準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

この方法論の全体的な目標は、細胞外フラックス分析装置を使用して、膵臓がん細胞と線維芽細胞からの3次元腫瘍ストラムスフェロイドを共培養し、代謝評価を行うことです。この方法は、腫瘍マイコが細胞代謝と薬物感受性に及ぼす影響についての質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、高速で、比較的簡単で、再現性が高いこと、および細胞整列の他のケースにも容易に適応できることです。

その手順を実演するのは、パワン・ノエルとルーベン・ムニョスです。標準的な無菌組織培養技術を使用して、目的のがん細胞と線維芽細胞を適切な増殖培地でT75フラスコで培養します。細胞が70%から80%の密度に達したら、5ミリリットルのPBSで培養物を1回洗浄し、フラスコ表面から細胞を剥離し、フラスコあたり2ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを摂氏37度で5分間行います。

顕微鏡下で剥離を確認した後、フラスコあたり8ミリリットルの成長培地でトリプシンを不活性化し、細胞を数回ピペットで動かして、カウント用の単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを新鮮な増殖培地中の1 x 10から1ミリリットルあたり6番目の細胞濃度に再懸濁します。細胞を磁化するために、成長培地に10マイクロリットルのナノシャトルを加え、100マイクロリットルの細胞を加え、溶液を穏やかに攪拌します。

チューブを数回静かに反転させ、細胞ナノシャトルミックスを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。細胞を室温で2時間、穏やかに振とうしながらインキュベートし、ナノシャトルが細胞表面に結合するのを促進します。結合インキュベーションの終了時に、各磁化細胞懸濁液をピペッティングで穏やかに混合し、培地150マイクロリットルあたり4番目の磁化がん細胞または線維芽細胞の濃度を1.5×10に調整します。

線維芽細胞とがん細胞を2対1の比率で混合し、ウェルあたり合計150マイクロリットルの播種細胞を調製します。細胞忌避剤の96ウェルプレートを、より薄い磁石で96ウェル磁気スフェロイドドライブの上に置き、150マイクロリットルの細胞混合物を各ウェルに播種します。すべての細胞を播種したら、磁気スフェロイドドライブを取り付けたまま、プレートを摂氏37度、CO2 5%で一晩インキュベー

翌朝、磁気ドライブを取り外し、細胞をインキュベーターにさらに最大7日間戻します。メタボリックアッセイの前日に、付属のユーティリティプレートでプローブカートリッジをウェルあたり200マイクロリットルのアッセイ口径で水和し、加湿した摂氏37度の非CO2インキュベーターでユーティリティプレートを一晩インキュベートします。翌朝、成長板中のスフェロイドを光学顕微鏡で観察し、その形態と全体的な均一性を確認します。

成長プレートを磁気保持ドライブに移し、ウェルあたり約120マイクロリットルの成長培地を慎重に吸引します。スフェロイドを120マイクロリットルの温めたアッセイ培地で3回優しく洗浄します。最後の洗浄後、スフェロイドが洗い流されていないことを再度顕微鏡で観察し、各ウェルに180マイクロリットルの加温アッセイ培地を添加します。

幅の広いボアチップを使用して、細胞忌避剤増殖プレートから1つの洗浄済みスフェロイドを慎重に吸引し、スフェロイドアッセイプレートの1つのウェルの中央に直接スフェロイドを静かに移すと、スフェロイドが重力によってウェルの中央のマイクロチャンバーに落下します。すべてのスフェロイドを移し終えたら、アッセイプレートを非CO2 37°C加湿空気インキュベーターに1時間置きます。インキュベーション中は、A列からH列が左側になるようにセンサーカートリッジを向き、ロードするポートに対応する文字が左上隅に来るように、カートリッジの上にローディングガイドを配置します。

プレートが均等にロードされている場合は、解析ソフトウェアを開き、[テンプレート]をクリックします。空白のテンプレートをダブルクリックし、[グループの生成]をクリックします。[プレートマップ]タブで、実験デザインに対応するグループをアッセイプレートに割り当て、バックグラウンドウェルとして4つのコーナーウェルを選択します。

装置のプロトコルタブで、キャリブレーション、平衡化、およびベースライン測定サイクルを確認します。[インジェクション]をクリックし、各ポートのコンパウンドを定義します。測定サイクルを6に変更し、プロトコルとグループの概要を確認してから、アッセイデザインテンプレートを保存します。

アッセイ設計をガイドとして、マルチチャンネルピペットを使用して各試薬を直接注入ポートに分注し、ローディングガイドを指先で所定の位置に保持します。すべての試薬がロードされたら、ローディングガイドを取り外し、カートリッジを目の高さに保持して、注入ポートが均一にロードされているかどうかを目視検査します。ユーティリティプレートのカートリッジを細胞外フラックス分析装置に移し、アッセイ前のキャリブレーションを開始します。

キャリブレーションが完了したら、ユーティリティプレートを3Dスフェロイドを含む予熱したアッセイプレートと交換し、アッセイを開始します。アッセイが終了したら、データを適切なデータ解析ソフトウェアにエクスポートします。典型的な実験では、スフェロイドの直径は、印刷後、2日目の約400マイクロメートルから7日目には約600マイクロメートルに増加しますが、7日目以降は有意な増加は観察されません。

3種類のスフェロイド培養物はすべて、糖鎖の飽和濃度の注射に応答して解糖ストレスアッセイに対して生物学的に機能的な応答を示し、それはそれらの細胞外アサーション率の増加によって証明されます。一般に、腫瘍細胞由来スフェロイドからの細胞外アサーション率シグナルは、比較的小さなPS1線維芽細胞由来スフェロイドからのシグナルと比較して、がん細胞の解糖に対する固有の代謝傾向に起因する可能性があります。この代表的な腫瘍線維芽細胞スフェロイドのミトコンドリアストレス試験では、ATPシンターゼの阻害剤に応答してミトコンドリア呼吸の減少が観察され、細胞ATP産生に使用されるミトコンドリア呼吸の割合と相関していました。

アンカップリング剤による2回目の注射では、スフェロイドの最大酸素消費量が刺激され、それに対応してミトコンドリア呼吸が増加しました。電子伝達鎖複合体1および3阻害剤の3回目の注入により、ミトコンドリア呼吸がブロックされ、酸素消費率の急激な減少が観察されました。これらのパラメータと基礎呼吸数は、スフェロイドのプロトン漏れと予備呼吸能力を計算するために使用でき、磁化されたスフェロイドのマルチパラメトリック代謝分析を提供します。

このテクニックを習得すると、うまく計画されていれば、3〜4時間で完了できます。この手順を試行する際は、メタボリックアッセイを実施する4〜16時間前に、37度のインキュベーターでプローブを水和させることを忘れないでください。スフェロイド培養手順に続いて、用量反応実験などの他のアッセイを実施して、薬効、毒性、浸透剤、感受性に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、膵臓がんの分野の研究者が、生体内の腫瘍生物学とその特性を模倣した3次元モデルで腫瘍微小環境内の腫瘍間質相互作用を探索する道を開きました。このビデオを見れば、膵臓腫瘍や線維芽細胞の培養から、細胞代謝機能の下流解析まで、3次元スフェロイドの培養方法について十分に理解できるはずです。