Name: Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぼう、サイアログリカンマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのハイスループットプロファイリング方法。この技術は糖免疫学における抗体と疾患の関係解明に有用です。

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この研究は、イスラエル癌研究基金のResearch Career Development Award、Israeli National Nanotechnology Initiativeの助成金、Personalized Theranostics（VP-K）のNanomedicinesに関するFocal Technology AreaのHelmsley Charitable Trust、およびNational健康教育機関R01GM076360（XCへ）。

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<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

成功したグリカンマイクロアレイ作製には注意深い計画が必要であり、プロトコルにいくつかの重要なステップが含まれています。これらは、（1）すべての後続のパラメータ（ 例えば、距離、間隔、サンプルの量、および印刷）を定義ブロックおよびプレートのレイアウトを計画します。 （2）ピンの清掃およびピンの完全性の確保。これはスポットの均質性を制御するために重要である。 （3）印刷中に高湿度を維持する。これは、スポットの均質性を損なう可能性のある長い印刷ランの間に試料の蒸発を避けるために重要である。 （4）結果に影響を与え得る適切なアライメントおよび分析パラメータ（ 例えば、バックグラウンド減法、閾値、およびスポットサイズの柔軟性）を選択すること。 この方法は、特定の実験計画および目標を満たすようにさらに改変することができる。例えば、プリスポット番号は、アレイ上に印刷される各タイプの材料に適合するように変更することができる。ピン洗浄工程印刷物は、異なる印刷物に適合するように最適化することができ、短いまたは長い洗浄サイクルで行うことができる。さらに、ピンがディップ...

Siasは、脊椎動物の細胞表面糖タンパク質および糖脂質上のグリカン鎖を覆う酸性糖である。 SIA発現は、癌細胞1に変更し、進行および/または転移2,3と相関されます。哺乳類における主要なシアル酸の形の二つはNeu5Acで、そのヒドロキシル形、Neu5Gcを2です。ヒトは、CMAH酵素をコードする遺伝子の特異的不活性化のためにNeu5Gcを合成することができない。この非人間シアル酸は、代謝、食事のNeu5Gcが豊富な食品（ 例えば、赤肉）4、5から「自己」発信されたものとして、人間の細胞に組み込まれています。 Neu5Gcは、ヒト上皮および内皮の細胞表面上に低レベルで存在するが、特に癌腫に蓄積する。 Neu5Gcは、ヒト体液性免疫系2,6によって異物として認識されます。Neu5Gcグリカンの抗原複雑さは、すべての人間6における抗のNeu5Gc抗体応答の複雑さによって反射された、のNeu5Gc修正、結合、基礎となるグリカン及び足場、およびそれらの濃度を含む複数のレベルで生じ得ます。これらの抗体の一部は、癌腫バイオマーカーおよび潜在的な免疫療法剤として役立つ7 。異なるsialoglycans 8の化学酵素合成の出現は、グリカンマイクロアレイ技術9、10の使用によって容易にそのような抗体のより詳細な分析のために道を開きました。このように、天然および合成炭水化物の大きなライブラリーの促進準備と操作で、グリカンマイクロアレイは、生体分子10、11の無数と炭水化物の相互作用を調査するための強力なハイスループット技術となっています</sup&gt; 12、13。アレイ形式では、最小限の量の材料が使用され、生物学的に関連するグリカンのこの多価ディスプレイは、単一の実験において数千の結合相互作用の調査を可能にする。重要なことは、この技術はまた、バイオマーカー探索へと様々なサンプル7、12で免疫応答をモニタリングに適用することができます。 成功したグリカンマイクロアレイ作製には、プリンターロボットタイプ、グリカンコンジュゲーション化学、および検出光学系という3つの重要な側面を考慮する必要があります。印刷装置の考察に関しては、接触型および非接触型の2つの技術が利用可能である。接触印刷では、1〜48個のスチールピンを、グリカン溶液を含むマルチウエル源プレートに浸漬し、ガラススライド表面に直接接触させることにより官能化ガラススライド上にスポットする。解の量deスライドに生きているのは、スライド表面上の持続時間の関数である。通常、試料はスライド表面に印刷される前にガラスブロック上に先ず予めスポットされ（均質なスポットに到達する）。非接触プリンタ（ 例えば、圧電式プリンタ）では、制御された電気信号を用いてグリカンをガラスキャピラリから印刷する。電気信号は、接触印刷に比べてより正確な印刷を達成するために細かく較正することができる。スポットのサイズおよび形態も比較的均一である。さらなる利点は、印刷後にサンプルをソースプレートに再循環させることである。それにもかかわらず、ピエゾ電子式プリンタの主な欠点は、印刷チップの制限（4または8）であり、スライドの安定性、温度、湿度およびサンプルの蒸発に特に注意する必要がある非常に長い印刷時間をもたらす。非接触型インクジェットプリンタは、より大きなサンプル体積14を必要とする。 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt;印刷法の利用可能なオプションが限られているのに対して、グリカン結合化学はより複雑な選択肢であり、選択肢は数多くあります。選択された固定化化学は、グリカン上の活性基および摺動表面反応性の両方を考慮しなければならない。特定のマイクロアレイ表面上に固定化されるグリカンは、合成的に合成されるかまたは天然に単離されるかのいずれも、同一の反応基を必要とする。さらに、グリカンは純粋で均質である必要があります。一方、固定化表面および化学物質は、再現性および信頼性のある付着密度を提供すべきである。複数の固定化方法は、共有結合または非共有結合（物理吸着）アタッチメント10、11、12、13のいずれかを用いて開発されてきました。 Uninitiateのための印刷されたグリカンマイクロアレイ技術に関する詳細な情報についてはDの研究者は、これらの優れたレビューは13、15を参照してください。重要なのは、グライコミクス実験（MIRAGE）イニシアチブのための最近の最低限必要な情報は、サンプル調製16のためにと、この成長分野で基準を改善するために17を解析し、糖鎖マイクロアレイからのデータを報告するためのガイドラインを説明します。 ここでは、特定の接触ナノプリンターを用いて16ウェルフォーマットでシアログリカンマイクロアレイを作製するための詳細なプロトコールについて説明する。各グリカンは、エポキシ活性化ガラススライドへのそれらの共有結合を媒介する第一級アミンを有する。我々はまた、様々なヒト血清サンプル、抗体、およびSia結合性植物レクチンを用いた1つのスライドの開発および分析について記載する。 Sialoglycanマイクロアレイアッセイは、アレイ作製、プロセシング、展開、および分析を含むいくつかの主要なステップを含む。アレイの製造には、arグリカンおよびソースプレートの準備、ナノプリンターのプログラミング、およびスライドの印刷を行うことができます。続いて、スライドを処理し、開発し、分析する（ 図1 ）。

<table><tbody><tr><td>第一級アミン含有シアログライカン</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>化合物のご要望 info@glycohubusa.com</td><td>印刷された糖鎖</td></tr><tr><td>リン酸一ナトリウム 一水和物</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>印刷用緩衝液成分</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム 七水和物</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>印刷用緩衝液成分</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>印刷用緩衝液/インキュベーション/洗浄用緩衝液</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>スライドブロッキング試薬</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>印刷用緩衝剤</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>0700/08</td><td>スライドブロッキング試薬</td></tr><tr><td>オボアルブミン(グレードV)</td><td>Σ</td><td>A5503</td><td>スライドブロッキングタンパク質</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>スライド洗浄洗剤</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker on array</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, 全分子</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>印刷成分</td></tr><tr><td>ビオチン化-SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>植物レクチン &ndash; 結合Sia-alpha2&ndash;6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant Lectin &ndash; 結合Sia-α2&ndash;3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>一次検出</td></tr><tr><td>Cy3-ストレプトアビジン</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>ビオチン結合</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>ヒトIgGに対する二次検出</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY Jackson</td><td>Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>二次ニワトリに対する検出 IgY</td></tr><tr><td>ヒト血清サンプル</td><td>イスラエル血液銀行</td><td></td><td>一次検出</td></tr><tr><td>圧縮窒素 (グレード5)</td><td></td><td></td> <td>一般的なダスティング/乾燥ツール</td></tr><tr><td>エポキシコーティングスライド</td><td>コーニング</td><td>40044</td><td>スライド</td></tr><tr><td>エポキシコーティングスライド</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>スライド。このタイプのスライドでは、表面は(コアリングスライドと比較して)より疎水性であるため、100 μ を得るためには、glycans Print Buffer に 0.005% Tween-20 を添加する必要があります。Mサイズのスポット。</td></tr><tr><td>384ウェルマイクロタイタープレート</td><td>Genetix</td><td>2070</td>印刷<td>プレート</td></tr><tr><td>VWRラボ</td><td>マーカーVWR</td><td>52877-310</td><td>スライドラベリング</td></tr><tr><td>染色チューブ</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>スライド現像</td></tr><tr><td>ツール 染色浴</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>スライド現像ツール</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>ホルダーVWR</td><td>631-9321</td><td>スライド現像ツール</td></tr><tr><td>GenePixスキャナー</td><td>分子デバイス</td><td>4000B</td><td>スライドスキャナー</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>アレイプリンター</td></tr><tr><td>ピン</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>印刷ピン</td></tr><tr><td>ProPlate モジュール</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>スライド現像モジュール</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>バイオラボ</td><td>2321020500</td><td>アレイと加湿器に必要</td></tr><tr><td>電子マルチピペット、8チャンネル、ボリューム範囲2-125 &mu;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(マトリックス)</td><td>MA-2131 Impact2 イコライザー 384</td><td>マルチピペット 384ウェルプレートへのサンプルディスパン用</td></tr></tbody></table>

sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗neu5gc iggのプロファイリング

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

細胞は、癌で一般的に変化し、シアル酸（Sia）発現の変化を含む炭水化物鎖（グリカン）の外皮で覆われている。これらは、9炭素骨格を有し、細胞表面上の脊椎動物グリカンをキャップする酸性糖である。哺乳動物の主要な2つのSia型は、 N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびそのヒドロキシル化形態であるN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）である。ヒトは、シチジン5 &#39;モノホスフェート-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）ヒドロキシラーゼ（CMAH）をコードする遺伝子の不活性化のために、内因性Neu5Gcを産生することができない。外部Neu5Gcは、赤肉および乳製品の食物摂取を通じてヒト細胞によって獲得され、その後、細胞表面上の多様なグリカンに現れ、主に癌腫に蓄積する。結果として、ヒトは、癌および他の慢性炎症媒介性疾患において多様な役割を果たす循環型抗Neu5Gc抗体を有し、潜在的な診断および治療の可能性になっているラッツ。ここでは、ヒト血清中のそのような抗Neu5Gc抗体を評価するためのハイスループットのシアログリカンマイクロアレイアッセイを記載する。 Neu5Gc含有グリカンおよびそれらの対応する対の対照（Neu5Ac含有グリカン）は、それぞれコア第一アミンを有し、エポキシ被覆ガラススライドに共有結合される。我々は、1プリントあたり最大896個のアレイを生成することができる特定のナノプリンタを用いて、16ウェルフォーマットで56枚のスライドを印刷することを例示する。各スライドを使用して、抗Neu5Gc抗体特異性、強度および多様性の評価のための16の異なるヒト血清サンプルをスクリーニングすることができる。プロトコルは、この堅牢なツールの複雑さを記述し、配列形式で多様な臨床サンプルでNeu5Gc食物炭水化物抗原への応答を調査することを目指しているもののための基本的なガイドラインを提供します。

アレイ印刷、開発、分析： 複数のグリカンサンプルおよびヒトIgG STD曲線を含む16個の異なるブロックにシアログリカンマイクロアレイを印刷するには、スライドごとに16個のブロックすべてと同じ印刷操作ですべてのスライドにできるだけ均一にすべてのサンプルを印刷するための徹底的な較正が必要です。したがって、特定の印刷パラメータが決定される前に、384ウェルプレート中のサンプル体積、スライドタイプおよび製造、384ウェルプレートタイプ、湿度レベル、サンプル体積あらゆるタイプのサンプル、ヒトIgG STD曲線濃度、およびマーカータイプについての印刷。このような印刷されたシアログリカンアレイスライドの耐久性は、室温で暗所で真空密閉ボックス中で最大10ヶ月間持続することが立証された。あらゆる印刷実験において、均一性はさらにSia結合レクチンおよび抗体を用いた品質管理実験によってモニタリングおよび検証された。開発およびスキャニングのプロトコルは、同じ印刷作業のスライド内お...

シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

sialoglycanマイクロアレイアッセイの全体的な目標は、ヒト血清中の抗Neu5Gc IgGを、多様なシアログリカンのコレクションに対してハイスループットで評価することです。この方法は、抗Neu5Gc抗体ががん、心臓病、異種移植などのさまざまなヒト疾患にどのように関与しているかなど、糖鎖免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無数のシアログリカン抗原に対する抗Neu5Gc抗体のハイスループットプロファイリングが可能になることです。その手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生であるSharon Yehudaです。アレイの製造とレイアウトを慎重かつ詳細に計画することは、成功を確実にするために重要です。このプロセスについては、テキスト プロトコルと補足情報で詳しく説明されています。各糖鎖を 100 マイクロモルに希釈し、総量 100 マイクロリットルの糖鎖プリンティングバッファーを微量遠心チューブに入れます。次に、マーカーバッファーを用いて、蛍光色素を含む第一級アミンを1mm/mmに調製します。次に、総容量1ミリリットルで1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈します。テキストプロトコルに記載されているように、ヒトIgG標準曲線希釈液を調製します。384ウェルプレートを氷の上に置きます。電子マルチピペットを使用して、テキストプロトコルに見られるプレートレイアウトに従って、各糖鎖、マーカー、およびスターダード曲線IgGの7マイクロリットルを分注します。プレートをパラフィルムで覆い、gの250倍、摂氏12度で2分間回転させます。印刷は、湿度が60〜70%のほこりのない場所で行う必要がありますここでは、すべてのステップは、保護のための適切な手袋と衣服を備えたクリーンルームで実行されます。nanoプリンターマシンと加湿器の電源を入れます。テキストプロトコルで説明されているように印刷機をプログラミングした後、分注されたサンプルが入った384ウェルプレートをアレイデッキ上の位置に配置し、パラフィルムカバーを取り外します。この時点で、印刷を開始します。アルコール溶剤耐性のマーキングペンでスライドに番号を付け、暗所で真空密封された箱に保管します。アレイを処理するには、まず真空密封されたボックスからスライドを取り出し、アレイを上にして化学フードに5分間置き、余分な液体を蒸発させます。次に、脱イオン水で満たされた染色チューブにスライドを入れて水和させます。チューブをホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら5分間インキュベートします。スライド上の反応性エポキシ基をブロックするには、予熱したエタノールアミンブロッキング溶液で満たされた50ミリリットルの染色チューブにスライドを浸します。チューブをホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振と

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。...

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

このビデオでは、マウス血清中の循環抗糖鎖抗体を解析するためのプリンテッド糖鎖アレイ技術を実演しています。血清中の抗体はチップ上の特定の糖鎖と相互作用し、免疫染色とそれに続く蛍光スキャンによって確認されます。...

プリンテッド糖鎖アレイによる循環型抗糖鎖抗体の検出

印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。...

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。...

IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

酸化アルミニウム コーティング ガラスに添付ファイルのN型糖鎖の合成にモジュラー アプローチは、糖鎖マイクロ アレイを開発し、広く中和抗体、HIV のプロファイリングの使用が示されている (ACG スライド)...

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

この作品は、小動物の反炭水化物抗体の解析のための印刷された糖鎖アレイ (PGA)...

印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術

我々は、異なるウイルス株から250以上の抗原に対して複数の抗体アイソタイプの血清を同時にプローブするために、ニトロセルロースコーティングされたスライドにインフルエンザ抗原を印刷することによって構築されたタンパク質マイクロアレイを使用するためのプロトコルを提示し、したがって、ウイルスサブタイプ間の血清抗体の幅の測定を可能にする。...

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG...

超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

抗体のグリコシル化パターンは、その臨床的性能を決定し、したがって、グリコシル化を制御するための産業的および学術的努力は持続する。典型的な糖工学キャンペーンは時間と労力を要するため、一過性サイレンシングを使用してグリコシル化遺伝子の影響を特徴付けるための迅速なプロトコルの生成が有用であることが証明されるであろう。...

チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

マイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)は、生体サンプル中の糖鎖の組成分析のためのハイスループット技術です。...

ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

学ぼう、サイアログリカンマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのハイスループットプロファイリング方法。この技術は糖免疫学における抗体と疾患の関係解明に有用です。

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

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