異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

本明細書に記載の改変酵母一ハイブリッドアッセイは、任意の機能的ゲノミクス研究のための異種系におけるヘテロメリックタンパク質複合体-DNA相互作用を研究および検証するための古典的酵母一ハイブリッド（Y1H）アッセイの延長である。

この実験の全体的な目標は、通常の実験室環境での機能的ゲノム研究のために、ヘテロ系システムにおけるヘテロメアタンパク質複合体-DNA相互作用を研究し、検証することです。この手法は、計画ゲノミクスなどの機能ゲノミクス分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複数のタンパク質または転写因子が関与するタンパク質DNA相互作用を検出することです。

1日目として指定された日の午後から開始してください。縞模様の新鮮なペトリ皿から、ウラシルを含まない合成定義培地またはSD培地で5ミリリットルの培養を開始します。摂氏30度のシェーカーで一晩インキュベートします。

次の午後に、10ミリリットルのYPDA培地に500マイクロリットルの一晩培養物を接種し、摂氏30度のシェーカーで一晩インキュベートします。翌日の早朝に、100ミリリットルのYPDA培地に2ミリリットルのオーバーナイトカルチャーを接種します。この新鮮な培養物を摂氏30度で育て、600ナノメートルの光学密度が0.4〜0.8に達するまで育てます。

Gの1000倍、摂氏21度で5分間遠心分離します。上清を捨てます。10ミリリットルの滅菌水を加え、ボルテックスしてペレットを再構成します。

Gの1000倍、摂氏21度で5分間遠心分離します。上清を捨て、2 ミリリットルの TE 酢酸リチウムを加え、ペレットをボルテックスで再構成します。Gの1000倍、摂氏21度で5分間遠心分離します。

上清を捨てます。4 ミリリットルの TE 酢酸リチウムと 400 マイクロリットルのサケ精子 DNA を加え、ピペッティングで上下させてペレットを再懸濁します。これで、細胞は、次のセグメントに示すように形質転換の準備が整いました。

細胞の共形質転換は、96ウェルU底ミキシングプレートで行います。まず、96ウェルプレートのウェルあたり20マイクロリットルのコンピテントセルを分配します。次に、2つのプラスミドとノーマライゼーションコントロールをそれぞれ150ナノグラムをウェルに加えます。

この概略図は、酵母細胞と目的のタンパク質との共形質転換のためにセットアップされた一般的なプレートを示しています。プレートのセットアップは、実験の必要性や試験するDNA領域またはフラグメントの数に応じて変更することができます。1ウェルあたり100マイクロリットルのTE酢酸リチウムポリエチレングリコールを加え、ピペッティングで3回混合します。

プレートを通気性のあるシールで覆い、摂氏30度で20〜30分間インキュベートします。摂氏42度で正確に20分間のヒートショック。ヒートショック後、Gの1000倍、摂氏21度で5分間遠心分離します。

マルチチャンネルピペットを使用して上清を取り除きます。110マイクロリットルのTEを加えて混ぜます。再度5分間遠心分離します。

各ウェルから100マイクロリットルの上清を取り除きます。パンチャーを100%エタノールに浸し、炎にかけ、パンチャーピンが冷えるまで1分間待ってから、滅菌パンチャーを使用してペレットを再懸濁します。細胞をSDトリプトファンに移し、ルシネドロップアウトオーガープレートを脱落させます。

プレートを摂氏30度で2日間インキュベートします。5日目の午後、インキュベーターからオーガープレートを取り出します。滅菌済みの96ウェルU底ミキシングプレートの各ウェルに50マイクロリットルのTEを充填します。滅菌パンチャーをTEでプレウェットし、SDトリプトファンおよびルシンドロップアウトプレートからコロニーをパンチし、TE充填プレートに再懸濁します。

コロニーを新しいSDトリプトファンおよびルシンドロップアウトオーガープレートに移し、最適な表面被覆を実現します。プレートを摂氏30度で2日間インキュベートします。7日目の午後に、インキュベーターからオーガープレートを取り出します。

滅菌済みの96ウェルU底ミキシングプレートの各ウェルに、50マイクロリットルのSDトリプトファンとルシンドロップアウト培地を充填します。滅菌済みの96ディープウェルブロックの各ウェルに、180マイクロリットルのSDトリプトファンとルシンドロップアウト培地を充填します。パンチャーを滅菌し、パンチャーと培地を予湿し、プレートからコロニーをそれぞれ50マイクロリットルの培地を含むウェルに移します。

20マイクロリットルの酵母を180マイクロリットルのSDトリプトファンとルシンドロップアウト培地に移します。ブロックを通気性のあるシールで密封し、摂氏30度で36時間振とうしながらインキュベートします。9日目の朝、滅菌した96ディープウェルブロックで、100マイクロリットルの培養物を500マイクロリットルのYPDA培地に移します。

通気性のあるシールで覆い、摂氏30度で200rpmで攪拌しながら3〜5時間インキュベートします。3〜5時間後、培養物を再懸濁し、各ウェルから125マイクロリットルを分光光度計プレートに移します。600ナノメートルで光学密度を測定し、0.3〜0.6の間であることを確認します。

ディープウェルブロックの残りの細胞をGの3000倍、摂氏21度で10分間遠心分離します。反転させて上清を取り除きます。200マイクロリットルのZバッファーを各ウェルとボルテックスに加えます。

3000 G、21°Cで5分間遠心分離します。反転させて上清を取り除きます。21マイクロリットルのZバッファーを各ウェルとボルテックスに加えます。

凍結融解サイクルに耐性のあるシーリングホイルでプレートを覆います。ドラフト内で、液体窒素と摂氏42度の水浴を使用して4サイクルの凍結/融解を行います。調製したばかりのZバッファーβメルカプトエタノールONPG溶液200マイクロリットルを各ウェルに加えます。

摂氏30度で17〜24時間、または色が発達するまでインキュベートします。10日目の朝、色が広がったことを確認します。110マイクロリットルの1モル炭酸ナトリウムを各ウェルに追加して、反応を停止します。

時間を記録し、プレートを渦巻きます。Gの3000倍、摂氏21度で10分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから125マイクロリットルの上清を分光光度計プレートに移します。

420ナノメートルで光学密度を測定します。テキストプロトコルで説明されているように、スプレッドシートでベータガラクトシダーゼ活性を計算します。本研究では、転写開始部位の開始点から上流の2600塩基対のプロモーター領域を6つの領域またはフラグメントに分割した。

この写真は、プロトコルの5日目後のよく成長したポジティブプレートの例です。この代表的な結果では、DNA断片1と4はタンパク質AおよびB複合体と正の相互作用を示しています。βゴラクチシダーゼ活性を測定すると、フラグメント1はレポーター遺伝子活性の4倍誘導を示す。

この手順は、提案されたタンパク質タンパク質相互作用の確認後にのみDNA領域に関する情報を取得するために推奨され、標的部位の情報を提供するようには設計されていないことを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、チップアッセイやMsarなどの他の方法を使用して、追加の質問に答えることができます。例えば、in vivoで標的部位を特定することなどです。

このビデオを見れば、共通のDNAターゲットに結合する多量体タンパク質複合体の役割を試験し、検証する方法を十分に理解できるはずです。