Name: 準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ3次元回転楕円体を用いた膵臓がん細胞と線維芽細胞の共培養法と代謝アッセイ。細胞外フルックスアナライザーで代謝機能を評価し、腫瘍微小環境と薬剤感受性の関係を解明する再現性の高い手法です。

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サミュエル ・ ザーベル培養条件を最適化し、回転楕円体の増加の監視の支援のために感謝したいと思います。タツノオトシゴ XFe96 アナライザー、アッセイ用試薬および技術的な洞察力を提供するため、アジレント ・ テクノロジーに感謝しております。英国でバーツ癌研究所で博士 Hemant コッヘルをありがとうございますまた PS1 セルを提供するため。この作品はシーナ ・ Magowitz 財団によって膵がん研究とスタンドまでがんがん研究英国ルストガルテン財団膵癌夢チーム研究助成金の部分で支えられました (許可番号: SU2C AACR DT 20 16)。がんにスタンドは、娯楽産業の基礎のプログラムです。SU2C の科学的なパートナー癌研究のためのアメリカ協会研究助成金を管理します。

1 膵癌の文化 3 d 回転楕円体による磁気バイオプリンティング <ol><li>使用標準的な無菌培養技術、培養細胞の適切な成長媒体に 70-80% の confluency に T75 フラスコへの関心の。 。
	注: 通常、70-80% コンフルエント T75 フラスコから 5-7 × 10 6 セルを収穫されました。本の研究 - Patu8902 で使用された 2 つの異なる細胞型 (膵腫瘍細胞) と PS1 細胞 (活性化された膵星細胞 21)。ロズウェル パーク記念研究所メディア 1640 (RPMI 1640 年) 10% (v/v) 胎仔牛 serum(FBS)、1 × ペニシリン-ストレプトマイシン (p/s) に両細胞株培養します</li>。
	<li>ダルベッコの 5 mL と一度セルを洗う &#39; s リン酸バッファー saline(DPBS).</li>
	<li>プラスチックからデタッチ細胞表面 0.05 %2 mL のトリプシンによってトリプシン-EDTA 37 で 5-10 分のため顕微鏡下で細胞の剥離の ° c. チェック</li>。
	<li>非アクティブ化トリプシンに 8 mL の成長媒体の添加による分離細胞です。この細胞の健康/生存率に悪影響、trypsinization を避ける</li>。
	<li>単一細胞懸濁液を生成してカウントを上下にピペットで移しなさい細胞細胞の密度自動化された細胞カウンターまたは診断を使用します</li>。
	<li>一方で、周囲温度に NS のバイアルを平衡します</li>。
	<li>は、回転楕円体 (ウェルズ) と新しい 15 mL の円錐管に因数の数をシードに必要な細胞の量を計算します。たとえば、種子全体 96 ウェル 5,000 細胞/ウェル、少なくとも 5.5 × 10 の約数 5 セルのプレートにします</li>。
	慎重に 3 分 500 × g で遠心分離による <li>収集細胞を吸引または、上清をデカントし、1.0 x 10 6 セル/mL の成長媒体の濃度で細胞を再懸濁します。ピペットの広い退屈ピペット先端部がせん断を避けを使って優しく。成長媒体の 550 μ l での 5 セルをたとえば、5.5 × 10 を再懸濁します</li>。
	<li>磁化平衡 NS (ステップ 1.6) を使用してセルの希望の金額です。
	<ol><li>直接は成長媒体に細胞懸濁液に NS を追加し、軽く振りま 。効率的な細胞の磁気ラベリング、100 μ L 細胞 (1 x 10 の 6 セル/mL で再停止される) あたり 10 μ L NS を使用します 。
		注: 典型的な実験のためラベル 5.5 × 10 5 Patu8902 セル 55 μ L NS と 1.1 × 10 550 μ L で 1100 μ L で 6 PS1 細胞 (別売) 110 μ L NS で</li>。
		細胞懸濁液を確保するため <li>軽く反転チューブは、いくつかの回。一時的に、24 ウェル プレートの単一の井戸にセル NS ミックスを転送します。着磁のセル タイプごとに個別にこれを行います。カバー プレートと細胞細胞表面への NS バインドを許可する穏やかな揺れで 2 時間室温でインキュベートします 。
		注: 文化と両方の共培養スフェロイドに加えて、Patu8902 や PS1 の単独で細胞から出発の回転楕円体の細胞磁気ドライブ上の印刷が正常に独立にこのメソッドを使用して達成される前に予混合型実験。Patu8902 と PS2 の細胞から培養スフェロイドを生成するためのメソッドは以降の手順で後述します</li>。
	</ol></li> <li>やさしく均等にミックスして目的のセル番号を含むマスター ミックスを調製磁化細胞をピペットで移しなさい。回転楕円体を播種量 150 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートを調整して (5,000 Patu8902 + 10,000 PS1) 細胞の 15,000 の合計を使用します 。
	注: 各ウェルに分配される最終巻使用セル数に関係なく同じをする必要があります</li>。
	<li>は、96-well 磁気回転楕円体ドライブ上にセル撥 96 ウェルのプレートを配置し、各ウェルにセル ミックスの 150 μ L を分注します。よく磁石上記の中心にゆっくりと収集細胞を観察します。カバーし、まだ接続されている磁気回転楕円体ドライブと 37 ° C で設定 5% CO 2 インキュベーターで一晩プレートを孵化させなさい。磁気ドライブを取り外し、最大 7 日間のさらなる成長のためインキュベートします 。
	注: ドライブ磁気回転楕円体を使用して回転楕円体印刷にセル撥成長板を使用するが重要です。薄く小さい磁石と回転楕円体のドライブを使用することを確認保持ドライブではありません</li>。
	<li>は、回転楕円体、毎日の成長を監視します。磁気ドライブを斜めに持ち、使用済みのメディアを引き出すマルチ チャンネル ピペットを使用してマウントされている成長板を配置することによってすべての 3 日間新鮮な成長媒体に補充します 。
	注: 共同で 15,000 細胞/ウェル播種 Patu8902 と PS1 のセルは 5-7 日以内 400 600 μ m の直径を持つ 3 D 回転楕円体に成長します。この時点で回転楕円体は代謝特性、薬の評価、およびその他のダウン ストリーム アプリケーションの準備ができている</li>。
</ol> 2。細胞外のフラックス アナライザーを使用して生体エネルギー経路の 3 D 膵腫瘍回転楕円体の代謝アッセイ 注: このセクションでは、細胞外のフラックスを用いた回転楕円体の代謝機能の分析で3 D 回転楕円体のために特別に設計されたアッセイ プレートとアナライザーを説明。
<ol><li>洗濯と回転楕円体からへの転送成長板回転楕円体アッセイ プレート 。
	注: 〜 500 μ m の直径に到達するとき、回転楕円体は代謝アッセイに使用可能性があります。
	<ol><li>アッセイを実行する前に日は、用意されているユーティリティ板の試金 calibrant (200 μ L/ウェル) とプローブまたはセンサー カートリッジを水和物し、インキュベート 37 で設定 (非 CO 2) 加湿のインキュベーターで一晩 (4 18 h) ° C</li>
		<li>メディアの準備、適切な試金必要な代謝アッセイの基本メディア (材料の表を参照) を補うことでいずれか 2 mM L グルタミン解糖ストレス テスト (GST) のアッセイまたは 1 mM ピルビン酸、L-グルタミン 2 mM と 10 mM のグルコース、ミトコンドリア ストレス テスト (MST) アッセイ 。
		注: 細胞フラックス アナライザーは、ミトコンドリア呼吸 (OCR) と 96 ウェル プレート形式で生きた細胞の解糖作用 (ecar と) の両方を測定します。これらの料金は、細胞の代謝機能の調査の下でサンプルの概要を示します。詳細についてはアッセイ キットのマニュアルを参照してください</li>。
		<li>(ステップ 2.1.1 参照) の特定のサプリメントをアッセイを追加後、補われたアッセイ 37 ° C の水浴中に暖かいし、7.4 ± 0.1 0.1 n とする pH 調整水酸化ナトリウム。媒体を使用するまで保温します</li>。
		<li>西川アッセイ キット試薬推奨ストック濃度校正アッセイ中です 。
		注: これらは作られて 10 × で井戸に望まれる最終濃度。グルコース、オリゴマイシンおよび 2-デオキシ-グルコース (2 DG) のストック濃度が 100 mM、100 μ M、500 ミリメートル、それぞれします</li>。
		回転楕円体と全体的な均一性; 形状と一部鉄骨をチェックする <li>光の下で成長板の観察を回転楕円体顕微鏡スフェロイドの e.</li>
		<li>磁気保持ドライブに成長板を転送し、慎重に 〜 120 μ L 成長媒体を吸引します。優しく暖め、事前に校正されたアッセイ メディアの ~ 120 μ L で回転楕円体を洗う、吸引し、洗浄を 2 回繰り返します。回転楕円体は、洗い流されなかったことを確認をもう一度顕微鏡下で回転楕円体を検査します</li>。
		<li>180 μ L 暖かいアッセイ メディアを各ウェルに追加することで楕円体アッセイ プレートを準備します</li>。
		<li>は、P20 マイクロ ピペットを 10 μ L に設定し、フィットのそれに広く退屈ヒント。きれいなハサミやメス穴を広げると通常のピペット チップの先端カット ワイド退屈ヒントが利用できない場合 。
		注: これはせん断を減らす必要があります、アッセイ プレートに転送されている間、回転楕円体の全体的な形態を保持します</li>。
		<li>は、回転楕円体の転送を実行する暖かい (37 ° C) 表面を使用します。コントラストを高めるし、転送処理中に回転楕円体の可視化を支援する白色ランプで温めた x 線フィルム ビューアー表面を使用します</li>。
		<li>慎重に広い装備 P20 マイクロ ピペットを使用してセル撥成長板から単一中古洗浄回転楕円体吸引穴先端と優しく転送回転楕円体、代謝を行うための回転楕円体アッセイ プレートの各ウェルのセンターに直接試金。アッセイ プレートを作成する純粋な重力によって各ウェルのマイクロ大広間にそっと落ちる各回転楕円体を許可します 。
		注: それは通常井戸の中心に重力によって落ちる各回転楕円体のため 5-8 秒をかかります。スフェロイドはマイクロ室に定住しているまでピペットを引っ張らないでください。行うこれらアッセイ プレート (A1、A12、H1、H12) の 4 隅の井戸でない預金回転楕円体は背景井戸として使用されます</li>。
		<li>は、各回転楕円体に確実に各井戸の中心に各回転楕円体の位置や形態を監視します。重力によって必要に応じて、ワイドを使用して回転楕円体を吸引によって井戸の中心に位置穴ピペット先端部と後続の成膜します</li>。
		<li>すべて回転楕円体が転送されている, 一度試金する 1 時間前の 37 ° C 加湿空気インキュベーター (非 CO 2) でアッセイ プレートを配置します</li>。
	</ol></li> <li>化合物とアッセイを行うセンサー カートリッジ <ol><li>準備 10 × 2.1.2 の手順に従って分析特定のメディアに特定のアッセイ試薬を集中して。たとえば、GST を遂行する分析書に推奨されるボリュームの 2 DG、オリゴマイシン、ブドウ糖を再構築します。GST と MST の試金は Patu8902 PS1 回転楕円体を用いて行った</li>。
		<li>は正しくセンサー カートリッジを左側の A ~ H のラベルの行を持つオリエントし、センサー カートリッジ上に読み込みガイドを配置します。ロードするポートに対応する文字が左上隅にくるようにローディング ガイドを定位によって目的のポートの正しい読み込みを確実します</li>。
		<li>注入ポートに直接試薬を分注マルチ チャンネル ピペットを使用しています。プロシージャ全体で指先を使用して位置に読み込みガイドを保持します 。
		注: 各試薬は、分析書記載推奨ポートに挿入されます。空気の泡の作成を避けるため、空気の泡を削除するカートリッジの任意の部分をタップしないようにします</li>。
		<li>ロード ガイドとカートリッジと目の高さの位置に荷を積むため注入ポートを目視で確認する削除します</li>。
		<li>セクション 2.3 で説明されているように音源コント ローラー波ソフトウェア (今後、解析ソフトウェア) を使用して実験的アッセイ デザイン/楽器のプロトコルを作成します</li>。
	</ol></li> <li>試金のデザインと解析ソフトウェアを使用して実行 <ol><li>実験のための試金テンプレートの作成 <ol><li>解析ソフトウェアを開きをクリックして &#34; テンプレート &#34; または既存の試金から選択テンプレートです。ダブルクリックして &#34; 空白のテンプレート &#34;.</li>
			<li>を定義する実験的グループおよび条件。
			<ol><li>ポート A、B、および C. を残すのため注入の定義戦略ポート D 空 。
				注意: GST の試金のためこれらのポートのみがグルコース、オリゴマイシン 2 DG と読み込まれます。ロテノン、FCCP オリゴマイシン MST アッセイの場合を読み込まれます</li>。
				<li>定義前処理回転楕円体は、1 つまたは複数のテスト混合物および制御グループと扱われた場合。ソース、サプリメント、その他の情報など、アッセイ メディアを定義します</li>。
				<li>密度および通路番号の情報を見て 1 つまたは複数のセル型 (例: Patu8902、PS1) を定義します</li>。
			</ol></li> <li>をクリックして &#34; グループの生成 &#34;.</li>
			<li>をクリックして &#34; プレート マップ &#34; タブし、実験的なデザインに対応するアッセイ プレートにグループを割り当てます</li>。
			<li>は、バック グラウンド井戸として 4 つのコーナーの井戸を選択します。これらの井戸の回転楕円体がないことを確認します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>アナライザーで分析を実行 <ol><li>計測器プロトコル タブをクリックしてチェックして既定プロトコル コマンドそのまま &#34; 調整 &#34;、&#34; Equilibrate &#34; と &#34; ベースライン測定サイクル &#34;.</li>
		<li>クリック &#34; 注射 &#34; し、各ポートの化合物を定義します。測定サイクル 6 サイクルから編集既定の回転楕円体のための 3 つのサイクル。デフォルト 3 分ミックス、0 分の待ち時間 3 分測定時間を維持します 。
		注: 既定のメジャー ミックス待機時間、3 分、0 分、3 分、それぞれ。3 つの基底率測定は最初試金化合物の注入の前に通常されます。これらの測定値をキャリブレーションし、実験的なデザインによって再調整することができます</li>。
		<li>プロトコルとグループの概要を確認します</li>。
		<li>アッセイ デザイン テンプレートを保存します</li>。
		試金基板を注入ポートが読み込まれると、<li>は事前測定校正に進みます。細胞外フラックス アナライザーにユーティリティ プレート付きカートリッジを転送します 。
		注: この通常 15-20 分以内に完了、OCR と ecar と測定センサーをキャリブレーションします</li>。
		<li>カートリッジのキャリブレーション後 3 D 回転楕円体を含む予め温めておいたアッセイ プレートとユーティリティ プレートを交換し、分析を開始します。測定が完了したら、データをスプレッドシートやグラフと統計ソフトウェアのデータを分析にエクスポートします</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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著者ジョージ w. ロジャースとアンドリュー ・ ニールソンは、試薬とこの記事で使われている楽器を生産するアジレント ・ テクノロジーの株主です。他のすべての著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

膵がん, 3rdを使用して24例では、モデルでは、迅速かつ一貫性のあるメソッドとして成長し、アッセイの膵臓癌細胞の共培養を用いた 3 D 回転楕円体に開発されたアメリカ合衆国の死亡に関連がんの原因をリードし、膵線維芽細胞を活性化。磁気バイオプリンティングを使用すると、回転楕円体サイズ直径 400 600 μ m に至るまでを得た。これらは代謝アッセイ培養 3 D 回転楕円体の機能を正常にテストを受けた。このメソッドは、単純で一貫性があり、他の細胞型に容易に適応することができます。
この方法論は加速され、3 D 回転楕円体を使用して実行の試金の並進の値に追加、間は、回転楕円体の操作の多重化と処理ができる技術を開発することによって改善できます。これは、全体的な時間とコストの試金を遂行するために必要な労働をさらに減らす必要があります。さらに、回転楕円体のボリュームは、OCR 信号6他の人によって報告されるように正規化するため可能性があります。セルあたりの OCR を決定するセルの平均ボリュームによって正規化された回転楕円体ボリュームを使用できるが、回転楕円体の成長はできません同一が、以来セルあたり絶対 OCR の計算に挑戦する可能性があります。現在のところ、この方法論は、環境を試金する成長板から多重回転楕円体処理と転送に効率的なツールの不足によって制限されます。
説明した方法の変更し磁気バイオプリンティング技術から適応し、さらに下流の代謝アッセイに培養スフェロイドを適用することによって機能の関連性を検証します。メソッドは、ほとんどの腫瘍組織、がん細胞と癌線維芽細胞、他の治験のアッセイに用いることができる、これは、2 つの主要な細胞タイプを含む堅牢な実行可能な機能的な回転楕円体を生成するための重要なツールを提供します。など薬の画面。相対的な容易さと NS 手法の効率は、ハンギング ドロップ法2,26回転楕円体生成のなど、他のメソッドの25、上主要な改善です。
よう生成される堅牢な回転楕円体は、多くの三次元培養研究から行方不明が多い間質細胞を含む体外腫瘍モデルを提供します。その生成された 3 D 回転楕円体モデルの適用の可能性は広大であります。たとえば、細胞間相互作用、生体エネルギー シフトを調査し、遺伝的感受性と様々 な治療レジメンの依存性をテストするようなモデルを使用できます。生体内で腫瘍微小環境を再現 3 D 回転楕円体は、創薬スクリーニング研究と現在と新規治療法の作用機序を調べて高関連で便利なツールとして機能します。代謝アッセイ変異細胞の文化はそれらの遺伝子と癌の関連性の高い 3 D モデルの病理学の関連経路の役割に新しい光を当てる助けるかもしれない回転楕円体を使用してエネルギーの経路を探る本研究で説明した回転楕円体のような。
このメソッドの成功のアプリケーションは何よりも対数段階で成長している細胞を収穫し、磁化する必要があります理由は磁気印刷に必要な細胞の健康に依存しています。磁化細胞および回転楕円体の洗浄およびメディア記述法の手順を補充時にのみ活用すべき持株ドライブない印刷する磁気回転楕円体のドライブを使用するが重要です。代謝アッセイの成功の読み出しのための他の最も重要な側面は、成長板からアッセイ プレートへの転送処理中に、回転楕円体の形態を維持するためにです。
全体的に、このプロトコルは癌と間質細胞、細胞外フラックス アナライザーを使用して回転楕円体の後続の代謝アッセイを含む 3 D 回転楕円体の生成のために確立されています。このメソッドの主な機能は、クイック、簡単に適応可能な一貫性のあるに関連して体内の腫瘍微小環境を模倣が比較的高価と抗癌がん生物学研究・開発のための新しいツールとなります。エージェント。

過去 10 年間で数多くの in vitro 3 D モデルに要約し、生体内で腫瘍生物学、微小環境と成長の条件がん細胞1,2を調査しました。2 次元 (2 D) 単層細胞培養化合物、細胞を介して拡散のグラデーションにさらされるネイティブ 3 D 腫瘍間質相互作用をレプリケートに失敗する生化学的要因と被験化合物に均一照射システムマトリックス蛋白質 (ECM)3,4。したがって、2次元培養モデルと比較して 3 D がんモデルが腫瘍微小環境をシミュレートするに潜在性を示しより登場し、重要なツールとして提供していますは生体内で腫瘍の特徴は、低酸素症などを理解します。desmoplasia、休眠、薬剤浸透度、毒性、治療抵抗5,6。このため、3 D モデル急速な生成と一貫性のため比較的安価で最適化しながら、腫瘍生体内機能を模倣して 2 D の細胞培養および全体の動物モデルの間のギャップを埋めるための可能性があります。これらの利点は、がん生物学、形態形成と組織工学7、8を含む多くの分野で研究を加速するために悪用されています。
3 D 培養方法の進化の急増は、磁気浮上技術が近年発展し、成長について、様々 な細胞タイプ9,10、から派生した試金および回転楕円体のイメージング11,12. 磁気 3 D バイオプリンティング悪用の磁化のナノ粒子の生体適合性を持つ細胞とウェル フォーマットの印刷によって組織をエンジニア リングの磁気力を使用します。これにより、一貫性のある、活かしたし、生化学的および生物物理調査10のダウン ストリーム アプリケーションの茄多のために採用することができます同じ 3 D のスフェロイド近くの迅速な生産。ここで、我々 と呼ばれる Nanoshuttle (NS) は、酸化鉄、ポリ L リジン、膵がん細胞と線維芽細胞をラベルする金ナノ粒子で構成される生体適合性材料を用いた磁気バイオプリンティング法を適応しています。任意の特定の受容体に結合する細胞膜と静電 NS つくは知られていないとセルをリリース表面 1 週間以内。それは非常に低い磁気力 (30pN) を必要とする、集計がなく、害は細胞し細胞生存率、代謝や増殖させる 3 D 文化10,13,14 の非常に生体適合性には影響しません ,15。
本研究では例とモデルでは、膵癌を使用して生成と述べる 3 D がん細胞線維芽細胞スフェロイドの代謝アッセイ。磁気バイオプリンティングを用いた膵腫瘍の線維芽細胞共培養スフェロイドの文化と成長条件を示す 2D 容器で培養された細胞から始まって、.スフェロイド培養細胞フラックス アナライザーを使用して機能の代謝アッセイに使用された、2 つの主要なエネルギー生産経路、解糖系とミトコンドリア呼吸、さまざまなライブで同時に測定する技術を実証細胞や組織16,17,18,19,20。解糖系には、酸素消費量 (OCR) として、ミトコンドリア呼吸または酸化的リン酸化を測定したときの細胞の酸性化率 (ecar と) の変化として測定しました。膵腫瘍回転楕円体のために開発されたこのメソッドが最適化および腫瘍の 3 D 回転楕円体生成とアッセイによる細胞・組織以外の翻訳のためのバックボーンとして使用できることを提案します。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン EDTA</td><td>シグマ</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル 細胞忌避板</td><td>USA Scientific/Griener Bio-One</td><td>655970</td><td>スフェロイド成長板</td></tr><tr><td>セロメトリー 細胞計数スライド</td><td>Nexcelom&nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ギブコ</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>解糖ストレステストキット</td><td>アジレントテクノロジー</td>ズ <td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>シグマ</td><td>59202C</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial ストレステストキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>n3D 磁気スフェロイド駆動</td><td>ナノ3Dバイオサイエンス</td><td>655841</td><td>スフェロイドバイオプリンティングKit</td></tr><tr><td>n3D 磁気回転楕円体保持駆動</td><td>ナノ3Dバイオサイエンス</td><td>655841</td><td>Spheroid Bioprinting Kit</td></tr><tr><td>n3D NanoShuttle-PL&nbsp;</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Spheroid Bioprinting の一部 Kit:&nbsp; 4 °C で保存;C</td></tr><tr><td>Patu8902細胞</td><td>実験室ストック</td><td></td><td>膵管腺癌細胞</td></tr><tr><td>PS1細胞</td><td>実験室ストック</td><td></td><td>活性化膵臓星細胞</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>細胞、スフェロイド</td></tr><tr><td>用増殖培地SeaHorse XFe96 細胞外フラックス分析装置</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>細胞外フラックス分析装置</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>XF ベースメディア</td><td>Agilent Technologies</td><td>102365-100</td><td>XFe96</td></tr></tbody></table>

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

、膵がんなど多くのがんの種類には、腫瘍の進行と侵攻に重要な役割を果たしている密な線維性間質があります。活性化癌線維芽細胞は、がん細胞と対話し、彼らの成長と生存をサポート腫瘍間質のキー コンポーネントです。がん細胞との相互作用を要約し、線維芽細胞を活性化するモデルは、間質の生物学を勉強するため、抗腫瘍剤の開発のための重要なツールです。 ここでは、膵臓癌細胞とその後の生物学的研究に使用できる活性の膵線維芽細胞の共培養を堅牢な 3 次元 (3 D) 回転楕円体の急速な生成の方法を説明します。さらに、説明は細胞外フラックス アナライザーを使用して細胞の生体エネルギー経路を調査する機能代謝アッセイを実施で 3 D 回転楕円体の使用は回転楕円体のマイクロ プレートとペアすること。膵癌細胞 (Patu8902) の活性化された膵線維芽細胞 (PS1) 共同培養し、生体適合性ナノ粒子のアセンブリを使用して磁化が。磁化細胞は急速に文化の 5-7 日以内 400 600 μ m の間で及ぶ直径の回転楕円体を生成する成長媒体で 96 の井戸のフォーマットで磁気ドライブを使用して bioprinted.Patu8902 PS1 回転楕円体を使用して機能の代謝アッセイは細胞フラックス技術を使って細胞の精力的な経路を調べるうち、行った。メソッド本は簡単、一貫したがん細胞線維芽細胞スフェロイド共培養により、可能性のある現在の記述方法の最適化時に他のがん細胞の種類に適応することができます。

磁気バイオプリンティングと 3 D 回転楕円体の細胞外フラックス解析の一般的なワークフロー 
図 1は、このプロトコルで記述されている全体のプロセスの概要を示しています。膵癌細胞 (Patu8902) と活性化星細胞 (PS1) は、70-80% の confluency に適切な成長媒体を含む培養フラスコで培養しました。細胞 2次元培養器から分離されて洗浄、細胞密度を求めたし、最後に 1 × 106セル/mL での成長媒体で再停止されるセルします。NS、金・酸化鉄・ ポリ L リジンから成るナノ粒子アセンブリは、細胞を磁化させるのに使用されました。Patu8902 と PS1 の細胞を個別に磁化された混合し、磁気回転楕円体ドライブにマウントされている 96 ウェル セル撥成長板に印刷します。我々 は、単一の井戸 (単一の回転楕円体を生成する 10,000 の PS1 細胞と混合 5,000 Patu8902 細胞) を播種のセルの合計数を 15,000 を最適化してきました。5-7 日間の適切な培養条件下で培養後は、時間の間にこれらの回転楕円体の成長は監視し、記録、3 次元回転楕円体が得られました。アッセイ メディアで洗浄後、回転楕円体は解糖系とミトコンドリア呼吸の同時測定用細胞フラックス アナライザーを使用して代謝の試金を遂行する回転楕円体のマイクロ プレート上に物理的に転送されました。
文化と膵腫瘍の線維芽細胞スフェロイドの成長 機能的で堅牢な回転楕円体を得るためには、上皮性の癌細胞ラインの Patu8902 と PS1 培養ウシ胎児血清添加 RPMI 1640 年に星状の細胞を活性化します。Pat8902 と NS で磁化 PS1 細胞が混ざる 1:2 の比率で成長板の井戸あたり 15,000 のセルの合計をシードするために。井戸の中心に磁気ドライブ上にセルを印刷する 24 h 内細胞のおくべき focalized る各井戸の下で各磁気ピン上に正確。Patu8902 PS1 回転楕円体の成長は、細胞を播種後 2、4、7、9 日にイメージングによる監視されました。図 2は、上記の様々 な時点で代表的な回転楕円体の平均直径の数量を示します。回転楕円体の直径は 7 日目 596 μ m に 2 を印刷投稿日 414 μ m から増加します。9、7 の日に成長に有意差はなかった、従ってすべてさらに実験は回転楕円体成長の 7 日間に限られていた。我々 に気づいたスフェロイドは特に外側の縁の周りのシャープな形態を獲得し、NS は徐々 により均等に全体に拡散される回転楕円体の体積と文化のより多くの日。また 10 回転楕円体の長軸と短軸の長さに基づいての真球度を推定しました。平均の真球度は 0.92 ± 0.04 Patu8902 だけ (腫瘍) の 0.95 ± 0.04 PS1 (間質) だけで、0.94 ± 0.02 共同文化回転楕円体のため。
を用いた膵 3 D 回転楕円体の機能代謝アッセイ、細胞外フラックス アナライザー 我々 は代謝を採用、回転楕円体の機能をテストして回転楕円体のエネルギー経路をプローブする生体エネルギー分析。スフェロイド培養前述のように解糖系のストレス テストを実施しました。このため、種類の 2 つの細胞の共培養に起因以外 Patu8902 か PS1 の細胞から生成された回転楕円体はアッセイを受けた。興味深いことに、3 種類の回転楕円体、すべて異なるまたは混合細胞由来かどうか展示 GST アッセイに生物学的機能の応答。ブドウ糖の飽和濃度を注入した上でスフェロイド型テストを増加解糖系 ecar と (図 3) の増加によって立証されます。とき、オリゴマイシンを使用してミトコンドリアの ATP の生産が抑制され, エネルギー生産は解糖系にシフトし、ecar とのさらなる増加と見られて最大の解糖系能力に細胞をプッシュします。競争力のある ecar との事前の増加した解糖系活動のためことを確認 ecar との減少で起因したグルコース ヘキソキナーゼをバインドするグルコースのアナログ 2 DG を使用して解糖系抑制。我々 は本研究でテスト回転楕円体がこの方法で応答したことに気づいた PS1 だけでスフェロイド (平均粒径 250 μ m) より小さいサイズ、Patu8902 がんに比べて低い解糖系能力のための比較的低い信号があったがセル (平均直径 600 μ m) です。一般に、高い ecar と信号由来腫瘍細胞からの比較的小さい PS1 線維芽細胞からのそれらと比較して回転楕円体回転楕円体を派生、おそらく癌細胞の解糖系22、に向かって固有代謝傾斜に起因する可能性が 23。3 種類の回転楕円体のすべてが同じ数の細胞を播種から派生した共培養スフェロイド、続いて各型、PS1 だけで回転楕円体、最小されている間回転楕円体サイズの変異に気づいた私たちが Patu8902 だけで回転楕円体のことと、最大。
3 D 回転楕円体でミトコンドリアの機能をテストするため MST アッセイに共培養スフェロイドを服従します。MST は、細胞 (図 4Aと4 b) の OCR を直接測定することにより、ミトコンドリア機能の重要なパラメーターを測定します。化合物 (オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、アンチマイシン A のミックス) とシリアルの注入は、ATP 生産、最大呼吸と非ミトコンドリア呼吸などミトコンドリアの重要なパラメーターを測定する使用されました。これらのパラメーターと基底の呼吸速度さらにプロトン リークと呼吸器の余力 (図 4) を計算する使用されました。OCR のオリゴマイシンに応えての減少、ATP 合成酵素 (複雑な V) の阻害剤は細胞の ATP の生産に関連付けられているミトコンドリア呼吸に相当します。最大の浸透と効率的な応答時間を許可するように長い期間のオリゴマイシンとスフェロイド培養。FCCP ランプと第 2 の注射は、最大酸素摂取量および OCR の対応する増加を刺激します。FCCP 刺激 OCR は、呼吸器の余力、増大するエネルギー需要に対応するセルの能力の指標を計算する使用されました。3 番目の注入;ロテノン、ミックス、(複雑な私阻害剤)、アンチマイシン A (複合体 III 阻害剤) として OCR (図 4Bの急激な減少を見て、ミトコンドリア呼吸をブロックオング >)。
全体的にみて、私達の観察は、培養スフェロイド代謝フット プリント/活動両方解糖系とミトコンドリアの可能性の観点からの措置として細胞フラックス アナライザーを使用して前述の機能を確認します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
図 1.文化と膵臓癌細胞・線維芽細胞スフェロイドの試金の方法論の概略図。Patu8902 と PS1cells が培養、トリプシン、洗浄、カウントされます。各回転楕円体、Patu8902 をシードに (5,000 細胞/ウェル) PS1 線維芽細胞 (10,000 細胞/ウェル) は NS を使用して、1 日目にセル撥成長板に印刷が磁化されたと。播種後成長板が (96 の井戸のフォーマットの成長板の下で 1 つの磁石) 磁気回転楕円体のドライブにマウントされ、3 D 回転楕円体を取得する 2-7 日間培養すること。結果回転楕円体は、洗浄され、細胞フラックス計測器で代謝の試金を遂行する回転楕円体アッセイ プレートに転送。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
図 2.膵腫瘍の線維芽細胞スフェロイドの成長です。(文化の日に対応する Patu8902-PS1 共培養スフェロイドの A) の代表的なイメージは上、下回転楕円体 (μ m) の直径の大きさを定量化します。進歩的な増加回転楕円体およびそのボリューム全体で NS 粒子 (暗いドット) の拡散は、2 日から 7 日間明らかです。回転楕円体は、回転楕円体直径の大幅な増加で起因しなかったが、この後追加 2 日間文化で保管されました。(B) 回転楕円体に由来する腫瘍細胞 (Patu8902)、間質細胞 (PS1) と共培養細胞 (Patu8902 + PS1) の写真が表示されます。(C) 真球度のデータは、各グループから 10 の各回転楕円体から描かれています。エラーバーは標準偏差 (SD) を表します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
図 3.膵回転楕円体と解糖系のストレス テスト (GST).(A) 描かれている様々 なアッセイ パラメーターを持つ典型的な解糖系機能アッセイの略図。(B) GST テストの例は、方法論を用いて培養した膵回転楕円体に実行されます。Ecar と、ミトコンドリア呼吸を遮断するオリゴマイシンのなお一層の増加の増加と見られて解糖をブドウ糖注射ランプ。Ecar とは、解糖作用をブロックすることによって、ブドウ糖の競争力のあるアナログ 2 DG への応答に落ちる。すべて回転楕円体は、GST の試金に機能的な応答を示すに記載されています。(C) GST アッセイの 3 つの主要なパラメーターを描いた製造元のレポート ジェネレーターを使用して GST アッセイの出力。誤差範囲 (SEM) の平均の標準誤差を表しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
図 4。Patu8902 PS1 回転楕円体とミトコンドリア ストレス テスト (MST).(A) 様々 なアッセイ パラメーターを持つ典型的なミトコンドリア機能アッセイの模式図が描かれています。(B) 膵腫瘍の線維芽細胞スフェロイドの MST の例を示します。(C) 培養 3 D 回転楕円体は、MST の測定に機能的な応答を示します。予想通り、OCR の低下として測定されるミトコンドリアの機能は回転楕円体のオリゴマイシン、ATP 合成酵素阻害剤で挑戦されたときに気づいた。FCCP を使用して電子の流れを強化する最大の OCR を用いたミトコンドリア呼吸量の抑制にすぐに崩壊で起因した - ミトコンドリアの複雑な阻害剤のカクテル。誤差範囲 (SEM) の平均の標準誤差を表しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、メソッドは、膵臓がん細胞と線維芽細胞、細胞外フラックス アナライザーを使用して代謝機能の測定に続いての 3 次元 (3 D) 回転楕円体共培養の準備のため説明します。

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

この手法の全体的な目的は、膵癌細胞と線維芽細胞からなる三次元腫瘍間質スフェロイドを共培養し、細胞外フラックスアナライザーを用いてその代謝評価を行うことです。この方法は、腫瘍微小環境が細胞代謝および薬剤感受性に及ぼす影響に関する疑問を解決するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、迅速で比較的容易であり、再現性が高いこと、そして他の細胞株への適応が容易であることです。手順のデモンストレーションを行うのは、Pawan NoelとRuben Munozです。標準的な無菌組織培養技術を用いて、目的のがん細胞および線維芽細胞を、適切な増殖培地を入れたT75フラスコで培養します。細胞が70%から80%のコンフルエンシーに達したら、5 mLのPBSで培養物を1回洗浄し、1フラスコあたり2 mLの0.05%trypsin EDTAを用いて、37 °Cで5分間、細胞をフラスコ表面から剥離させます。顕微鏡下で剥離を確認した後、フラスコあたり8 mLの増殖培地を加えてトリプシンを不活化し、ピペッティングを数回行い、カウント用の単一細胞懸濁液を作成します。遠心分離により細胞を回収し、新鮮な増殖培地を用いて1 x 10⁶ cells/mLの濃度でペレットを再懸濁します。細胞を磁性化させるため、増殖培地で希釈したnanoshuttleを10 µL、細胞懸濁液を100 µL加え、溶液を静かに撹拌します。チューブを数回ゆっくりと転倒混和し、セルナノシャトル混合液を24ウェルプレートの各ウェルに分注します。セル表面へのナノシャトルの結合を促進するため、室温で2時間、緩やかに振盪しながら細胞をインキュベートします。結合インキュベーションの終了後、ピペッティングにより各磁性細胞懸濁液を静かに混合し、磁性がん細胞または線維芽細胞の濃度を、培地150 µLあたり1.5 x 10⁴個に調整します。線維芽細胞とがん細胞を2:1の比率で混合し、1ウェルあたり合計150 µLの播種細胞量とします。薄型磁石を備えた96ウェル磁気スフェロイドドライブの上に、細胞忌避性の96ウェルプレートを配置し、各ウェルに細胞混合液150 µLを播種します。すべての細胞を播種した後、磁気スフェロイドドライブを装着したまま、37 °C、5% CO2条件下でプレートを一晩インキュベートします。翌朝、マグネティックドライブを取り外し、細胞をインキュベーターに戻して最大7日間さらに培養します。代謝アッセイの前日に、付属のユーティリティプレートを用いて、1ウェルあたり200 microlitersのアッセイキャリブレーターでプローブカートリッジをハイドレーションし、加湿された37 degree celsiusの非CO2インキュベーターでユーティリティプレートを一晩インキュベートします。翌朝、光学顕微鏡で培養プレート内のスフェロイドを観察し、形態と全体的な均一性を確認します。培養プレートをマグネットホルダーに載せ、各ウェルから約120 µLの増殖培地を注意深く吸引して除去します。温めたアッセイ培地 120 µLを用いて、スフェロイドを静かに3回洗浄します。最後の洗浄後、顕微鏡下で再度スフェロイドを確認し、洗い流されていないことを確かめてから、各ウェルに温めたアッセイ培地 180 µLを加えます。ワイドボアチップを用いて、細胞 repellent 成長プレートから予め洗浄したスフェロイドを1つずつ慎重に吸引し、スフェロイドアッセイプレートの1ウェルの中心へ直接、緩やかに転送し、重力によってスフェロイドがウェル中央のマイクロチャンバーに落ちるようにします。すべてのスフェロイドを転送した後、アッセイプレートを非CO2 37 °C 加湿空気インキュベーターに1時間置きます。インキュベーション中に、センサーカートリッジのA行からH行が左側にくるように向きを合わせ、ロードするポートに対応する文字が左上隅にくるように、カートリッジの上にローディングガイドを配置します。プレートに均一に分注されていれば、解析ソフトウェアを開き、「templates」をクリックします。「blank template」をダブルクリックし、「generate groups」をクリックします。「plate map」タブで、実験計画に従ってアッセイプレートにグループを割り当て、四隅のウェルを背景（バックグラウンド）ウェルとして選択します。インストルメントプロトコルタブで、キャリブレーション、平衡化、およびベースライン測定サイクルにチェックを入れます。「インジェクション」をクリックし、各ポートに使用する化合物を定義します。測定サイクルを6回に変更し、プロトコルとグループサマリーを確認した後、アッセイ設計テンプレートを保存します。アッセイ設計をガイドとして、マルチチャンネルピペットを使用して各試薬を注入ポートに直接分注し、その際、指先でローディングガイドを固定してください。すべての試薬をロードした後、ローディングガイドを取り外し、カートリッジを目線の高さに持って、注入ポートに均一にロードされているか視覚的に確認します。カートリッジをユーティリティプレートから細胞外フラックスアナライザーに移し、アッセイ前のキャリブレーションを開始します。キャリブレーション完了後、ユーティリティプレートを、3Dスフェロイドを含むあらかじめ温めておいたアッセイプレートに交換し、アッセイを開始します。アッセイ終了後、データを適切なデータ解析ソフトウェアにエクスポートします。標準的な実験では、プリント後2日目の約400 µmから7日目のほぼ600 µmまでスフェロイドの直径が増加し、7日目以降は有意な増加は見られません。3種類すべてのスフェロイド培養において、飽和濃度のグルコース注入に対する解糖系ストレスアッセイへの生物学的な機能応答が認められ、これは細胞外酸性化率の上昇によって裏付けられています。一般的に、比較的サイズの小さいPS1線維芽細胞由来のスフェロイドからのシグナルと比較して、腫瘍細胞由来のスフェロイドからより高い細胞外酸性化率のシグナルが得られることは、がん細胞が本来的に解糖系への代謝傾向を持っていることに起因すると考えられます。この腫瘍線維芽細胞スフェロイドの代表的なミトコンドリアストレステストでは、ATP合成酵素阻害剤への応答としてミトコンドリア呼吸の低下が観察され、これは細胞のATP産生に利用されるミトコンドリア呼吸の割合と相関していました。次に脱共役剤を注入すると、スフェロイドの最大酸素消費量が高まり、それに伴いミトコンドリア呼吸が亢進しました。続いて、電子伝達系複合体IおよびIIIの阻害剤を注入したところ、ミトコンドリア呼吸が遮断され、酸素消費速度の急激な低下が観察されました。これらのパラメータと基礎呼吸速度を用いることで、スフェロイドのプロトンリークおよび予備呼吸能を算出でき、磁性スフェロイドの多角的な代謝解析が可能となります。この手法に習熟し、適切に計画を立てれば、3〜4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、代謝アッセイを実施する4〜16時間前に、37°Cのインキュベーター内でプローブを水和させることを忘れないでください。スフェロイド培養の手順に続いて、薬効、毒性、浸透性、感受性に関するさらなる疑問を解消するために、用量反応試験などの他のアッセイを実施することが可能です。本技術の開発により、膵がん分野の研究者は、生体内の腫瘍生物学とその特性を模倣した3次元モデルを用いて、腫瘍微小環境における腫瘍ストロマの相互作用を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、培養された膵腫瘍細胞および線維芽細胞から、3次元スフェロイドの培養、さらには細胞の代謝機能のダウンストリーム解析に至るまでの一連の手法を十分に理解できるはずです。

preparation-metabolic-assay-3-dimensional-spheroid-co-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、共培養された膵臓がん細胞と線維芽細胞の3D磁気バイオプリンティングについて説明しています。膵臓がん細胞と活性化した膵臓線維芽細胞を、生体適合性ナノ粒子集合体を用いて共培養・磁化し、磁力の影響下でスフェロイドを作製します。...

磁気的にバイオプリントされた3Dスフェロイド共培養:癌細胞と線維芽細胞の共培養法

このプロトコルは、膵臓癌細胞（Patu8902）および活性化膵臓線維芽細胞）(PS1)の共培養から生成された3Dスフェロイドに対して細胞外フラックスアッセイを行う技術について説明し、解糖とミトコンドリア呼吸という2つの主要なエネルギー産生経路を測定するためのものです。...

3Dスフェロイドにおける細胞外フラックスアッセイ:膵臓腫瘍スフェロイドの代謝活性を測定する方法

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。...

腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。...

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。...

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

膵臓がんは、依然として治療が最も困難ながんの1つです。したがって、治療効果を評価する前臨床モデルが再現性があり、臨床的に関連性があることが重要です。このプロトコールは、再現性があり、臨床的に関連性のある線維形成性スフェロイドを生成するための簡単な共培養手順を説明しています。...

共培養による線維形成性三次元膵臓がんスフェロイドの増殖

学ぶ3次元回転楕円体を用いた膵臓がん細胞と線維芽細胞の共培養法と代謝アッセイ。細胞外フルックスアナライザーで代謝機能を評価し、腫瘍微小環境と薬剤感受性の関係を解明する再現性の高い手法です。

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

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