Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

sialoglycanマイクロアレイアッセイの全体的な目標は、ヒト血清中の抗Neu5Gc IgGを、多様なシアログリカンのコレクションに対してハイスループットで評価することです。この方法は、抗Neu5Gc抗体ががん、心臓病、異種移植などのさまざまなヒト疾患にどのように関与しているかなど、糖鎖免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、無数のシアログリカン抗原に対する抗Neu5Gc抗体のハイスループットプロファイリングが可能になることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生であるSharon Yehudaです。アレイの製造とレイアウトを慎重かつ詳細に計画することは、成功を確実にするために重要です。このプロセスについては、テキスト プロトコルと補足情報で詳しく説明されています。

各糖鎖を 100 マイクロモルに希釈し、総量 100 マイクロリットルの糖鎖プリンティングバッファーを微量遠心チューブに入れます。次に、マーカーバッファーを用いて、蛍光色素を含む第一級アミンを1mm/mmに調製します。次に、総容量1ミリリットルで1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈します。

テキストプロトコルに記載されているように、ヒトIgG標準曲線希釈液を調製します。384ウェルプレートを氷の上に置きます。電子マルチピペットを使用して、テキストプロトコルに見られるプレートレイアウトに従って、各糖鎖、マーカー、およびスターダード曲線IgGの7マイクロリットルを分注します。

プレートをパラフィルムで覆い、gの250倍、摂氏12度で2分間回転させます。印刷は、湿度が60〜70%のほこりのない場所で行う必要がありますここでは、すべてのステップは、保護のための適切な手袋と衣服を備えたクリーンルームで実行されます。nanoプリンターマシンと加湿器の電源を入れます。

テキストプロトコルで説明されているように印刷機をプログラミングした後、分注されたサンプルが入った384ウェルプレートをアレイデッキ上の位置に配置し、パラフィルムカバーを取り外します。この時点で、印刷を開始します。アルコール溶剤耐性のマーキングペンでスライドに番号を付け、暗所で真空密封された箱に保管します。

アレイを処理するには、まず真空密封されたボックスからスライドを取り出し、アレイを上にして化学フードに5分間置き、余分な液体を蒸発させます。次に、脱イオン水で満たされた染色チューブにスライドを入れて水和させます。チューブをホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら5分間インキュベートします。

スライド上の反応性エポキシ基をブロックするには、予熱したエタノールアミンブロッキング溶液で満たされた50ミリリットルの染色チューブにスライドを浸します。チューブをホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら30分間インキュベートします。エタノールアミンブロッキング溶液を適切なバイオハザードゴミ箱に捨てます。

次に、スライドを摂氏50度の脱イオン水で満たされた新しい清潔な染色チューブに入れます。チューブをホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら10分間インキュベートします。水を捨て、スライドをガラス染色ホルダーに移します。

装置をスイングプレートホルダーに入れ、スライドを遠心分離して乾かします。次に、スライドを16ウェルの仕切りに置きます。ウェルを事前に湿潤させた後、マルチピペットを使用して200マイクロリットルのPBSTをスライドウェルに分注します。

次に、蓋付きの湿気の多いチャンバーに入れ、5分間振とうします。清潔なペーパータオルをフリックして軽くたたいて、PBSTを取り外します。次に、200マイクロリットルのPBS-オボアルブミンブロッキングバッファーを各ウェルに分注します。

スライドを湿ったチャンバーに入れ、室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、テキストプロトコルに記載されているようにPBS-OVAブロッキングバッファーで希釈した一次検出を準備します。PBS-OVAブロッキングバッファーをスライドからはじき出し、ウェルあたり200マイクロリットルの一次抗体を添加します。

スライドを湿ったチャンバーで2時間インキュベートします。次に、一次検出をスライドからフリックし、PBSTで3回洗浄します。スライドをPBSTで湿潤チャンバー内で5分間インキュベートしてから、最終的にPBSTで洗浄します。

その後、PBSで一度洗います。次に、テキストプロトコールに記載されているように、PBSで二次抗体を調製します。PBSをスライドからはじき出し、200マイクロリットルの二次抗体を加えます。

二次抗体をスライドからはじき、前回と同様にPBSTで4回洗浄します。フレームを慎重に取り外し、PBSを充填した50ミリリットルのスライド染色チューブにスライドを入れ、5分間振とうします。次に、2つのスライド染色浴に脱イオン水を入れます。

スライドをスライドホルダーに入れ、スライドを最初のバスに浸します。スライドをすばやく10回浸します。次に、スライドを2番目のバスに移し、さらに10回浸します。

浸漬後、スライドを室温で10分間振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、水を捨て、スライドをガラス製ステインホルダーに移します。ガラス染色ホルダーをスイングプレートホルダーに入れ、スライドを遠心分離して乾かします。

スキャナーのドアを開き、スライドを内側に置き、アレイを下に向けて配置します。この時点で、スキャンを開始します。スキャンしたスライドをTIFFファイルとして保存します。

分析用のスライドを準備するには、[Load Array List] を選択し、スライド上の各ブロックの配列をマッピングする適切な GAL ファイルをアップロードします。スライドは、各ブロックに1つずつ、16の異なる一次検出部分で開発されました。植物レクチンSNAは、a2-6結合シアル酸に結合します。

一方、植物Lectin MALIIはa2-3結合シアル酸に結合します。ポリクローナル抗Neu5Gc IgYは、Neu5Gc含有シアログライカンには結合しますが、Neu5Ac含有シアログ糖鎖には結合しません。抗Neu5Gc IgGをプロファイリングするために、健康なヒトドナー由来の12の血清を印刷されたシアログリカンマイクロアレイで分析し、蛍光標識された抗ヒトIgGをナノグラム/マイクロリットルに正規化して開発しました。

試験したすべてのヒト血清には、さまざまなレベルの抗Neu5Gc IgGが含まれていましたが、Neu5Ac含有シアログリカンの一致したペアはほとんど認識されませんでした。さらに、抗Neu5Gc IgG認識パターンは、これら12の異なる血清間で、強度と多様性の両面で非常に多様です。このビデオを見れば、糖鎖マイクロアレイシステムを使用して、さまざまなヒトサンプル中の抗Neu5Gc抗体をハイスループットでプロファイリングする方法を十分に理解できるはずです。