Biocontainmentにおけるウイルスサンプルの陰性染色のためのカプセルの利用

この手法の全体的な目的は、バイオコンテインメント内でのウイルス検体に対する、簡便かつ効果的なTEM陰性染色手順を提供することです。本手法は、研究対象であるウイルスの形態や構造に関するウイルス学上の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、バイオコンテインメント環境内において電子顕微鏡グリッドを容易かつ効果的に取り扱えることです。この技術は、あらゆる環境のウイルス検体に容易に適用できるため、未知のウイルスのTEM診断の一環として有用です。主にウイルスのTEM研究を支援するために本手法を用いてきましたが、適用範囲はより広く、ほとんどのナノ粒子のEM調査に使用することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、カプセルへのグリッドの装填および取り出し時にグリッドを損傷させないようにするまで、ある程度の練習が必要となるため、習得に苦労する場合があります。

この手法を着想したのは、バイオコンテインメント施設内で小さなEMグリッドを扱う際に困難が生じたときでした。

この手順を開始するために、Formvarおよびカーボンコーティング済みのTEM用銅グリッドを準備または購入します。コーティング済みTEMグリッドをカプセルに挿入します。次に、充填したカプセルを他の備品および試薬とともにバイオコンテインメントへ移動します。まず、カプセルをピペットに取り付けます。40 µLのウイルス懸濁液をカプセル内に吸引します。グリッドを水平にした状態で、ピペットを横向きに10分間置きます。次に、ピペットを持ち上げ、ウイルス溶液を廃棄容器に排出します。2%グルタラールデヒド固定液40 µLをカプセル内に吸引します。ピペットを横向きに20分間置きます。その後、固定液を排出し、固定液を洗い流すために脱イオン水40 µLをカプセル内に吸引します。この洗浄工程を3回繰り返します。

次に、1% 酢酸ウラニルまたは 1% 燐タングステンのいずれかを 40 µL、カプセル内に吸引します。そのまま 30 秒間静置した後、ピペットからカプセルを取り出します。

フィルターペーパーをグリッドの端に軽く触れさせ、水分を吸い取ります。フィルターペーパーを15 millilitersの遠心チューブに移します。次に、フィルターペーパーを1%四酸化オスミウム溶液に浸します。

蓋を開いた状態のカプセルをチューブに入れます。四酸化オスミウムの蒸気を完全に浸透させるため、チューブを密封して1時間置きます。その後、チューブを除染し、バイオコンテインメントからBSL-2の電子顕微鏡（EM）施設へ移動させます。

遠心チューブからカプセルを取り出し、ピペットの上に置きます。カプセルに 40 µL の脱イオン水を吸引し、その後、その水を廃棄容器に排出します。この水洗浄を3回繰り返します。

次に、ピペットからカプセルを取り除きます。フィルターペーパーを用いて、グリッドの水分を吸い取ります。グリッドを風乾させ、TEMイメージングを行うまでグリッドボックスに保管してください。

まず、ウイルス懸濁液と同量の4%グルタルアルデヒドを混合し、最終濃度を2%グルタルアルデヒドにします。固定剤を用いて、ウイルスを少なくとも24時間不活化させます。チューブを汚染除去し、BLS-2 EM施設へ転送します。その後、グリッドをロードしたキャプチャーをピペットに取り付けます。混合物をカプセル内に吸引します。ピペットを横にし、グリッドを水平にした状態で10分間静置します。

次に、ピペットを持ち、ウイルス混合液を廃棄容器に排出します。40 µLの脱イオン水をカプセル内に吸引し、その後、その水を廃棄容器に捨てます。この洗浄操作を3回繰り返します。

その後、1% UAまたは1% PTAを40 µL、カプセル内に30秒間吸引します。ピペットからカプセルを取り出します。フィルターペーパーを使用して、グリッドの水分を吸い取ります。

その後、グリッドを風乾させます。

本研究では、手動ドロップ法とカプセル法の両方を用いて、Zaire Ebola virusサンプルのネガティブ染色を行います。これらの方法から得られたTEM画像は、いずれも明確な詳細を示しており、ビリオンの中心にあるヌクレオカプシド構造と表面の糖タンパク質が観察されます。したがって、カプセル法により、手動ドロップ法と同等の品質のTEM画像を得ることが可能です。次に、Chikungunya virusを用いて、異なるサンプル不活化方法を比較します。サンプルの不活化は、2%glutaraldehydeで20分間処理した後に1%osmium tetroxideに1時間さらす急速法か、あるいは2%glutaraldehydeで24時間処理する一晩法のいずれかで行います。このように、osmium tetroxideを用いない長時間の不活化プロセスの方が、より詳細な超微細構造を観察できることが分かります。

次に、カプセル法を用いて、アルデヒド固定したウイルス様粒子により2種類の染色剤を比較しました。酢酸ウラニルとホスホタングステンの両方が高品質な結果を示し、境界が明確で糖タンパク質が視認できました。

この手法に習熟すれば、サンプル数に応じて約1時間半で完了できます。この手順を行う際は、実験目的に合わせて適切な固定液および染色試薬を選択することが重要です。本手順に続き、粒子計数などの他の手法を実施することで、ウイルス濃度を算出し、さらなる疑問を明らかにすることが可能です。

本手法により、ウイルス研究者はウイルスの形態および構造情報をより容易に探索できるようになります。これは特にBSL-3および4レベルのウイルスにおいて有効です。このビデオを視聴することで、バイオコンテインメント内でのネガティブ染色用TEMグリッドの簡便な取り扱い方法について十分に理解できるはずです。アルデヒド、四酸化オスミウム、および酢酸ウラニルを扱う作業は極めて危険であるため、本手順の実施に際しては、適切な個人用保護具の使用や化学薬品用フードの使用などの予防策を常に講じてください。