS濃度の増加に伴い、ハイブリッドの抑制効果が減少することが示されました。次に、阻害活性を確認するために免疫ブロッティングを行います。リードハイブリッド化合物により、p65のリン酸化が抑制され、I-Kappa B alphaの分解が阻害され、IRF3のリン酸化が遅延することが確認され、リードハイブリッドであるP12がLPS介在性のTLR-4シグナル伝達を阻害できることが示されました。さらなる検討により、P12はTLR-2およびTLR-5介在性のNF-Kappa B AP1シグナル伝達、ならびにTLR-3介在性のIRF活性化も抑制することが明らかになり、P12が複数のTLR経路に対して強力な阻害活性を持つことが示唆されました。本手順に続き、スクリーニング結果を検証し、偽陽性の検出を避けるために、免疫ブロット法や細胞毒性試験などの他の測定を実施します。本手法の開発により、ナノメディシン分野の他の研究者が、次世代の炎症性治療薬として Toll-like receptor シグナリングのナノインヒビターを探索する道が開かれました。

screening-bioactive-nanoparticles-phagocytic-immune-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構（s）を解明する簡単な技術的なアプローチです。...

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。...

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

ヒト単球由来のミクログリア様細胞の培養を取ります。抗炎症薬を含むナノ粒子を実験培養物に導入し、遊離薬剤を対照に導入します。ナノ粒子は、親水性シェルと親油性薬物をカプセル化する疎水性コアを特徴としています。細胞はナノ粒子をエンドサイトーシスし、ナノ粒子が細胞内で薬物を放出し、その送達を促進します。遊離薬物は、濃度勾配によって制約されるプロセスである受動的拡散によって入り、その結果、細胞内濃度が低下します。トール様受容体に結合し、炎症誘発性サイトカイン放出を引き起こす細菌抗原を追加します。実験群のナノ粒子と対照群の遊離薬物を含む新鮮な培地で培養物をインキュベートします。この2回目の曝露により、ナノ粒子送達を介して一貫した治療薬レベルが確保され、それによってサイトカイン産生を抑制する下流シグナル伝達が誘導されます。遊離薬物の取り込みが限られているため、細胞内濃度は治療下になります。上清を収集してサイトカインレベルを評価し、ナノ粒子を介した薬物送達の強化された治療効果を評価します。...

ミクログリア様細胞におけるナノ粒子を介した抗炎症薬の送達増強

このビデオは、Toll様受容体(TLR)シグナル伝達を阻害する可能性のある生理活性ナノ粒子をスクリーニングするためのレポーター細胞ベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ペプチド-金ナノ粒子ハイブリッドと混合したリポ多糖(LPS)を、レポータータンパク質(分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)およびルシフェラーゼ)を発現するレポーターマクロファージに導入します。ハイブリッドによって媒介されるLPS誘導TLR信号の減少は、レポーター信号を測定することによって決定されます。...

Toll様受容体シグナル伝達阻害のための生理活性ナノ粒子のスクリーニングアッセイ

このプロトコルでは、Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle...

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA...

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。...

高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

学ぶTLRシグナル阻害ナノ粒子スクリーニング法。THP-1細胞を用いたレポーター系で、炎症性疾患治療への応用が期待される高速で頑健な手法です。

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

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