異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

この実験の全体的な目的は、一般的な研究室の設定で機能的ゲノミクス研究を行うために、異種発現系においてヘテロマルチマータンパク質複合体とDNAの相互作用を研究および検証することです。この手法は、計画ゲノミクスなどの機能的ゲノミクス分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、複数のタンパク質または転写因子が関与するタンパク質-DNA相互作用を検出できることです。

この手順は、1日目と指定した日の午後に開始します。新たにストリークしたペトリ皿から、ウラシル不含の合成定義培地（SD培地）を用いて5 mLの培養を開始します。30 °Cのシェーカーで一晩インキュベートします。

翌日の午後に、10 mLのYPDA培地に500 $\mu$Lのオーバーナイト培養液を接種し、30℃の振盪培養機で一晩培養する。翌日の早朝に、100 mLのYPDA培地に2 mLのオーバーナイト培養液を接種する。この新鮮な培養液を30℃で、600 nmにおける吸光度（OD600）が0.4から0.8に達するまで培養する。

1000 ×g、21 °Cで5分間遠心分離します。上清を除去します。10 mLの滅菌水を加え、ボルテックスを用いてペレットを再懸濁します。

1000 ×g、21 °Cで5分間遠心分離します。上清を捨て、2 mLのTEリチウムアセテートを加え、ボルテックスでペレットを再懸濁します。再度、1000 ×g、21 °Cで5分間遠心分離します。

上清を廃棄します。TEリチウムアセテート4 millilitersとサモン精子DNA 400 microlitersを加え、ピペッティングによってペレットを再懸濁します。これで、次のセグメントで説明するように、細胞はトランスフェクション可能な状態になります。

細胞の共トランスフェクションは、96ウェルU底ミキシングプレートを用いて行います。まず、コンピテントセルを1ウェルあたり20 µLずつ96ウェルプレートに分注します。次に、2種類のプラスミドおよびノーマライゼーションコントロールを、それぞれ150 ngずつウェルに加えます。

この概略図は、目的タンパク質を用いた酵母細胞の共形質転換における一般的なプレート設定を示しています。プレートの設定は、実験の必要性や、テストするDNA領域または断片の数に応じて変更可能です。各ウェルに100 µLのTEリチウムアセテートポリエチレングリコールを加え、ピペッティングにより3回混合します。

プレートを透気性シールで覆い、30 °Cで20〜30分間インキュベートします。42 °Cで正確に20分間ヒートショックを行います。ヒートショック後、1000 ×g、21 °Cで5分間遠心分離します。

マルチチャンネルピペットを使用して上清を除去します。110 µLのTEを加え、混合します。再び5分間遠心分離します。

各ウェルから上清を100 µL除去します。パンチャーを100% ethanolに浸し、火炎滅菌した後、パンチャーピンが冷却されるまで1分間待ちます。その後、滅菌済みのパンチャーを用いてペレットを再懸濁します。細胞をSDトリプトファンおよびロイシン欠損プレートに移します。

プレートを30°Cで2日間インキュベートします。5日目の午後に、オーガプレートをインキュベーターから取り出します。滅菌済みの96ウェルU底ミキシングプレートの各ウェルに、50 µLのTEを満たします。滅菌済みのパンチャーをTEで予備濡らしし、SDトリプトファンおよびロイシン欠損プレートからコロニーをパンチし、TEを満たしたプレート中で再懸濁します。

最適な表面被覆率を得るため、コロニーを新しいSDトリプトファンおよびロイシン欠損培地プレートに転写します。プレートを30 °Cで2日間インキュベートします。7日目の午後に、インキュベーターからプレートを取り出します。

滅菌済みの96ウェルU底ミキシングプレートの各ウェルに、SDトリプトファン・ロイシン欠乏培地を50 µLずつ分注します。滅菌済みの96深井度ブロックの各ウェルに、SDトリプトファン・ロイシン欠乏培地を180 µLずつ分注します。パンチャーを滅菌し、パンチャーと培地で事前的に濡らした後、プレートからコロニーを、50 µLの培地が入ったウェルへ転移させます。

20 µLの酵母を、180 µLのSDトリプトファンおよびロイシン欠損培地に移します。ブロックを透気性シールで密閉し、30 °Cで振盪しながら36時間培養します。9日目の朝に、100 µLの培養液を、滅菌済みの96深井度ウェルブロック内の500 µLのYPDA培地に移します。

通気性のあるシールで密閉し、30 °Cで200 rpmの振盪条件下にて3〜5時間インキュベートする。3〜5時間後、培養液を再懸濁し、各ウェルから125 µLを分光光度計用プレートに移す。600 nmにおける吸光度を測定し、それが0.3から0.6の間であることを確認する。

ディープウェルブロック内の残りの細胞を 3000 ×g、21 °C で 10 分間遠心分離します。逆さにして上清を除去します。各ウェルに 200 µL の Z buffer を加え、ボルテックスします。

3000 G、21 °Cで5分間遠心分離します。逆転させて上清を除去します。各ウェルに21 µLのZ bufferを加え、ボルテックスします。

凍結融解サイクルに耐性のあるシーリングフォイルでプレートを密閉します。ドラフト内にて、液体窒素と42 °Cの水槽を用い、凍結融解サイクルを4回行います。各ウェルに、調製したばかりのZ buffer beta mercaptoethanol ONPG溶液を200 µLずつ加えます。

30 °Cで17〜24時間、または発色するまでインキュベートします。10日目の朝に、発色していることを確認します。各ウェルに1 M炭酸ナトリウムを110 µL加えて反応を停止させます。

時間を記録し、プレートをボルテックスする。3000 ×g、21 °Cで10分間遠心分離を行う。マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルから125 µLの上清を分光光度計用プレートに分注する。

420ナノメートルの光学的密度を測定します。テキストプロトコルに従い、スプレッドシートでβ-ガラクトシダーゼ活性を算出します。本研究では、転写開始点から上流2600塩基対のプロモーター領域を6つの領域または断片に分割しました。

この写真は、プロトコルの5日目における、良好に増殖し陽性反応を示したプレートの例です。この代表的な結果では、DNA断片1と4がタンパク質AおよびB複合体との陽性相互作用を示しています。β-ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、断片1ではレポーター遺伝子の活性が4倍に誘導されました。

この手順は、提案されたタンパク質-タンパク質相互作用を確認した後に、DNA領域に関する情報を得るためにのみ推奨されるものであり、標的部位に関する情報を提供することを目的としていないことに留意することが重要です。この手順に続き、in vivo での標的部位の特定など、追加の疑問を解決するために、ChIPアッセイやMSARなどの他の手法を実施することができます。

このビデオを視聴することで、共通のDNA標的に結合するマルチマータンパク質複合体の役割をテストおよび検証する方法について、十分に理解できるはずです。