Name: 高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶシナプトソームドーパミン取り込みとHPLC分析によるマウスドーパミン作動性恒常性の評価法。脳組織からドーパミン含量とトランスポーター機能を測定し、神経伝達動態の理解に貢献します。

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この作品は、UCPH 2016 プログラムの卓越性 (アリフール、u. g. k. j.) によって支えられた、ルンドベック財団 (原産地) 膜のナノ医療 (u. g.)、国立研究所の健康補助金 P01 DA 12408 (u. g.)、デンマーク ルンドベック財団センター-医療科学 (u. g.) の独立した研究協議会。

<ol><li>Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+modulation+of+synaptic+transmission+in+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum.</a> Neuron. 76, 33-50 (2012).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
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<li>Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamine+transporters%3A+from+genes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Monoamine transporters: from genes to behavior.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).</li>
<li>Runegaard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+dopaminergic+homeostasis+and+dopamine-related+behaviour+in+hemizygous+TH-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice.</a> Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).</li>
<li>Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation+of+synaptic+vesicles+from+nerve-ending+particles+%28%27synaptosomes%27%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes').</a> Biochem J. 90, 293-303 (1964).</li>
<li>Hornykiewicz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+%283-hydroxytyramine%29+and+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function.</a> Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).</li>
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<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
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<li>Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+biotinylation%3A+an+ex+vivo+approach+to+measure+region-specific+plasma+membrane+protein+trafficking+in+adult+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Rickhag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+PDZ+domain-binding+sequence+is+required+for+striatal+distribution+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter.</a> Nat Commun. 4, 1580(2013).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
<li>Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission.</a> J Neurochem. 87, 273-289 (2003).</li>
<li>Yang, L., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+neurotransmitter+levels+in+models+of+Parkinson%27s+disease+by+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD.</a> Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).</li>
<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
<li>Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+increases+in+nucleus+accumbens+dopamine+after+systemic+cocaine+administration+are+caused+by+unique+characteristics+of+dopamine+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission.</a> J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).</li>
<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
<li>Atack, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+dopamine+by+a+modification+of+the+dihydroxyindole+fluorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay.</a> Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
<li>Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA+pharmacokinetics+in+the+MPTP-lesioned+macaque+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease.</a> Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).</li>
<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+dopamine+regulation+in+substantia+nigra+and+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
<li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4371656">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).</li>
<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

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本稿では、選択肢の任意のマウス モデルの DA 恒常性を記述する有用な実験的プロトコルについて説明します。ダット DA 輸送機能を評価するために高速液体クロマトグラフィーとシナプトソーム DA 吸収を用いたマウスから DA の脳組織のレベルを測定の詳しいプロトコルをいたします手順、プロトコルおよび高速液体クロマトグラフィーの実験とシナプトソーム DA 取り込みアッセイの制限、以下で詳述されるが。
シナプトソーム取り込みプロトコルは表面ビオチン化実験13ダット複合の機能に有用な洞察力を提供することができます、合計金額、表面のレベルと DAT の機能に関する知識を得ることができます。DAT と DA 伝送への影響と様々 な病気への参加の大きな役割を与えられて、それは DAT 関数モデルの試金を確立する主要な目標をされています。シナプトソーム DA 吸収実験の利点の 1 つはよう chemogenetic 操作またさまざまな生体内の薬物治療または行動に加えトレーニング時に生体内で操作実行ポストすることがで...

ドーパミン (DA) は、モーターの挙動、報酬と認知機能1,7,8,9の重要な調節神経伝達物質です。DA の恒常性の不均衡は、注意欠陥多動性障害、薬物中毒、うつ病、パーキンソン病1などいくつかの脳神経疾患に関与しています。DA は、さらにそれにより信号を伝達、どこに、前及びシナプス後膜の受容体を活性化、シナプスの間隙にシナプス前ニューロンから解放されます。リリース後シナプスの DA のレベルは、DAT3,10によって空間的そして一時的に制御されます。トランスポーター sequesters DA 細胞外スペースから、こうして生理 DA レベル3,11を支えます。マウスで DAT の遺伝的除去 hyperdopaminergic 表現はシナプスの DA レベルが上昇によって特徴付けられる細胞内 DA プール、10、12をシグナル伝達シナプスのドーパミンの深遠な変更の枯渇が発生します。
ここでは、2 つの別々 のプロトコルが表示される、メジャー ダ組織コンテンツと別のガブリエルら13によって記述された表面ビオチン化アッセイとダット複合機能を評価する方法の 1 つこれらの 2 つの方法は、DA に関する情報を提供DA の恒常性の完全な査定の DAT のコンテンツと機能のレベル。これらのメソッドで様々 な遺伝子改変マウスや疾患モデルの DA 恒常性を特徴とし、説明できます。これらのツールを実装して最適化されており、当社の研究所で標準使用。現在の試金は DAT14の C 末端を改変、チロシン水酸化酵素 (TH) プロモーター 5下 Cre リコンビナーゼを発現の DA の恒常性に与える影響を調査するため提供しています。

<table><tbody><tr><td>COMT阻害剤</td><td>シグマAldrich、ドイツ</td><td>RO-41-0960</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコル[</td></tr><tr><td>3H]-ドーパミン</td><td>Perkin-Elmerライフサイエンス、ボストン、マサチューセッツ州、米国</td><td>NET67-3001MC</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコルガラス</td></tr><tr><td>マイクロファイバーフィルターGF</td><td>/ C Whatman、GEヘルスケアライフサイエンス、バッキンガム</td><td>シャー1822-024</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコルHiSafeの場合</td></tr><tr><td>シンチレーション液</td><td>パーキンエルマー</td><td>1200-437</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイキット</td><td>サーモサイエンティフィック ピアス</td><td>23225</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>H3375</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ生命科学</td><td>S7903</td><td>シナプトソームDAの取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマの生命科学</td><td>S3014</td><td>シナプトソームDAの取り込みのプロトコル</td></tr><tr><td>KCl</td><td>のシグマの生命科学</td><td>P9541</td><td>シナプトソームDAの取り込みのプロトコル</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>メルクKGaA</td><td>10043-52-4</td><td>シナプトソームDAの取り込みのプロトコル</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>シグマの生命科学</td><td>63065</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>A0278</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>G7021</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>シナプトソームDA取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>デシプラミン</td><td>シグマAldrich</td><td>D3900</td><td>シナプトソームDA取り込み用プロトコル</td></tr><tr><td>ドーパミン</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>H8502</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>コカイン</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>C5776</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>脳マトリックス</td><td>ASI 機器</td><td>RBM2000C</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル</td></tr><tr><td>カファノ メカニカル テフロン ディスラプター</td><td>ブーフ &Holm</td><td>製造中止</td><td>シナプトソーム DA 取り込みプロトコル (均質化)</td></tr><tr><td>Antec Decade (アンペロメトリック検出器)</td><td>Antec、ライデン、オランダ</td><td>製造中止: 新モデル DECADE Elite / Lite&trade;電気化学検出器 タイプ 175 および 176</td><td>HPLC プロトコル用</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 &mu;mガラス</td><td>フィルターFrisenette ApS、デンマーク</td><td>13CP020AS</td><td>HPLCプロトコル</td></tr><tr><td>用カラム:Prodigy 3 &mu;ODS-3 C18</td><td>Phenomenex、YMC Europe、Chermbeck、Germany</td><td>部品番号:00A-3300-E0</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr><tr><td>LCソリューションソフトウェア</td><td>島津</td><td>製作所 LabSolutionsシリーズ ワークステーション</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr><tr><td>Perchlor acid 0.1M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500ml</td><td>HPLCプロトコル用(組織調製)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr><tr><td>ナトリウム二水素リンスファー</td><td>Bie&Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr><tr><td>ナトリウム1-オクタンスルホン酸一水和物</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>HPLCプロトコル</td></tr><tr><td>用 アセトニトリル、アイソクラティックHPLCグレード</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr><tr><td>Filtre 0.22um</td><td>Frisenette ApS、デンマーク</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>HPLCプロトコル用(組織調製)</td></tr><tr><td>オルトリン酸 85%</td><td>メルク</td><td>1.00563. 1000mlHPLC</td><td>プロトコル用</td></tr><tr><td>電極</td><td>Antec、ライデン、オランダ</td><td>AN1161300</td><td>HPLCプロトコル用(マニュアルオンラインを参照)</td></tr><tr><td>DECADE II電気化学検出器の検出器プログラム</td><td>Antec、ライデン、オランダ</td><td>Lite&trade;電気化学検出器タイプ175および176</td><td>HPLCプロトコル用</td></tr></tbody></table>

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

ドーパミン (DA) は、運動、報酬プロセスおよび認知機能の制御調節神経伝達物質です。(ドーパミン) ドーパミン作動性神経伝達の障害がパーキンソン病、注意欠陥・多動性障害、薬物中毒1,2 などいくつか中枢神経関連疾患に強く関連付けられて ,3,4。DA の不均衡を含む疾患のメカニズムの輪郭を描くが、病気の面を模倣する動物モデルに大きく依存してこうして DA 恒常性の特定の部分を評価プロトコルは知見と可能な治療を提供することが重要です。これらの疾患のためのターゲット。
今回 2 つの有用な実験的プロトコルを組み合わせるとマウスのドーパミン系の機能読み出しを提供します。DA の恒常性の生化学的, 機能的パラメーターは、DA のレベルとドーパミン トランスポーター (DAT) 機能5の評価を通じて取得されます。DA システムを調査するときは、確実に大人の頭脳から DA の内因性のレベルを測定する能力が不可欠です。したがって、我々 は DA のレベルを決定するマウスから脳組織に高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を実行する方法を提示します。背側線条体 (dStr) と側坐核 (NAc) から組織の実験を実施、他の DA 支配されている脳の領域に適していますまた。
DAT は DA のシナプス前終末に再取り込みのために不可欠にリリースされた DA の時空の活動を制御DA の恒常性を評価する際の主要な重要性はレベルと線条体で DAT の機能を知ることです。ここでは、表面レベルでシナプトソーム6 DA 取り込みアッセイを使用して関数情報を同時に推定することができますプロトコルを提供します。
標準免疫ブロット プロトコルと組み合わせて現在のメソッドは、ドーパミンのシステムを特徴づける関連ツールと研究者を提供します。

現在 DA 取り込みプロトコル (図 1) には、マウスから得たシナプトソームで DAT の機能を評価するために必要なすべての手順が含まれています。DA 吸収法 (図 2) の代表的なデータは、未調整のデータ (図 2 b) と飽和曲線を示しています、調整データ (図 2 a)。飽和曲線は、野生型マウスから摂取量を示しています。通常 1 つは DA 取り込み各遺伝子5の飽和曲線につながる変異マウスとの比較になります。その場合は、複数の要因によって 2A および 2B の野生型と変異マウスの違いを説明できます。徹底した実験者は差生 (2 b) とタンパク質調整 (2 a) データを描いた間があります、プロトコルのすべてのステップを次にです。The most 違いの明白な理由は i) 不正確な...

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

本プロトコルでは、2つの手法を紹介します。1つ目の目的は、シナプトソーム調製物からのドーパミン取り込み量を測定し、ドーパミントランスポーターの機能を評価することです。2つ目の目的は、HPLC分析によって組織内のドーパミン濃度を評価することです。これらの手法は、マウスにおけるドーパミンの組織含有量の測定方法およびドーパミントランスポーターの機能評価方法を示すことで、ドーパミン恒常性の重要なパラメータを提供します。これらの技術の主な利点は、ケモジェネティクスによる操作、in-vivoでの薬剤投与、あるいは動物の行動訓練などのin-vivo操作後に実施できる点にあります。HPLCの手順のデモンストレーションは、神経精神医学研究室の准教授であるPia Weikopが行います。この手順を開始するには、皮膚を切開し、余分な組織を除去して頭蓋骨を露出させます。次に、sutura sagittalisに沿って、前方まで頭蓋骨を切開します。ハサミの先端を眼窩に入れ、残りの頭蓋骨を切断して取り除きます。速やかに脳を取り出し、氷冷したPBSに入れる。その後、ブレインマトリックスを用いて、線条体の冠状断スライスを3 mmの厚さで切り出す。続いて、パンチを用いてさらに細かく分画する。その後、組織を1.5 mmのマイクロ遠心チューブに移して重量を測定します。次に、2つ目の脳についても同様の手順を繰り返します。両方の脳の重量が測定できたら、組織を1 mLの氷冷ホモジナイズ緩衝液を入れたガラスホモジナイザーに移します。その後、電動ペッスルを用いて組織をホモジナイズします。次に、ホモジナイズ物を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、ホモジナイズ用ガラスをさらに0.5 mLのホモジナイズバッファーで洗浄して、残ったホモジナイズ物を回収します。続いて、遠心分離により核と細胞残渣をペレット化します。次に、細胞膜と細胞質を含む上清を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで20分間遠心分離します。その後、細胞質を含む上清を捨て、粗シナプトソームを含むペレットをホモジナイズ緩衝液を用いて組織1 mgあたり40 µLで再懸濁します。このステップでは、指定した12本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに440 µLの取り込み緩衝液、リガンド、およびコカインを加え、残りの36本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに440 µLの取り込み緩衝液とリガンドを加えます。6本の2 mLマイクロ遠心チューブに、それぞれ10、5、2.5、1.25、0.62、0.31とラベルを貼ります。次に、数値の低い5本のマイクロ遠心チューブに、uptake bufferとリガンドを750 µLずつ加えます。続いて、「10」とラベルを貼ったチューブに、uptake bufferとリガンドを1,455.4 µL、非標識ドパミンを14.6 µL、およびトリチウム標識ドパミンを30 µL加えます。次に、10と表記されたチューブから混合液750 µLを5と表記されたチューブに分注します。よく混合し、このチューブから混合液750 µLを2.5と表記されたチューブに分注します。残りのチューブについても、同様に希釈を繰り返します。その後、ガラスマイクロファイバーフィルターを12ウェルフィルターバケットに設置し、4 mLの取り込みバッファーで予備洗浄します。続いて、440 µLのバッファーが入った最初の24本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに、シナプトソーム膜懸濁液を10 µLずつ加えます。注意深くボルテックスし、短時間遠心して、シナプトソームがバッファーに完全に浸っていることを確認します。次に、37 °Cで10分間静置します。10分後、最初の2列に10 µMおよび5 µMのドパミンを50 µLずつ添加し、37 °Cで5分間振盪しながら静置します。5分後、氷冷した uptake buffer を1 mL添加して反応を停止させます。同様の手順を2.5 µMおよび1.25 µM、さらに0.62 µMおよび0.31 µMについても繰り返します。あらかじめ洗浄したマイクロファイバーフィルターにサンプルを加え、氷冷したuptake buffer 4 mLで5回洗浄します。最初の12サンプルをフィルターに加えた後、フィルターをシンチレーションチューブに移します。次の12サンプルについても同様の操作を繰り返します。シンチレーションチューブ（49〜51番）の底にマイクロファイバーフィルターを配置し、その上に10 µMの最大ドパミンを25 µL添加して、3本の最大計数チューブを準備します。その後、51本のシンチレーションチューブすべてをドラフト内で1時間放置します。次に、各シンチレーションチューブに3 mLのシンチレーション液を加え、シェーカーで1時間激しく振盪します。ベータカウンターでトリチウム標識ドーパミンを1分間計測するには、プログラムを起動し、適切な設定を選択します。タンパク質定量の際は、標準的なBCAタンパク質定量キットを使用し、シナプトソームのタンパク質濃度を測定して調整を行うとともに、サンプル間での取り込み量を適切に比較します。組織調製では、各サンプルに均質化溶液を500 µL加え、ウルトラホモジナイザーを用いて最大速度で約30秒間、すべてのサンプルを均質化します。ホモジナイズ中は、サンプルを氷水に浸して保持します。次に、サンプルを4°C、14,000 ×gで30分間遠心分離します。その後、各サンプルから約200 µLを0.22 µmのガラスフィルターに移し、EC-HPLC法で分析します。検出器の設定は、出力を700 mVに、検出器オーブンの温度を32°Cに設定してください。バイアルをオートサンプラーにセットします。オンラインマニュアルを使用してレンジプログラムを作成し、表2に従ってタイムプログラムを追加します。プログラムを開いてシステムをセットアップします。次に、ユーザーIDとパスワードを入力してOKをクリックします。その後、プログラムが装置に接続されるまで待ちます。続いて、バッチテーブルに移動し、データ情報を入力します。「ファイル」メニューから「バッチファイルを名前を付けて保存」を選択し、「保存」をクリックしてファイルを保存します。続いて、「バッチ開始」を押して最初のサンプルを注入します。その後、「データ収集」に移動し、サンプルの分析が完了した際にクロマトグラムを確認します。次に、「LC post run analysis」に移動してファイル名を選択します。その後、「view」をクリックします。手動積分バーで積分するすべてのピークを追加し、「data report」に移動して読み出し結果をプリントアウトします。プログラムを検出器に追加した後、調製した標準物質を5、10、15 µL注入し、3点校正曲線を作成します。この図の代表的なデータは、野生型マウスのシナプトソーム調製物におけるドパミントランスポーターを介したドパミン取り込みの飽和曲線を示しています。黒い点は、4匹のマウスの個別の値です。緑色の曲線は、通常、1グループあたり4〜6匹のマウスから得られたデータをまとめてどのように描写するかを示しています。ここでは、サンプルの実際のタンパク質濃度で補正する前の、未加工データの飽和グラフを示します。このグラフは、取り込みデータからバックグラウンドを差し引くために使用される、コカイン含有サンプルのカウント数を示しています。このコントロールは、取り込みデータの信頼性を判断するために不可欠です。このヒストグラムはドーパミントランスポーターの取り込み能を示しており、ドーパミントランスポーターのKm値が0.1 ± 0.03 µMであることがわかります。これは、ドーパミントランスポーターのKm値を0.6〜1.2 µMとする回転ディスクボルタンメトリー法の結果とよく一致しています。シナプトソーム調製の手順を行う際は、シナプトソームを調製する間、常に組織を氷上に保持することが重要です。シナプトソームを用いたドーパミン取り込みアッセイに続き、ドーパミン取り込みの変動がドーパミントランスポーターの細胞表面発現の変化によるものであるかを確認するために、表面ビオチン化アッセイなどの追加手順を実施することができます。このビデオを視聴することで、線条体組織標本におけるドーパミントランスポーターの機能およびドーパミンレベルを解析し、マウスのドーパミン恒常性を調査する方法について十分に理解できるはずです。

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マウスの内側前脳束の片側6-OHDAの病変を行うためのプロトコルが記述されています。このメソッドは、線条体ドーパミンと90.63の&gt;...

パーキンソン病の単方向、病変6-OHDAモデルマウスの開発

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な...

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

このビデオは、マウスの脳から採取したシナプトソームにおけるドーパミン取り込みの評価を示しています。ドーパミントランスポーターを介したドーパミン取り込みのためのシナプトソームの調製、さまざまな濃度の放射性標識ドーパミンでシナプトソームを治療する手順、シナプトソームを単離する手順、およびドーパミン取り込みを定量化するための放射能の測定手順を概説します。...

放射性標識ドーパミンを用いたマウス脳シナプトソームのドーパミン取り込みの測定

一般的にパーキンソン病と運動障害では、高感度かつ信頼性のある行動アッセイは小説潜在治療をテストするために不可欠です。ここでは、黒質線条体系への損傷の程度の差に敏感と前臨床研究のために有用であるマウスのために感覚テストの管理可能なバッテリーを記述します。...

パーキンソン病のマウスモデルにおける感覚運動機能の評価

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

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当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定

3 つのモノアミン神経伝達物質の一斉分析や乳児の尿中代謝物の 2 つの (ECD) の電気化学検出高速液体クロマトグラフィー (HPLC) に結合する便利な固相抽出を提案する.脳障害の早期診断のための潜在的なバイオ マーカーとして代謝物 MHPG...

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

学ぶシナプトソームドーパミン取り込みとHPLC分析によるマウスドーパミン作動性恒常性の評価法。脳組織からドーパミン含量とトランスポーター機能を測定し、神経伝達動態の理解に貢献します。

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソームドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

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高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

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